李靜舒 賀東亮

摘? ? 要：為了深入研究蕎麥中抗真菌類(lèi)蛋白質(zhì)，選擇蕎麥品種‘晉蕎2號(hào)’籽粒為試驗(yàn)材料，先經(jīng)過(guò)篩、脫脂，然后利用緩沖液浸提、硫酸銨鹽析提取籽粒中總蛋白，水浴鍋中80 ℃下熱處理去除雜蛋白，經(jīng)過(guò)Resourse S陽(yáng)離子交換層析和Superdex Peptide HR10/300分子篩層析兩步分離純化，建立了一套蕎麥抗真菌蛋白分離純化的工藝。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)定該抗真菌蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量，牛津杯法測(cè)定抑菌活性，倒置顯微鏡觀察真菌形態(tài)變化。結(jié)果表明：試驗(yàn)獲得的蕎麥籽?？拐婢鞍自诘鞍啄z圖上表現(xiàn)出單一條帶，純度較高，相對(duì)分子質(zhì)量為8.2 kDa。該抗真菌蛋白對(duì)綠色木霉的生長(zhǎng)有明顯的抑制作用，并且呈現(xiàn)一定的劑量依賴(lài)性。形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，菌絲生長(zhǎng)受到抑制，表現(xiàn)出頂端部膨大、泡狀物出現(xiàn)、原生質(zhì)凝縮及片段化等特征。

關(guān)鍵詞：蕎麥;抗真菌蛋白;離子交換層析;分子篩層析;抗真菌活性

中圖分類(lèi)號(hào)：S517;Q516? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? ? ? ? ? ?DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2022.06.002

Purification and Antibacterial Activity of? Antifungal Protein from Buckwheat Seed

LI Jingshu1，HE Dongliang2

（1.Shanxi Open University，Taiyuan，Shanxi 030027， China; 2.Taiyuan Institute of Technology， Taiyuan，Shanxi 030008， China）

Abstract：In order to further study the antifungal proteins in buckwheat， the seed of 'Jinqiao 2' of buckwheat varieties was selected as the experimental material. After screening and degreasing， the total protein in the seeds was extracted by buffer solution extraction and ammonium sulfate salting out. The miscellaneous protein was removed by heat treatment at 80 ℃ in a water bath pot.After cationicex changing chromatography by Resource S and molecular sieve chromatography by Superdex Peptide HR10/300， a set of separating and purifying technology of buckwheat antifungal protein were set up.? The relative molecular mass of the antifungalprotein was determined by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis， the antifungal activity was determined by Oxford cup method， and the morphological changes of fungi were observed by inverted microscope. The results showed that the antifungal protein of buckwheat seeds showed a single band on the protein gel map and possessing high purity， and the relative molecular mass was 8.2 kDa. The antifungal protein significantly inhibited the growth of Trichoderma viride and showed a certain dosedependence.Morphological observation showed that the growth of mycelium was inhibited， showing the characteristics of top enlargement， vesicles， protoplasm condensation and the morphological fragmentation.

Key words： buckwheat;antifungal protein;cationic exchange chromatography; molecular sieve chromatography; antifungal activity

高等植物在其種子貯藏、植株形成等生長(zhǎng)階段，會(huì)受到各種病原微生物污染的影響。但是經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的進(jìn)化，高等植物也形成了一套自己的防御體系，來(lái)維持植物抗病性和病原微生物致病性的動(dòng)態(tài)平衡。最常見(jiàn)的方式是在植物體內(nèi)表達(dá)出具有抵抗病原微生物的物質(zhì)，例如抗菌蛋白（antimicrobial protein，AMPs），它是某些植物體為了抵抗外界病原體的侵襲，而產(chǎn)生的一種或一類(lèi)具有抗菌活性的非特異性蛋白質(zhì)的總稱(chēng)[1-2]。植物源的抗菌蛋白具有其獨(dú)特的優(yōu)越性，它們的抗菌活性較強(qiáng)，抗菌譜范圍廣，可以直接作為殺菌制劑噴涂在植株上或混入植物生長(zhǎng)的土壤中，因而受到研究人員的廣泛關(guān)注。有報(bào)道稱(chēng)，在多種植物中發(fā)現(xiàn)并分離出抗菌蛋白，它們對(duì)細(xì)菌、真菌和某些病毒的生長(zhǎng)活性具有明顯的抑制作用。袁素素等[3]從望江南種子中提取出SU5抗菌蛋白，該蛋白對(duì)玉米小癍病菌等12種植物病原真菌具有抑制活性。張耀等[4]從芝麻菜種子中分離純化出ZSU2抗菌蛋白，且該蛋白具有極強(qiáng)的熱穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性。另外，植物源抗菌蛋白還可以作為基因工程改造的材料，經(jīng)過(guò)修飾、加工，將抗病基因?qū)胫仓曛?，進(jìn)一步提高植物的抗病能力。肖松華等[5]將天麻抗真菌蛋白基因插入到一種棉花品系中，獲得三種抗落葉型黃萎病的棉花株系。

