防風多糖溫敏凝膠的制備及評價

高艷艷 秦銘 徐廣 吉莉 郭宇瑛 李顏伶 馬群

防風Saposhnikoviadivaricata(Turcz.)Schischk.為傘形科植物防風的干燥根，味辛、甘，性微溫，歸膀胱、肝、脾經[1]。臨床上防風為治療濕疹、蕁麻疹、特異性皮炎等過敏性疾病引起皮膚瘙癢的首選藥。防風多糖是防風重要的活性成分，具有抗腫瘤、抗癌、抗菌、免疫調節(jié)等多種藥理作用[2-4]。目前關于防風多糖的研究主要集中在單糖組成[5-6]、抗氧化[6-7]、抗腫瘤[3]等方面，抗過敏作用的物質基礎研究及新劑型的研發(fā)較少。

溫敏凝膠劑是以溶液狀態(tài)給藥后，利用高分子材料對外界溫度的響應發(fā)生相轉變，由液態(tài)轉化為非化學交聯(lián)半固體凝膠的制劑[8]。溫敏凝膠劑給藥后能粘附于給藥部位，使局部藥物濃度升高，達到并維持有效藥物濃度。其具有作用時間長，避免首關效應，減少毒副作用[9]等特點。普通凝膠給藥時需要人為的涂抹，使用存在一定的不便，而且給藥時容易損傷皮膚，造成二次損傷，對于大面積創(chuàng)傷難以保證給藥均勻，而溫敏凝膠能有效避免此類情況發(fā)生，尤其適合做各種中藥提取物的給藥載體[10-11]。

隨著中藥外用制劑的不斷發(fā)展，“內病外治”已成為今后研究發(fā)展方向之一。課題組前期研究表明防風多糖具有較好的抗過敏活性，本研究將防風有效部位制備成溫敏凝膠，使藥物直接作用于病變部位并維持較高的血藥濃度，延長作用時間。藥物釋放與凝膠溶蝕同時進行，更好地發(fā)揮緩釋作用，且解決了普通凝膠分散不均勻問題，提高患者順應性，提高藥物的生物利用度，為臨床外用緩釋制劑的制備提供新方法。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

防風(北京三和藥物有限公司)，稱取防風切片600 g置于圓底燒瓶中，加入10倍量蒸餾水，加熱回流提取三次，每次1.5小時，合并提取液。提取液濃縮至生藥含量1 g/mL時進行醇沉，乙醇終濃度為80%，于4℃靜置12小時濾去上清液，取沉淀干燥，得防風粗多糖。采用Sevage法除蛋白，采用大孔樹脂法除色素，得到防風多糖。

泊洛沙姆407(GND32821B)、泊洛沙姆188(GNE03221B)，購自德國BASF公司；甘油(批號：20150328)、丙二醇(批號：20130612)，購自北京化工廠；苯甲酸(批號：20120910)，購自天津市福晨化學試劑廠；葡萄糖對照品(批號：B21882)、薄荷油(批號：S24778)、山梨醇(批號：S11057)，購自上海源葉生物科技有限公司；氮酮(批號：XW00503391)、聚乙烯吡咯烷酮K30(批號：30154481)，購自國藥集團化學試劑有限公司；對羥基苯甲酸甲酯(批號：20150613)， 購自天津市光復精細化工研究所。

萬分之一電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)；旋轉蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠，型號：RE-52AA)；恒溫水浴鍋(北京科偉永興儀器有限公司，型號：HH-S6)；超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司，型號：KQ-400KDE)；臺式離心機(上海安亭科學儀器廠，型號：TDL-50B)；實驗室用pH計(梅特勒-托利多儀器上海有限公司，型號：FE20)；雙光束紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限公司，型號：TU-1901)；RTC Basic磁力攪拌器(上海司樂儀器有限公司，型號：IKA)；SPECTRO star Nano酶標儀(德國BMG LABTECH公司，型號：DNM-9602)；恒溫振蕩器(常州金壇良友儀器有限公司，型號：ZD-85)。

1.2 溫敏凝膠的制備工藝

采用冷凝法制備溫敏凝膠。精密量取一定量純化水，加入準確稱量的泊洛沙姆407(P407)和泊洛沙姆188(P188)，放入4℃冰箱至充分溶脹，得澄清透明的空白原位凝膠。取適量防風多糖樣品加入凝膠基質中，混合均勻，制得防風多糖溫敏凝膠劑。

