張夢如 高燕 楊彩紅 趙承孝 馮秀娥 李青山

關(guān)鍵詞多酚化合物;2，4′，5′-三羥基-5，2′-二溴二苯甲酮;血管環(huán);舒張作用;鉀通道;鈣通道

高血壓的全球發(fā)病率逐年升高，長期高血壓會導(dǎo)致多種并發(fā)癥。高血壓病程的進展，可誘發(fā)冠狀動脈粥樣硬化，造成心臟損傷，嚴(yán)重威脅人類健康[1]。高血壓發(fā)病后會出現(xiàn)血管張力異常。主動脈平滑肌的舒張對高血壓的治療尤為關(guān)鍵，諸多有效的高血壓治療藥物最終都會直接或間接地引起血管舒張效應(yīng)[1-2]。

海洋來源的多酚化合物具有抗炎、抗氧化、細(xì)胞毒、抑菌等多重生物活性[3-6]，是海洋生物研究過程中發(fā)現(xiàn)的一類新型化合物。本課題組前期以海洋來源的鹵酚化合物為先導(dǎo)化合物進行了結(jié)構(gòu)優(yōu)化和修飾，合成了系列多酚化合物。其中2，4′，5′-三羥基-5，2′-二溴二苯甲酮（LM49）具有顯著的保護血管內(nèi)皮細(xì)胞[7-8]、抗動脈粥樣硬化[9]、保護缺血再灌注引發(fā)的心肌損傷[10]等藥理作用，提示其對于高血壓及心血管疾病的治療具有重要研究價值。鑒于此，本研究選擇本課題組前期獲得的高活性多酚化合物L(fēng)M49 為研究對象，考察其對大鼠離體胸主動脈的舒張作用，并進一步研究其作用機制，以期為LM49用于心腦血管疾病的治療提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

SV-8 型離體組織器官恒溫灌流裝置購自成都泰盟軟件有限公司;MLT0201/D 型高靈敏度張力傳感器、PowerLab 數(shù)據(jù)采集分析系統(tǒng)購自埃德儀器國際貿(mào)易（上海）有限公司。

1.2 主要藥品與試劑

多酚化合物L(fēng)M49（批號20190315，純度≥99%）為本課題組自制;乙二醇雙（2-氨基乙基醚）四乙酸（EGTA，批號E8050）購自北京索萊寶科技有限公司;羥乙基哌嗪乙硫磺酸（HEPES，批號H7523，純度≥99%）、去甲腎上腺素原料藥（批號SML0305，純度≥97%）、乙酰膽堿原料藥（批號A6625，純度≥99%）、左旋硝基精氨酸甲酯原料藥（L-nitro-arginine methyleste，L-NAME，批號N5751，純度≥98%）、吲哚美辛原料藥（批號I7378，純度≥98%）、四乙基胺（批號T0886，純度≥99%）、4-氨基吡啶（批號A78403，純度≥98%）、格列苯脲原料藥（批號Y0001511，純度≥99%）、BaCl2（批號202738，純度≥99%）、硝苯地平原料藥（批號N7634，純度≥98%）、維拉帕米原料藥（批號V4629，純度≥99%）、毒胡蘿卜素原料藥（批號T9033，純度≥98%）均購自德國Sigma 公司;其余試劑均為分析純，水為雙蒸水。

1.3 動物

本研究所用動物為健康SPF級SD大鼠，共80 只，雄性，體質(zhì)量為250～300 g，由山西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，實驗動物使用許可證號為SYXK（晉）2019-0004。將大鼠分籠飼養(yǎng)（每籠3 只），飼養(yǎng)環(huán)境溫度為（22±2）℃、相對濕度為40%～60%。飼養(yǎng)期間大鼠正常攝食和飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d 后進行實驗。本研究經(jīng)山西醫(yī)科大學(xué)實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)后實施，批準(zhǔn)號為SYDL2021001。