蕎麥，屬于廖科（Polygonaceae）蕎麥屬（Fagopyrum），一年或多年生雙子葉草本植物[6]。山西是蕎麥主產(chǎn)區(qū)之一，品種資源豐富、種質(zhì)優(yōu)良。蕎麥在全省各個(gè)地區(qū)均有種植，以晉北、晉西北以及丘陵山區(qū)最多[7]。山西省的蕎麥品種主要有甜蕎和苦蕎。蕎麥具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，兼具食用和藥用性[8-9]，富含蛋白質(zhì)、維生素、礦物質(zhì)以及多種功能性物質(zhì)[10-11]。例如，生物類(lèi)黃酮類(lèi)化合物、酚類(lèi)、蛋白酶抑制劑等，具有降糖、降脂、抗氧化和抗腫瘤等功效[12-15]。蕎麥作為一種開(kāi)發(fā)前景廣泛的農(nóng)作物，有關(guān)其抗菌蛋白的研究較少。本研究以一種蕎麥籽粒為材料，提取總蛋白后，根據(jù)蛋白的電荷性質(zhì)以及分子大小范圍對(duì)其進(jìn)行分離純化，得到目的蛋白，對(duì)其相對(duì)分子質(zhì)量和抗真菌活性進(jìn)行研究，以期獲得一種具有抗菌活性的蛋白質(zhì)，為篩選植物源殺菌劑、農(nóng)產(chǎn)品儲(chǔ)藏、新型抗病植株研發(fā)提供一定的理論依據(jù)，同時(shí)有利于推動(dòng)蕎麥產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展，提升對(duì)小雜糧研究的科技創(chuàng)新能力。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

蕎麥籽粒為當(dāng)年種植收獲的‘晉蕎2號(hào)’，由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供;供試菌種為綠色木霉（Trichoderma virid），由山西大學(xué)生物技術(shù)研究所提供;其余試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 試驗(yàn)儀器

Resource S離子交換層析柱、Superdex Peptide HR10/300排阻層析柱、AKTA explorer蛋白純化儀均為GE Healthcare品牌;離心機(jī)為貝克曼公司生產(chǎn);恒溫水浴鍋為上海森地科學(xué)儀器廠生產(chǎn)。

1.3 試驗(yàn)溶液與培養(yǎng)基

液1：浸提緩沖液（20 mmol·L-1 Tris-HCl，pH值為8.0）;

液2：Resource S陽(yáng)離子交換層析平衡緩沖液（20 mmol·L-1 NH4Ac，pH值為4.5）;

液3：Resource S陽(yáng)離子交換層析洗脫緩沖液（20 mmol·L-1 NH4Ac，200 mmol·L-1 NaCl，pH值為4.5）;

液4：分子篩層析平衡緩沖液（20 mmol·L-1 Tris-HCl， 150 mmol·L-1 NaCl，pH值為8.0）。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：取200 g馬鈴薯，加一定量水，料理機(jī)粉碎，煮沸30 min，靜置冷卻后，用厚紗布過(guò)濾，棄渣，在清液中加入葡萄糖20 g，定容至1 L，加入18 g瓊脂，滅菌處理，備用。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 蕎麥籽粒中總蛋白的提取及處理 蕎麥籽粒：恒溫烘箱中干燥→粉碎機(jī)粉碎→過(guò)篩處理，備用。

