蘭菲菲 陳延冰 何天文 梁杰

廣東省婦幼保健院醫(yī)學(xué)遺傳中心（廣州 511442）

短串聯(lián)重復(fù)序列（short tandem repeat，STR）是人類基因組DNA 中的一類具有長度多態(tài)性的DNA 序列，片段長度一般在500 bp 以內(nèi)，符合孟德爾遺傳定律，被廣泛應(yīng)用于親權(quán)鑒定檢測中。受不同人群基因多態(tài)性及引物結(jié)合位點(diǎn)突變等因素的影響，親權(quán)鑒定檢測實(shí)踐中會遇到STR 位點(diǎn)發(fā)生的一些特殊現(xiàn)象，例如突變、off-ladder、等位基因丟失、稀有等位基因等等［1］。STR 基因座的基因分型特點(diǎn)，有研究人員采用不同的檢測體系，在不同人群中進(jìn)行了分析［2-5］?；蚨鄳B(tài)性也是較為常見的引起STR 基因座發(fā)生特殊基因分型的原因之一，不僅對STR 擴(kuò)增結(jié)果有一定影響，同時(shí)也與一些疾病的發(fā)病相關(guān)［6-7］。由于STR 基因座的等位基因丟失對于親子鑒定結(jié)果有不同程度的影響，及時(shí)發(fā)現(xiàn)并運(yùn)用正確的分析檢測方法是十分必要的。

D5S818 基因座位于人類5 號染色體5q23.2 區(qū)域，是由AGAT 組成的四核苷酸核心重復(fù)序列，等位基因分型范圍在7～18 波動(dòng)。D5S818 基因座是1997年美國聯(lián)邦調(diào)查局建立的聯(lián)合DNA 索引系統(tǒng)（Combined DNA Index System，CODIS）的13 個(gè)STR 基因座之一［8］，是司法部司法鑒定科學(xué)研究院能力驗(yàn)證親權(quán)鑒定項(xiàng)目考核內(nèi)容的19 個(gè)常染色體必檢STR 基因座。在親子鑒定的實(shí)際檢測應(yīng)用中，筆者發(fā)現(xiàn)利用PowerPlex21 系統(tǒng)檢測STR 基因座分型時(shí)會出現(xiàn)個(gè)別基因座的等位基因丟失現(xiàn)象。該現(xiàn)象對親子鑒定結(jié)果分析有一定的影響，從而干擾親子關(guān)系的鑒定結(jié)論，本文詳細(xì)報(bào)道了D5S818 基因座等位基因丟失現(xiàn)象的分析及避免其對鑒定結(jié)論影響的方法。對PowerPlex21 系統(tǒng)D5S818 基因座的等位基因丟失情況進(jìn)行了總結(jié)與驗(yàn)證，提出該系統(tǒng)在中國南方漢族人群中D5S818基因座檢測位點(diǎn)的局限性。

1 材料與方法

1.1 材料 本研究所用樣本為本院司法鑒定所2017-2019年受理的換發(fā)出生醫(yī)學(xué)證明、入戶等司法用途親子鑒定案例的積累。與委托人簽署知情同意書后，采集受檢者外周靜脈血2 mL 或者毛囊等生物檢材用于實(shí)驗(yàn)檢測及分析。用于親權(quán)鑒定商業(yè)化的一些檢測系統(tǒng)中包含有D5S818 基因座（表1），本研究的樣本檢測采用PowerPlex21 系統(tǒng)。在對3 248 例家系親子鑒定的結(jié)果分析中發(fā)現(xiàn)，5 個(gè)家庭的7 名個(gè)體在D5S818 基因座出現(xiàn)了等位基因12 的丟失。

表1 包含D5S818 基因座的8 種STR 分型商業(yè)化檢測系統(tǒng)Tab.1 Eight commercial STR genotyping systems with D5S818 locus

1.2 主要試劑與儀器 試劑：PowerPlex21 復(fù)合擴(kuò)增體系（美國Promega 公司），AmpFLSTR Identifiler復(fù)合擴(kuò)增體系（美國AB 公司）。儀器：2720 型PCR擴(kuò)增儀（美國AB 公司），3500XL 基因分析儀（美國AB 公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 STR基因座的等位基因分型 用Chelex-100（濃度為5%）法，樣本經(jīng)過洗滌、離心收集沉淀細(xì)胞、Chelex-100 孵育后煮沸，提取DNA 待用。DNA樣本按照PowerPlex21 復(fù)合擴(kuò)增體系的說明書，復(fù)合擴(kuò)增21 個(gè)STR 基因座。PCR 擴(kuò)增的反應(yīng)體系為10 μL：Buffer Mix 2 μL，Primer Set 2 μL，ddH2O 6 μL，DNA 1 μL。PCR 擴(kuò)增條件：96 ℃1 min；94 ℃10 s，59 ℃1 min，72 ℃30 s，30 個(gè)循環(huán)；60 ℃10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用3500XL 基因分析儀電泳，用GeneMapper ID-X Vertion1.3（美國AB 公司）自動(dòng)分析STR 基因座的基因型。