2 方法

2.1 大鼠胸主動脈血管環(huán)的制備及處理

2.1.1 內(nèi)皮完整血管環(huán)將大鼠麻醉后，脫臼處死，取其主動脈，放入4 ℃預(yù)冷的生理鹽溶液（含144 mmol/LNaCl、5.8 mmol/L KCl、1.2 mmol/L MgCl2、2.5 mmol/LCaCl2、11.1 mmol/L 葡萄糖、5 mmol/L HEPES，pH=7.4）中充分分離。將分離干凈的血管剪成3～4 mm的分段血管環(huán)，置于37 ℃充氧的10 mL浴槽中。將血管環(huán)的下端固定，上端連接張力傳感器，采用PowerLab 數(shù)據(jù)采集分析系統(tǒng)記錄血管環(huán)的張力變化。將基礎(chǔ)張力調(diào)至2 g，浴槽內(nèi)每間隔15 min 換1 次生理鹽溶液，平衡穩(wěn)定1 h。然后采用PowerLab 數(shù)據(jù)采集分析系統(tǒng)記錄血管環(huán)的張力，即為血管環(huán)基礎(chǔ)張力。

2.1.2 去內(nèi)皮血管環(huán)取“2.1.1”項下分離的干凈血管環(huán)，使用與主動脈內(nèi)徑相當(dāng)?shù)拿薨舸┤胙軆?nèi)摩擦其內(nèi)壁2 次，以求完全去除血管內(nèi)皮。用KCl（60 mmol/L）生理鹽溶液（含89.8 mmol/L NaCl、60 mmol/L KCl、1.2mmol/L MgCl2、2.5 mmol/L CaCl2、11.1 mmol/L 葡萄糖、5 mmol/L HEPES，pH=7.4）預(yù)收縮血管環(huán)2 次，以誘發(fā)血管環(huán)的最大收縮幅度。待其穩(wěn)定達到坪值后（連續(xù)2次同樣刺激所引起血管環(huán)的收縮幅度的差別小于5%），加入去甲腎上腺素（1×10-6 mol/L）使血管環(huán)收縮。待血管張力穩(wěn)定后，加入乙酰膽堿（1×10-5 mol/L）檢查血管環(huán)的內(nèi)皮是否完整。以去甲腎上腺素刺激血管環(huán)收縮后的穩(wěn)定張力為100%，計算乙酰膽堿引起血管環(huán)舒張的百分比：舒張血管百分比（%）=（去甲腎上腺素誘發(fā)的血管環(huán)最大收縮張力-加入乙酰膽堿后血管環(huán)張力）/（去甲腎上腺素誘發(fā)的血管環(huán)最大收縮張力-去甲腎上腺素誘發(fā)前血管環(huán)張力）×100%。該百分比值>70%視為內(nèi)皮完整，<5%視為內(nèi)皮去除完全[11]。待內(nèi)皮功能檢測完，更換生理鹽溶液使血管環(huán)恢復(fù)至基礎(chǔ)狀態(tài)，然后采用PowerLab 數(shù)據(jù)采集分析系統(tǒng)記錄血管環(huán)的張力，即為血管環(huán)基礎(chǔ)張力。

2.2 LM49對大鼠血管環(huán)的舒張作用

取“2.1.1”項下內(nèi)皮完整血管環(huán)，加入去甲腎上腺素（1×10-6 mol/L）刺激，使其收縮。待其張力穩(wěn)定后，分為LM49 給藥組和硝苯地平陽性對照組，按累積加藥法每隔10 min加入藥物，使LM49的終濃度為3×10-7、1×10-6、3×10-6、5×10-6、1×10-5 mol/L[溶劑二甲基亞砜（DMSO）的體積分?jǐn)?shù)分別為0.000 3% 、0.001% 、0.003% 、0.005%、0.01%]，硝苯地平的終濃度為1×10-10、3×10-10、1×10-9、3×10-9、1×10-8、3×10-8、1×10-7、3×10-7、1×10-6mol/L[12]。將血管環(huán)與張力換能器連接，采用PowerLab數(shù)據(jù)采集分析系統(tǒng)記錄血管環(huán)的張力變化，并計算藥物舒張血管百分比：藥物舒張血管百分比（%）=（去甲腎上腺素誘發(fā)的血管環(huán)最大收縮張力-給藥后血管環(huán)張力）/（去甲腎上腺素誘發(fā)的血管環(huán)最大收縮張力-血管環(huán)基礎(chǔ)張力）×100%。每組平行考察6個血管環(huán)。