按照1∶3（g∶V）的比例加入丙酮，在4 ℃冰箱中攪拌脫脂3 h，減壓抽濾后得到濾餅。向?yàn)V餅中加入一定量的乙醚，攪拌3 h后，減壓抽濾得到濾餅。將濾餅低溫干燥，制得蕎麥籽粒的脫脂粉末。取該粉末20 g，加入200 mL液1，4 ℃冰箱中提取8 h后離心，保留上清液，加入硫酸銨，待完全溶解后離心，棄沉淀，向上清液中繼續(xù)加入硫酸銨至80%飽和度，攪拌鹽析8 h后離心，棄上清液保留沉淀。在沉淀中加入一定量的液1，溶解后進(jìn)行攪拌透析，得到蕎麥籽粒的水溶性總蛋白溶液。將該蛋白溶液置于80 ℃水浴鍋中恒溫處理20 min，以去除熱穩(wěn)定性差的雜蛋白，離心后保留上清液，備用。

1.4.2 目的蛋白純化 將1.4.1制得的樣品溶液，在AKTA purifier蛋白純化儀上進(jìn)行分離純化。

將樣品上樣于用液2充分平衡過(guò)的Resource S陽(yáng)離子交換層析柱，流速控制在0.5 mL·min-1，待穿透峰被完全洗脫后，再設(shè)置200 mmol·L-1 NaCl的連續(xù)梯度洗脫，收集各洗脫峰，根據(jù)牛津杯法測(cè)定各洗脫組分的抗真菌活性。

將具有抗真菌活性的Resource S陽(yáng)離子交換層析洗脫組分，分別上樣于Superdex Peptide HR 10/300分子篩層析柱，流速控制在0.5 mmol·L-1，收集各洗脫峰，根據(jù)牛津杯法測(cè)定各洗脫組分的抗真菌活性。

1.4.3 蕎麥籽粒抗真菌蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定? ? 采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法來(lái)測(cè)定蕎麥抗真菌蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量。配制濃度為5%的濃縮膠，濃度為15%的分離膠，考馬斯亮藍(lán)R-250染色，中分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白作為對(duì)照，GeneTools software軟件分析目的蛋白純度。

1.4.4 蕎麥籽?？拐婢鞍椎目拐婢钚詼y(cè)定? ? 采用牛津杯法[16]。將供試菌種點(diǎn)植在PDA培養(yǎng)基中心，28 ℃下培養(yǎng)，待菌落直徑生長(zhǎng)至2 cm時(shí)，在距離菌落邊緣的1 cm處放置牛津杯。以緩沖液作為對(duì)照組，不同濃度的樣品為試驗(yàn)組，經(jīng)過(guò)濾膜（0.22 μm）過(guò)濾除菌處理后，加入牛津杯中。于4 ℃下預(yù)先擴(kuò)散24 h后，轉(zhuǎn)移該培養(yǎng)基到培養(yǎng)箱（28 ℃），72 h后，觀察菌絲生長(zhǎng)情況。

1.4.5 真菌菌絲形態(tài)學(xué)觀察 將1.4.4中培養(yǎng)基直接放置于倒置顯微鏡下，觀察對(duì)照組和試驗(yàn)組作用后的真菌菌絲形態(tài)。

2 結(jié)果與分析

2.1 蕎麥籽?？拐婢鞍准兓?/p>

2.1.1 蕎麥籽粒抗真菌蛋白的離子交換層析 將熱處理后的蕎麥籽粒水溶性總蛋白樣品，上樣于Resource S 陽(yáng)離子交換層析柱，設(shè)置200 mmol·L-1 NaCl的連續(xù)梯度洗脫，分離后得到6個(gè)蛋白洗脫峰（圖1）。經(jīng)過(guò)抗真菌活性測(cè)定，其中峰IV具有活性，收集峰IV進(jìn)行下一步的凝膠過(guò)濾層析。

2.1.2 蕎麥籽?？拐婢鞍椎哪z排阻層析 將Resource S陽(yáng)離子交換層析中得到的洗脫峰IV上樣于Superdex Peptide HR10/300凝膠排阻層析柱，得到4個(gè)蛋白洗脫峰（圖2），同上述方法測(cè)定，峰D具有抗真菌活性，峰D即為目的蛋白。