1.3 膠凝溫度的測定

取適量溫敏凝膠于燒杯中，磁力攪拌器設置轉速為200轉/分鐘，以1～2℃/分鐘的速率緩慢升溫，觀察溶液狀態(tài)變化，直至燒杯倒置后溶液不再流動，此時溫度定義為膠凝溫度(T)，測定3次取平均值。

1.4 單因素試驗

1.4.1 凝膠基質篩選 (1)P407濃度對膠凝溫度的影響：配制濃度為15%～25%的P407溶液，按“1.3”項下方法測定其膠凝溫度，每種濃度測定3次，取平均值。(2)P188濃度對膠凝溫度的影響：配制濃度為40%～80%的P188溶液，按“1.3”項下方法測定其膠凝溫度，每種濃度測定3次，取平均值。(3)P407與P188濃度對膠凝溫度的影響：根據(jù)上述考察結果，固定P407濃度(16%、18%、20%)，分別向其中加入不同濃度的P188(0.5%～5%)，按“1.3”項下方法測定其膠凝溫度，每種濃度測量3次，取平均值。

1.4.2 多糖加入對基質膠凝性質的影響 以含2%多糖的P407/P188(20%/1%)凝膠溶液考察制劑配制方式，方法如下：A多糖用足量蒸餾水使完全溶解，將基質加入多糖水溶液中，置4℃冷藏24小時，使其完全溶脹；B將基質加入足量蒸餾水中，置4℃冷藏24小時，使完全溶脹，再將多糖加入空白基質溶液中。按“1.3”項下方法測定其膠凝溫度。

1.5 Box-Benhnken法優(yōu)化溫敏凝膠制備工藝 在單因素試驗的基礎上，選擇P417、P188、PVP-K30、甘油的濃度作為考察因素，膠凝溫度作為響應值，采用Box-Benhnken設計法進行處方優(yōu)化，范圍分別為：P417濃度(A)為16%～24%，P188濃度(B)為1%～5%，PVP-K30濃度(C)為0.1%～0.5%，甘油濃度(D)為1%～10%。對結果進行多元回歸擬合，以膠凝溫度30～32℃為擬合范圍得到最優(yōu)處方。

1.6 質量評價

1.6.1 含量測定 精密稱取防風多糖溫敏凝膠50 mg于25 mL容量瓶中，加適量水超聲15分鐘后定容至刻度。制備3批樣品采用苯酚-硫酸法測定總多糖含量，具體操作參照2020版《中華人民共和國藥典》[12]。

1.6.2 外觀性狀 取制備的適量防風多糖溫敏凝膠分別在室溫條件下與31℃左右的皮膚表面觀察凝膠的性狀。

1.6.3 pH值 稱取適量防風多糖溫敏凝膠3份置于西林瓶中，用pH計測定其pH值，每份測量3次取平均值。

1.6.4 黏度 稱取防風多糖溫敏凝膠3份置于西林瓶中，用NDJ-8S黏度計4號轉子測定其黏度，每份測量3次取平均值。

1.6.5 穩(wěn)定性 (1)一般穩(wěn)定性試驗：取防風多糖溫敏凝膠3份，將其置于4℃、25℃、40℃環(huán)境下一周，分別于第1、4、7天取樣觀察，以溫敏凝膠的外觀性狀、含量、pH為指標，考察其穩(wěn)定性。(2)耐熱耐寒試驗：將防風多糖溫敏凝膠劑分別置于6個具塞試管中，其中3份置60℃恒溫干燥箱中6小時，另3份置-20℃冰箱中24小時，觀察凝膠的外觀變化。(3)離心試驗：取防風多糖溫敏凝膠3份置于離心管中，3000 r/分鐘，離心30分鐘，觀察其外觀變化、均勻程度以及是否分層。

1.6.6 溶蝕動力學與釋藥行為考察 采用無膜溶出法測定溫敏凝膠的溶蝕動力學，并考察藥物的釋放。精密稱取防風多糖溫敏凝膠5 g，加入到質量為W0的具塞試管中，置于37℃恒溫振蕩器中預熱10分鐘，完全形成半固體凝膠后稱重W1。加入5 mL同溫度pH=7.2的PBS緩沖液，振動頻率為100 r/分鐘，每隔30分鐘傾倒出全部釋放介質另存，將試管表面拭干，迅速稱量并記錄其質量為Wt。緩慢補加同溫度釋放介質5 mL，放入恒溫振蕩器中繼續(xù)上述操作，直至試管內溶液全部倒出，相鄰時間點間質量差異即為凝膠累積溶蝕率，計算公式為Q(%)=W1-Wt)/(W1-W0)×100%。以凝膠累積溶蝕率對取樣時間作圖，得到凝膠經時溶蝕曲線。另外，取上述另存的釋放介質，按“1.6.1”項下方法測定防風多糖含量，以累積釋藥率對取樣時間作圖，得到凝膠釋藥曲線。