2.3 LM49對內(nèi)皮完整和去內(nèi)皮血管環(huán)張力的影響

取“2.1”項下內(nèi)皮完整血管環(huán)和去內(nèi)皮血管環(huán)，分別加入去甲腎上腺素（1×10-6 mol/L）或KCl（60 mmol/L）生理鹽溶液刺激，使其收縮。待血管環(huán)張力穩(wěn)定后，分為LM49 給藥組和溶劑對照組（加入相應(yīng)體積分?jǐn)?shù)的DMSO），按照“2.2”項下方法給藥。分別測定各組血管環(huán)的張力，并計算LM49 舒張血管百分比：LM49 舒張血管百分比（%）=（去甲腎上腺素或KCl 誘發(fā)的血管環(huán)最大收縮張力-給予LM49 后血管環(huán)張力）/（去甲腎上腺素或KCl 誘發(fā)的血管環(huán)最大收縮張力-血管環(huán)基礎(chǔ)張力）×100%。每組平行考察6個血管環(huán)。

2.4 L-NAME和吲哚美辛對LM49 舒張血管環(huán)作用的影響

取“2.1.1”項下內(nèi)皮完整血管環(huán)，分別用一氧化氮合酶抑制劑L-NAME（0.1 mmol/L）或環(huán)氧合酶抑制劑吲哚美辛（1×10-5 mol/L）預(yù)孵育20 min，作為L-NAME 預(yù)孵育組、吲哚美辛預(yù)孵育組;另設(shè)LM49 對照組，不加入L-NAME 或吲哚美辛預(yù)孵育。隨后各組均加入去甲腎上腺素（1×10-6 mol/L）刺激血管環(huán)，使其收縮，記錄其張力變化。待血管環(huán)張力穩(wěn)定后，各組均按照“2.2”項下方法累積加入LM49，分別測定各組血管環(huán)的張力，并計算LM49 舒張血管百分比，分析L-NAME 和吲哚美辛對LM49 舒張血管環(huán)作用的影響。每組平行考察6 個血管環(huán)。

2.5 鉀通道阻滯劑對LM49 舒張血管環(huán)作用的影響

取“2.1.1”項下內(nèi)皮完整血管環(huán)，分別加入4 種鉀通道阻滯劑——四乙基胺（5 mmol/L）、格列苯脲（1×10-5mol/L）、BaCl（2 0.1 mmol/L）、4-氨基吡啶（1 mmol/L）預(yù)孵育20 min，作為四乙基胺預(yù)孵育組、格列苯脲預(yù)孵育組、BaCl2預(yù)孵育組和4-氨基吡啶預(yù)孵育組;另設(shè)LM49 對照組（濃度設(shè)置同“2.2”項下），不加入四乙基胺、格列苯脲、BaCl2、4-氨基吡啶預(yù)孵育。隨后各組均加入去甲腎上腺素（1×10-6 mol/L）刺激血管環(huán)，使其收縮，記錄其張力變化。待血管環(huán)張力穩(wěn)定后，各組均按照“2.2”項下方法累積加入LM49，分別測定各組血管環(huán)的張力，并計算LM49 舒張血管百分比，分析鉀通道阻滯劑對LM49 舒張血管環(huán)作用的影響。每組平行考察6 個血管環(huán)。