2.2 蕎麥籽?？拐婢鞍椎南鄬?duì)分子質(zhì)量測(cè)定

SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測(cè)定蕎麥籽?？咕鞍椎南鄬?duì)分子質(zhì)量。經(jīng)過(guò)Resource S陽(yáng)離子交換層析及Superdex Peptide HR10/300凝膠排阻層析分離，從蕎麥籽粒中純化得到一種抗真菌蛋白。由圖3可以看出，該蛋白得到高度純化，在蛋白膠圖中表現(xiàn)出單一條帶，達(dá)到電泳純。以標(biāo)準(zhǔn)蛋白的相對(duì)遷移率為橫坐標(biāo)，相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)，作標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出該抗菌蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量約為8.2 kDa。

2.3 蕎麥籽粒抗真菌蛋白的抗真菌活性分析

抗真菌試驗(yàn)結(jié)果（圖4）表明，與對(duì)照組相比，蕎麥籽?？拐婢鞍讓?duì)綠色木霉生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用，在其濃度分別為0.5，1 μg·mL-1時(shí)，可觀察到在綠色木霉樣品組有明顯的抑菌圈，而且樣品濃度越高，抑菌圈越大，表現(xiàn)出一定的劑量依賴(lài)性。此現(xiàn)象表明，目的蛋白對(duì)該菌株有顯著的抑制作用。

為進(jìn)一步觀察蕎麥籽?？拐婢鞍椎目咕饔?，將對(duì)照組（緩沖液）和試驗(yàn)組1處理后的綠色木霉在倒置顯微鏡下進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。結(jié)果表明，對(duì)照組的菌絲生長(zhǎng)沒(méi)有受到抑制，菌絲光滑均勻（圖5-A），而試驗(yàn)組的菌絲生長(zhǎng)受到抑制，出現(xiàn)停滯，菌絲頂端分支加?。▓D5-C）。將菌絲在顯微鏡下放大一定倍數(shù)后，可觀察到對(duì)照組的菌絲形態(tài)正常（圖5-B），而試驗(yàn)組的菌絲頂端膨大，產(chǎn)生不規(guī)則泡狀結(jié)構(gòu)（圖5-D），菌絲原生質(zhì)凝縮，出現(xiàn)片段化結(jié)構(gòu)（圖5-E）。

3 結(jié)論與討論

在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和食品工業(yè)中，長(zhǎng)期使用化學(xué)類(lèi)農(nóng)藥或食品防腐劑，可能會(huì)造成農(nóng)作物產(chǎn)生耐藥性、污染環(huán)境和降低食品安全性等問(wèn)題，對(duì)人類(lèi)健康和環(huán)境可持續(xù)發(fā)展產(chǎn)生不利的影響。植物是抗菌活性物質(zhì)的天然寶庫(kù)，植物源抗菌蛋白來(lái)源范圍較廣，具有廣譜性、安全性高、對(duì)環(huán)境友好的特點(diǎn)。在日常使用中，抗菌蛋白溶解性更高，易溶于水，利于發(fā)酵產(chǎn)品的提純和精制，可提高產(chǎn)品純度和質(zhì)量。另外，抗菌蛋白的分子量小，具有更好的熱穩(wěn)定性和低致敏性，適用范圍更廣。

筆者以蕎麥作為研究對(duì)象，通過(guò)丙酮浸提、硫酸銨鹽析提取苦蕎籽?？偟鞍?。2次硫酸銨鹽析沉淀蛋白，既能夠除掉提取過(guò)程中的雜蛋白，又能最大限度地保留目的蛋白，保證了所得蕎麥籽粒總蛋白的品質(zhì)。抗菌蛋白研究的最大問(wèn)題就是純化，所以純化手段通常會(huì)聯(lián)合運(yùn)用多種層析手段，本研究經(jīng)過(guò)2步分離純化，即陽(yáng)離子交換層析和分子篩層析，最后獲得純度較高的蕎麥籽?？拐婢鞍?，通過(guò)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳試驗(yàn)證明，目的蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量為8.2 kDa。同時(shí)，抗真菌活性試驗(yàn)結(jié)果表明，該抗真菌蛋白對(duì)綠色木霉菌的生長(zhǎng)有明顯的抑制作用，并且呈現(xiàn)一定的劑量依賴(lài)性。形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果也證實(shí)，蕎麥籽?？拐婢鞍讓?dǎo)致綠色木霉的菌絲生長(zhǎng)受到明顯抑制。推測(cè)原因可能是抗菌蛋白具有一定的陽(yáng)離子特性，破壞了真菌的細(xì)胞膜，細(xì)胞內(nèi)容物滲出，細(xì)胞內(nèi)外的滲透壓發(fā)生改變，最終導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生衰亡。本研究建立的提取、純化方法較為簡(jiǎn)單，產(chǎn)物純度較高，但是在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實(shí)踐中，環(huán)境變化較大，要求植物源滅菌物質(zhì)具有極強(qiáng)的耐熱、耐凍、耐旱、耐酸堿等穩(wěn)定性能，這還有待于開(kāi)展更多的基礎(chǔ)研究。