1.3.2 D5S818 基因座等位基因丟失的驗(yàn)證 發(fā)生等位基因丟失的7 名個(gè)體及其家系，用Chelex-100法重新提取樣本的DNA，根據(jù)Identifiler 復(fù)合擴(kuò)增體系的說明書，復(fù)合擴(kuò)增16個(gè)STR基因座。PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為25 μL：PCR Reaction Mix 10.5 μL，Primer Set 5.5 μL，DNA Polymerase 0.5 μL，DNA 10 μL。PCR 擴(kuò)增條件：95 ℃11 min；94 ℃1 min，59 ℃1 min，72 ℃1 min，28 個(gè)循環(huán)；60 ℃60 min。擴(kuò)增后的產(chǎn)物電泳與分析與1.3.1 內(nèi)容相同，選擇Identifiler 體系的分析方法和內(nèi)標(biāo)。

1.3.3 累積親權(quán)指數(shù)（CPI）計(jì)算 根據(jù)GeneMapper ID-X Vertion1.3 分析的STR 基因座等位基因分型，使用鑒定所自主研發(fā)的親權(quán)指數(shù)計(jì)算軟件、按照司法部頒布的《親權(quán)鑒定技術(shù)規(guī)范》［9］中的計(jì)算方法，分別計(jì)算每個(gè)STR 基因座的父權(quán)指數(shù)（PI）和每個(gè)家庭的累積親權(quán)指數(shù)。PowerPlex21 與Identifiler 體系分別進(jìn)行計(jì)算，根據(jù)CPI 的計(jì)算結(jié)果得出鑒定結(jié)論。

2 結(jié)果

2.1 D5S818 基因座可能存在等位基因丟失 在3 248 案例中使用PowerPlex21 體系檢測分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，有5 個(gè)家系的分析結(jié)果中D5S818 基因座提示母親發(fā)生“突變”，電泳圖顯示為“純合”而峰高與雜合等位基因的峰高相似，分析D5S818 基因座可能存在等位基因丟失的情況，5 個(gè)家系D5S818 基因座的電泳圖譜見圖1。

圖1 D5S818 基因座等位基因分型圖譜（PowerPlex21 體系）Fig.1 Genotyping map of D5S818 loci（PowerPlex21 system）

2.2 Identifiler 體系驗(yàn)證D5S818 基因座等位基因12 的丟失 可能發(fā)生等位基因丟失的5 個(gè)家系樣本重新提取DNA，采用Identifiler 體系進(jìn)行PCR復(fù)合擴(kuò)增后發(fā)現(xiàn)，其中7 名個(gè)體能夠檢測分析出D5S818 基因座的等位基因12（圖2），說明這7 名個(gè)體在使用PowerPlex21 體系擴(kuò)增時(shí)發(fā)生了等位基因12 的丟失（表2）。

表2 D5S818 基因座的分型及等位基因丟失情況分析Tab.2 Genotyping of D5S818 locus and analysis of allelic loss

圖2 D5S818 基因座等位基因分型圖譜（Identifiler 體系）Fig.2 Genotyping map of D5S818 loci（Identifiler system）

2.3 D5S818基因座等位基因丟失對CPI的影響使用PowerPlex21 體系檢測分析出現(xiàn)的等位基因丟失家系，屬于單個(gè)基因座的不符合遺傳規(guī)律情況，易被誤認(rèn)為“突變”進(jìn)行CPI 的計(jì)算。本文中的5 家系根據(jù)PowerPlex21 和Identifiler 的STR 基因座等位基因分型結(jié)果計(jì)算CPI，由于PowerPlex21體系出現(xiàn)“突變”，分別計(jì)算父子與母子的二聯(lián)體CPI 以確認(rèn)是否存在父子或者母子關(guān)系，見表3。

表3 D5S818 基因座等位基因丟失家系的CPI 計(jì)算Tab.3 CPI calculation of D5S818 allele loss families

3 討論

親權(quán)鑒定檢測中存在STR 基因座的等位基因丟失現(xiàn)象［10］，其發(fā)生的原因有幾種可能性，例如不同人群STR 基因座的多態(tài)性或者個(gè)體DNA 在STR基因座的核心序列內(nèi)發(fā)生了突變［4，11］，以及在檢測體系的引物擴(kuò)增結(jié)合區(qū)發(fā)生了突變的情況［12-14］，都會使等位基因擴(kuò)增失敗而發(fā)生假丟失。使用不同的商業(yè)化檢測體系均有報(bào)道STR 基因座等位基因丟失的情形，例如用Goldeneye 20A 與PowerPlex Fusion 體系檢測在D2S1338 基因座發(fā)現(xiàn)丟失等位基因19［15］、Microreader21 ID 體系中發(fā)生了D18S51基因座的等位基因19 丟失［13］、D18S51 基因座使用GoldenEye 20A 體系檢測出現(xiàn)了等位基因18，19 的丟失［16］、PowerPlex21檢測體系中D8S1179基因座丟失等位基因13［17］。Penta E 基因座在Microreader21 ID 與Goldeneye 20A 體系均出現(xiàn)過丟失等位基因11［18］。隨著檢測人群數(shù)量的增加，STR 基因座多態(tài)性的影響效應(yīng)也逐漸呈現(xiàn)得較為明顯［19-22］，而不同的檢測體系在同一基因座的分型范圍及等位基因的頻率分布差異也并不相同。因此，明確不同體系檢測方法STR 基因座等位基因丟失情況及其對鑒定結(jié)果影響，在親子鑒定實(shí)踐中具有重要參考價(jià)值。