2.6 LM49 對去甲腎上腺素激活的Ca2+收縮血管環(huán)作用的影響

取“2.1.2”項下去內(nèi)皮血管環(huán)，先用無鈣生理鹽溶液（含144 mmol/L NaCl、5.8 mmol/L KCl、1.2 mmol/LMgCl2、11.1 mmol/L 葡萄糖、5 mmol/L HEPES、0.5 mmol/LEGTA，pH=7.4）沖洗30 min，然后將血管環(huán)分為LM49預(yù)處理組和溶劑對照組。LM49 預(yù)處理組用不同濃度的LM49（2×10-6、5×10-6、1×10-5 mol/L，溶劑DMSO的體積分?jǐn)?shù)分別為0.002%、0.005%、0.010%）對血管環(huán)進行預(yù)處理，溶劑對照組加入相應(yīng)量DMSO 進行預(yù)處理。20min 后，各組分別加入去甲腎上腺素（1×10-6 mol/L）和鈣通道阻滯藥維拉帕米（1×10-6 mol/L），15 min 后累積加入CaCl（2 0.1、0.3、1、3、10 mmol/L）。記錄血管環(huán)張力變化，并計算血管收縮率：血管收縮率（%）=（LM49 預(yù)處理組累積加入CaCl2后血管環(huán)張力-LM49 預(yù)處理組加入CaCl2前血管環(huán)張力）/（溶劑對照組累積加入CaCl2誘發(fā)的血管環(huán)最大收縮張力-溶劑對照組加入CaCl2前血管環(huán)張力）×100%。比較LM49 預(yù)處理組與溶劑對照組的收縮效應(yīng)，分析LM49 對去甲腎上腺素激活的Ca2+收縮血管環(huán)作用的影響。每組平行考察6 個血管環(huán)。

2.7 LM49對KCl激活的Ca2+收縮血管環(huán)作用的影響

取“2.1.2”項下去內(nèi)皮血管環(huán)，用無鈣生理鹽溶液沖洗30 min，換為無鈣KCl（60 mmol/L）生理鹽溶液（含89.8 mmol/L NaCl、60 mmol/L KCl、1.2 mmol/L MgCl2、11.1 mmol/L 葡萄糖、5 mmol/L HEPES、0.5 mmol/LEGTA，pH=7.4）預(yù)孵育10 min，然后分為LM49 預(yù)處理組和溶劑對照組。按照“2.6”項下方法給藥，20 min 后，各組均累積加入CaCl2（0.1、0.3、1、3、10 mmol/L），記錄血管環(huán)張力變化，并計算血管收縮率。比較LM49 預(yù)處理組與溶劑對照組的收縮效應(yīng)，分析LM49 對KCl 激活的Ca2+收縮血管環(huán)作用的影響。每組平行考察6 個血管環(huán)。

2.8 LM49 對毒胡蘿卜素激活的Ca2+收縮血管環(huán)作用的影響

取“2.1.1”項下內(nèi)皮完整血管環(huán)，用無鈣生理鹽溶液沖洗30 min，連續(xù)3 次用去甲腎上腺素（1×10-6 mol/L）誘導(dǎo)血管環(huán)收縮，然后加入肌漿網(wǎng)Ca2+-腺苷三磷酸（ATP）酶泵抑制劑毒胡蘿卜素（1×10-6 mol/L）抑制肌漿網(wǎng)/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+泵活性。20 min 后，將血管環(huán)分為LM49 預(yù)處理組和溶劑對照組，LM49 預(yù)處理組分別用不同濃度的LM49（2×10-6、5×10-6 mol/L，溶劑DMSO的體積分?jǐn)?shù)分別為0.002%、0.005%）對血管環(huán)進行預(yù)處理，溶劑對照組加入相應(yīng)量的DMSO進行預(yù)處理。20 min 后，各組均累積加入CaCl（2 0.1、0.3、1、3、10、30 mmol/L），記錄血管環(huán)張力變化，并計算血管收縮率。比較LM49 預(yù)處理組與溶劑對照組的收縮效應(yīng)，分析LM49 對毒胡蘿卜素激活的Ca2+收縮血管環(huán)作用的影響。每組平行考察6 個血管環(huán)。

2.9 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 20.0 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。結(jié)果以x±s 表示。采用GraphPad Prism 8 軟件繪制濃度對數(shù)值-舒張效應(yīng)曲線，兩組量效曲線間的比較采用雙因素方差分析，采用Bonferroni’s test 檢驗比較兩對應(yīng)點間的差異。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