參考文獻(xiàn)：

[1] A KAR， A KAR TK. Antimicrobial proteins and their importance in immunity[J]. Balkesr Health Sciences Journal， 2017， 6（2）： 82-86.

[2] BISHT A， THAPLIYAL M， SINGH A. Screening and isolation of antibacterial proteins/peptides from seeds of millets[J]. International Journal of Current Pharmaceutical Research， 2016， 8（3）： 96-99.

[3] 袁素素， 張瑋瑋， 王財(cái)成， 等. 望江南種子SU5抗菌蛋白的純化、抑菌機(jī)制及穩(wěn)定性研究[J]. 河南農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2019， 48（8）： 81-87.

[4] 張耀， 王財(cái)成， 袁素素， 等. 芝麻菜種子抗菌蛋白的純化及其抗菌活性[J]. 食品工業(yè)科技， 2018， 39（20）： 92-97.

[5] 肖松華， 趙君， 劉劍光， 等. 轉(zhuǎn)天麻抗真菌蛋白基因提高棉花對(duì)黃萎病抗性[J]. 作物學(xué)報(bào)， 2016， 42（2）： 212-221.

[6] 范昱， 丁夢(mèng)琦， 張凱旋， 等. 蕎麥種質(zhì)資源概況[J]. 植物遺傳資源學(xué)報(bào)， 2019， 20（4）： 813-828.

[7] 李秀蓮， 趙建棟， 史興海， 等. 山西蕎麥科研簡(jiǎn)史[J]. 中國(guó)科技信息， 2018（13）： 106， 108.

[8] 林汝法. 中國(guó)蕎麥[M]. 北京： 中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社， 1994： 356-357.

[9] 梁嘯天， 張春華， 倪娜， 等. 蕎麥營(yíng)養(yǎng)功能與產(chǎn)品開(kāi)發(fā)前景[J]. 特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)植物， 2020， 23（9）： 21-23， 32.

[10] 吳立根， 屈凌波， 王岸娜， 等. 蕎麥營(yíng)養(yǎng)功能特性及相關(guān)食品開(kāi)發(fā)研究進(jìn)展[J]. 糧油食品科技， 2018， 26（3）： 41-44.

[11] 侯振平， 鄭霞， 陳青， 等. 金蕎麥的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、提取物生物活性及其在動(dòng)物生產(chǎn)中的應(yīng)用[J]. 動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)， 2021， 33（6）： 3019-3027.

[12] 王菲， 李穎， 簡(jiǎn)天琪， 等. 黑苦蕎麥黃酮的提取及體外抗氧化活性研究[J]. 應(yīng)用化工， 2020， 49（11）： 2795-2799.

[13] 崔曉東， 范鑫， 閆紅， 等. 蕎麥蛋白酶抑制劑α-螺旋對(duì)抗腫瘤活性的影響[J]. 山西大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）， 2021， 44（4）： 815-823.

[14] 杜藝， 崔彤霞， 馬文潔， 等. 蕎麥黃酮通過(guò)下調(diào)lncRNA DLX6-AS1抑制高糖誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞炎癥因子表達(dá)和纖維化[J]. 中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合腎病雜志， 2021， 22（1）： 37-40.

[15] 李紅麗， 文丹丹， 周美亮， 等. 金蕎麥抑瘤活性成份提取及作用機(jī)制研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)臨床藥理學(xué)與治療學(xué)， 2019， 24（7）： 833-840.

[16] 周芳， 熊海濤， 張江， 等. 牛津杯法測(cè)定抗菌肽對(duì)四種有害微生物的抑制效果[J]. 飼料工業(yè)， 2018， 39（6）： 48-51.