本文發(fā)現(xiàn)在中國南方漢族人群中利用該體系檢測時(shí)，D5S818 基因座的等位基因12 容易發(fā)生丟失。根據(jù)研究報(bào)道顯示，使用華夏白金檢測系統(tǒng)調(diào)查D5S818 基因座的等位基因分型范圍為7-15［23］，PowerPlex21 系統(tǒng)中D5S818 基因座的等位基因分型范圍為6-18，AmpFLSTR Identifiler 系統(tǒng)分型范 圍 為7-16，PowerPlex21 系統(tǒng)中D5S818 等 位基因的檢測分型范圍略廣泛，在該基因座出現(xiàn)offladder 等位基因幾率稍小一些。有研究人員利用PowerPlex21 檢測系統(tǒng)對國內(nèi)福建、湖南、山西、黑龍江等小樣本群體進(jìn)行了遺傳調(diào)查并分析遺傳關(guān)系［24］。張檸等［25］采用PowerPlex21 檢測系統(tǒng)對云南苗族人群常染色體STR 基因座遺傳多態(tài)性調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，D5S818 基因座的等位基因頻率分布差異較大。因此，對于較特殊的等位基因分型現(xiàn)象，例如等位基因丟失或off-ladder 等，由于檢測引物與擴(kuò)增范圍及效率的不同，利用不同檢測體系對D5S818 基因座特殊等位基因分型的檢測效率也會有差異。由于PowerPlex21 研發(fā)的人群數(shù)據(jù)來源于西方人群，在中國人群的檢測使用中可能會出現(xiàn)由于多態(tài)性不同或者該基因座引物結(jié)合區(qū)DNA 位點(diǎn)屬于突變敏感區(qū)域，導(dǎo)致出現(xiàn)等位基因缺失的情況。因此，考慮研制較適合中國人群的D5S818 基因座擴(kuò)增引物區(qū)域，完善體系檢測從而避免D5S818 基因座等位基因12 丟失的發(fā)生。

發(fā)生在孩子的等位基因丟失現(xiàn)象在實(shí)際檢測分析過程中容易被忽略，如果恰好被檢父與生母在該基因座中有相同的等位基因分型，孩子則能夠在父母中找到已經(jīng)檢測到的未“丟失”的等位基因來源，則丟失等位基因的基因座由于符合遺傳規(guī)律而往往不容易被發(fā)現(xiàn)。另外一種情況，等位基因丟失容易被誤認(rèn)為成“突變”，在鑒定實(shí)踐過程中被發(fā)現(xiàn)的等位基因丟失絕大多數(shù)屬于該種情形，本文中發(fā)現(xiàn)的5 個(gè)家系屬于此種情況，由于發(fā)生等位基因丟失的基因座“不符合遺傳規(guī)律”而被發(fā)現(xiàn)。當(dāng)這種假突變是“多步突變”時(shí)，按照“突變”計(jì)算該基因座的PI 值，在“突變”步數(shù)較多的情況下計(jì)算得出的CPI 可能與實(shí)際的鑒定結(jié)論不符合。本文中其他4 個(gè)家系均容易誤認(rèn)為在D5S818基因座發(fā)生了母源性突變而導(dǎo)致母子關(guān)系的誤判。但是本研究存在不足之處，由于5 個(gè)家系恰好都是母親或孩子發(fā)生的等位基因丟失，所以父子關(guān)系的判斷并沒有受到影響，未能研究分析父親發(fā)生等位基因丟失的情況。在今后的研究中應(yīng)逐步積累增加分析的樣本量，進(jìn)一步探討父親發(fā)生等位基因丟失對鑒定結(jié)果的影響。

因此，出現(xiàn)D5S818 基因座等位基因“不符合遺傳規(guī)律”的情況應(yīng)查看電泳圖譜峰高辨別雜合與純合情況，同時(shí)分析孩子在該基因座的等位基因遺傳來源，注意分辨這種“突變”是否由于發(fā)生了等位基因12 的丟失所致，有條件時(shí)可以選擇有相同基因座檢測位點(diǎn)的商業(yè)化體系進(jìn)行驗(yàn)證。本文的研究經(jīng)過多年檢測案例的經(jīng)驗(yàn)積累，對PowerPlex21 體系檢測出的D5S818 基因座“突變”一般采用Identifiler 體系檢測是否發(fā)生了等位基因12 丟失，并采用Identifiler 體系的檢測結(jié)果作為鑒定分析結(jié)果與鑒定結(jié)論的依據(jù)，從而規(guī)避可能影響鑒定結(jié)論的風(fēng)險(xiǎn)因素。