3 結(jié)果

3.1 LM49對大鼠血管環(huán)的舒張作用考察結(jié)果

LM49 對去甲腎上腺素預(yù)收縮的血管環(huán)有較好的舒張作用，且有明顯的量效趨勢。結(jié)果見圖1。

3.2 LM49對內(nèi)皮完整和去內(nèi)皮血管環(huán)張力的影響結(jié)果

與溶劑對照組比較，LM49 給藥組經(jīng)去甲腎上腺素或KCl預(yù)收縮的內(nèi)皮完整和去內(nèi)皮血管環(huán)在LM49 給藥濃度為3×10-6、5×10-6、1×10-5 mol/L 時的舒張血管百分比均顯著升高（P<0.01），提示LM49 對經(jīng)去甲腎上腺素或KCl 預(yù)收縮的內(nèi)皮完整和去內(nèi)皮血管環(huán)均有舒張作用，且具有濃度依賴趨勢。在不同濃度的LM49 作用下，內(nèi)皮完整血管環(huán)與去內(nèi)皮血管環(huán)的舒張血管百分比差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），提示LM49 對血管環(huán)的舒張作用與血管環(huán)內(nèi)皮是否完整無關(guān)。結(jié)果見圖2、圖3。

3.3 L-NAME和吲哚美辛對LM49 舒張血管環(huán)作用的影響結(jié)果

與LM49 對照組比較，L-NAME預(yù)孵育組和吲哚美辛預(yù)孵育組經(jīng)去甲腎上腺素預(yù)收縮的內(nèi)皮完整血管環(huán)在不同濃度LM49 作用下的舒張血管百分比差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），表明LM49 舒張血管的作用不受L-NAME、吲哚美辛的影響。結(jié)果見圖4。

3.4 鉀通道阻滯劑對LM49舒張血管環(huán)作用的影響結(jié)果

與LM49 對照組比較，四乙基胺預(yù)孵育組和4-氨基吡啶預(yù)孵育組經(jīng)去甲腎上腺素預(yù)收縮的血管環(huán)在不同濃度LM49 作用下的舒張血管百分比差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），而格列苯脲預(yù)孵育組和BaCl2 預(yù)孵育組經(jīng)去甲腎上腺素預(yù)收縮的血管環(huán)在LM49 濃度為5×10-6、1×10-5 mol/L 作用下的舒張血管百分比均顯著降低（P<0.01）。結(jié)果表明，格列苯脲和BaCl2 均可減弱LM49 對去甲腎上腺素預(yù)處理血管環(huán)的舒張效應(yīng)。結(jié)果見圖5。

3.5 LM49 對去甲腎上腺素激活的Ca2+收縮血管環(huán)作用的影響結(jié)果

與溶劑對照組比較，LM49 預(yù)處理組經(jīng)去甲腎上腺素刺激的去內(nèi)皮血管環(huán)在CaCl2濃度為1、3、10 mmol/L時的血管收縮率均顯著降低（P<0.01）。結(jié)果見圖6。

3.6 LM49對KCl激活的Ca2+收縮血管環(huán)作用的影響結(jié)果

與溶劑對照組比較，5×10-6、1×10-5 mol/L LM49 預(yù)處理組經(jīng)KCl 預(yù)刺激的去內(nèi)皮血管環(huán)在CaCl2 濃度為1、3、10 mmol/L 時，以及2×10- 4 mol/L LM49 預(yù)處理組經(jīng)KCl 預(yù)刺激的去內(nèi)皮血管環(huán)在CaCl2 濃度為3、10mmol/L時的收縮率均顯著降低（P<0.01）。結(jié)果見圖7。

3.7 LM49 對毒胡蘿卜素激活的Ca2+收縮血管環(huán)作用的影響結(jié)果

與溶劑對照組比較，LM49 預(yù)處理組經(jīng)去甲腎上腺素預(yù)刺激后加入毒胡蘿卜素的內(nèi)皮完整血管環(huán)在CaCl2濃度為3、10、30 mmol/L 時的血管收縮率均顯著降低（P<0.01）。結(jié)果見圖8。