2 結果

2.1 單因素實驗

2.1.1 凝膠基質篩選 P407濃度對膠凝溫度影響顯著，如圖1所示，當P407濃度在15%～25%之間時，隨著P407濃度升高，膠凝溫度呈下降趨勢，表明膠凝溫度對P407濃度的大小有依賴性。如圖2所示，當P188濃度在40%～80%之間時，隨著P188濃度升高，膠凝溫度呈下降趨勢，濃度80%時，膠凝溫度在30℃左右才符合皮膚給藥溫度。由圖3可知，當P407的濃度一定時，膠凝溫度隨著P188濃度(0.5%～5%)的增大而升高。因此，本實驗將P407與P188兩種基質聯(lián)合使用，調節(jié)溫敏凝膠皮膚給藥的最適溫度。

圖1 不同濃度P407對膠凝溫度的影響(n=3)

圖2 不同濃度P188對膠凝溫度的影響(n=3)

圖3 不同濃度的P407與P188對膠凝溫度的影響(n=3)

2.1.2 多糖加入對基質膠凝性質的影響 如表1所示，多糖的加入對溫敏凝膠膠凝溫度影響較小。根據(jù)凝膠外觀及膠凝溫度的變化，選擇B項加入方式。

表1 多糖加入對基質膠凝性質的影響(n=3)

2.2 Box-Benhnken法優(yōu)化溫敏凝膠處方

采用Box-Benhnken試驗來考察關鍵工藝參數(shù)與工藝優(yōu)化指標之間的相互關系，進行處方優(yōu)化。結果表明P407、P188、PVP-K30、甘油濃度、P407濃度和甘油濃度的交互作用對溫敏凝膠的膠凝溫度都有顯著影響。結果見表2。

采用Design-Export 8.0軟件進行多元線性回歸擬合，得到二次多項式模型的回歸方程Y=36.18-10.74×A+4.28×B+2.51×C+2.14×D+1.23×A×B-0.15×A×C-3.10×A×D-1.37×B×C-0.52×B×D-0.35×C×D+0.13×A2-2.29×B2+0.46×C2+0.41×D2。對該數(shù)學模型進行方差分析，結果見表3，P<0.0001，說明二次多項式模型顯著性良好，該模型擬合程度良好，可以為溫敏凝膠處方組成提供參考。由該模型預測的處方組成為P407濃度19.4%，P188濃度1.4%，PVP-K30濃度0.1%，甘油濃度6.0%，膠凝溫度約為30.5℃。

表2 Box-Benhnken設計和結果

2.3 防風多糖溫敏凝膠的質量評價

2.3.1 含量測定 采用苯酚—硫酸法測定防風溫敏凝膠中總多糖含量，結果見表4。

2.3.2 外觀性狀 常溫下，防風多糖溫敏凝膠為質地均勻的黃棕色液體。加熱到31℃時，液體逐漸轉變?yōu)榘牍腆w物質，質地均勻細膩，有一定黏度，涂展性良好。如圖4所示。

表3 以膠凝溫度為響應值的 回歸模型方差分析表

表4 防風多糖溫敏凝膠總多糖含量測定結果

2.3.3 pH值 防風多糖溫敏凝膠的pH為5.41，符合外用凝膠劑的pH要求。

2.3.4 黏度 防風多糖溫敏凝膠的黏度測量結果見表5，均值為344143 mPa·S。

表5 防風多糖溫敏凝膠黏度測定結果

2.3.5 穩(wěn)定性 (1)一般穩(wěn)定性：如表6所示，防風多糖溫敏凝膠在3種環(huán)境下未發(fā)現(xiàn)外觀形態(tài)改變，pH與含量無明顯變化。(2)耐熱耐寒穩(wěn)定性：防風多糖溫敏凝膠外觀未發(fā)生變化，未分層沉降，質地均勻。(3)離心試驗：防風多糖溫敏凝膠外觀未發(fā)生變化，未分層，質地均勻。