4 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，LM49 具有血管舒張效應(yīng)，且去除血管內(nèi)皮后并不影響LM49 對大鼠離體主動脈環(huán)的舒張效應(yīng)。一氧化氮合酶活性可反映血管內(nèi)皮細(xì)胞功能和血管組織的舒張功能;環(huán)氧合酶介導(dǎo)血管內(nèi)皮收縮因子的產(chǎn)生，影響血管內(nèi)皮的收縮[13-14]。本研究發(fā)現(xiàn)，一氧化氮合酶抑制劑L-NAME及環(huán)氧合酶抑制劑吲哚美辛不能減弱LM49 的血管舒張效應(yīng)，由此推斷，LM49 對血管的舒張效應(yīng)與內(nèi)皮層的完整性無關(guān)，其可能直接作用于血管平滑肌。

鉀通道在調(diào)節(jié)平滑肌緊張性的過程中至關(guān)重要，動脈的平滑肌細(xì)胞包含4 種不同類型的鉀通道，分別是鈣激活型鉀通道、電壓門控鉀通道、ATP 敏感型鉀通道和內(nèi)向整流型鉀通道[15]。當(dāng)血管平滑肌細(xì)胞膜上的鉀通道開放時，K+外流，引起膜電位的超極化，接著關(guān)閉電壓門控鈣通道使Ca2+內(nèi)流減少，從而誘導(dǎo)血管擴張。本研究發(fā)現(xiàn)，ATP敏感型鉀通道阻滯劑格列苯脲及內(nèi)向整流型鉀通道阻滯劑BaCl2可以明顯抑制LM49 對大鼠主動脈血管環(huán)的舒張效應(yīng)，表明LM49 可以通過激活A(yù)TP 敏感型鉀通道和內(nèi)向整流型鉀通道，引發(fā)膜電位的超極化，進而誘導(dǎo)血管舒張。

在血管平滑肌的興奮-收縮偶聯(lián)過程中，高濃度的KCl可引發(fā)胞膜的去極化，使電壓門控鉀通道開放，促進Ca2+流入胞內(nèi)，引起胞內(nèi)Ca2+濃度增加，造成肌球蛋白輕鏈磷酸化，從而引發(fā)持續(xù)的平滑肌收縮[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，LM49 能夠直接抑制KCl引起的平滑肌收縮。此外，在無鈣環(huán)境中，用高濃度的KCl 使主動脈去極化后，LM49 可以抑制該情況下由CaCl2 引起的平滑肌收縮。由此表明，LM49 可以抑制Ca2+通過電壓門控鈣通道內(nèi)流。去甲腎上腺素作用于血管α1受體后，激活了G蛋白與磷脂酶C，產(chǎn)生三磷酸肌醇，引起肌漿網(wǎng)中的儲鈣釋放，而后Ca2+通過受體操控鈣通道流入胞內(nèi)[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，LM49 能夠明顯抑制去甲腎上腺素刺激引起的血管環(huán)收縮。這表明LM49 可拮抗Ca2+由受體操控鈣通道流入胞內(nèi)，從而介導(dǎo)其對血管的舒張效應(yīng)。

當(dāng)肌漿網(wǎng)中的儲鈣消耗后，會引起Ca2+通過鈣庫操縱性鈣通道內(nèi)流，這也是非興奮細(xì)胞Ca2+內(nèi)流的重要途徑。毒胡蘿卜素是常見的肌漿網(wǎng)Ca2+-ATP酶泵抑制劑，常用于減少胞內(nèi)鈣池中Ca2+，使鈣庫操縱性鈣通道開放[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)加入去甲腎上腺素及毒胡蘿卜素使鈣池內(nèi)Ca2+耗竭后，LM49 可以減弱CaCl2通過鈣庫操縱性鈣通道引起的血管收縮。這表明LM49 可能參與了激活Ca2+-ATP酶，其舒張血管效應(yīng)與鈣庫操縱性鈣通道有關(guān)。

綜上所述，LM49 對大鼠離體主動脈具有明確的舒張效應(yīng)。其具體機制可能為誘導(dǎo)ATP敏感型鉀通道、內(nèi)向整流型鉀通道開放，及抑制細(xì)胞外Ca2+通過電壓門控鈣通道、受體操控鈣通道、鈣庫操縱性鈣通道內(nèi)流。