表6 不同溫度下防風多糖溫敏凝膠的穩(wěn)定性

2.3.6 溶蝕動力學與釋藥行為考察 溫敏凝膠溶蝕曲線和釋藥曲線如圖5和圖6所示。結果表明，其釋放具有時相性，前期釋藥稍快，后期釋藥則有明顯的緩釋特征，釋放時間可達18小時以上。初步分析防風多糖溫敏凝膠體外釋藥特征為緩釋釋放。以累積溶蝕率為橫坐標(X)，累積釋放率為縱坐標(Y)，進一步考察凝膠溶蝕與藥物釋放的相關性，得到其回歸方程Y=0.9592X+1.1145，R2=0.9986。以上結果表明，藥物釋放與凝膠溶蝕是同時進行的，藥物釋放速率主要受到凝膠溶蝕的控制。

圖5 防風多糖溫敏凝膠體外溶蝕曲線(n=3)

圖6 防風多糖溫敏凝膠體外釋藥曲線(n=3)

3 討論

經皮給藥是指藥物運用到皮膚后，通過角質層經毛細血管吸收使該處的藥物濃度升高，達到并維持有效濃度，具有局部或全身治療作用[13]。中藥經皮給藥有多種劑型，乳膏劑、軟膏劑、散劑、涂劑等傳統(tǒng)外用制劑存在載藥量小、生物利用度低、污染衣物等缺陷，且手工制備劑量不精確、工藝粗放，無法滿足高質量中藥制劑的需求[14]。溫敏凝膠在局部給藥方面具有獨特優(yōu)勢，其可以提高藥物的溶解度及穩(wěn)定性，且直接作用于病變部位，具有緩釋、控釋功能，生物利用度高，患者順應性好，近年來逐漸應用于中藥新劑型開發(fā)。本研究采用P407和P188作為凝膠基質，制備工藝簡單、靶向性強，且具有一定的表面活性能增加難溶藥物的溶解度[15]，克服了以殼聚糖為基質制備的凝膠膠凝溫度難控制、膠凝時間過長的缺點，而且相較于以N-異丙基丙烯酰胺為基質制備的凝膠，對皮膚無刺激性。

防風多糖是多種生物活性的重要物質基礎[16]，在防治過敏疾病方面有潛在的優(yōu)勢。課題組前期使用二硝基氟苯誘導小鼠遲發(fā)型超敏反應，通過耳腫脹率、體質量和器官重量等指標評價防風多糖的抗過敏能力，結果表明防風多糖能有效的抑制小鼠遲發(fā)型超敏反應，具有抗過敏的作用[17]。然而，中藥成分的添加可能會影響制劑的穩(wěn)定性。因此，本研究比較2%、4%、6%、8%不同比例的多糖加入對基質膠凝性質的影響，2%、4%、6%比例的多糖加入后溶解完全得澄清液體，8%多糖加入后溶液載藥量飽和，有多糖析出。2%、4%、6%多糖加入后膠凝溫度分別為30.5℃、30.8℃、30.7℃，證明多糖的加入對溫敏凝膠膠凝溫度和性質影響較小，所制備的防風多糖溫敏凝膠性質穩(wěn)定。

防風多糖溫敏凝膠用于治療過敏性疾病，其溶蝕作用與藥物釋放機制和治療效果息息相關，通過研究藥物濃度與消除規(guī)律，可有效評價制劑優(yōu)劣和指導用藥。由體外溶蝕曲線和釋藥曲線可知，在初始階段防風多糖釋放速率較快，隨著釋放時間的延長，防風多糖釋放速率逐漸減慢，曲線斜率接近于零，表明防風多糖溫敏凝膠藥物釋放達到平衡。主要原因是隨著時間的延長，溫敏凝膠內部的防風多糖向介質中不斷擴散，溫敏凝膠表面和藥物介質中的藥物濃度梯度逐漸降低，使藥物釋放速率減慢，由此表現(xiàn)出緩釋的效果。

本論文制備的防風多糖溫敏凝膠工藝穩(wěn)定，外觀均勻，質量可控且有較好緩釋作用，可為臨床治療過敏性疾病提供新型藥物，為防風新劑型的開發(fā)提供參考。溫敏凝膠劑作為一種新型的外用制劑，工藝簡單，工業(yè)化生產較為便利，生物利用度高，患者適應性好，適合中藥制劑的應用現(xiàn)狀，有利于推廣，可作為中藥傳統(tǒng)制劑劑型改進的一種選擇。但凝膠劑載藥量小，仍存在一定的局限性，可應用脂質體、微囊、微乳、包合物等新技術使中藥凝膠劑所含藥物發(fā)揮更好的藥效。