林丹櫻 武澤凱 于斌 黃黎琳 張瀟 屈軍樂(lè)

(深圳大學(xué)生物醫(yī)學(xué)光子學(xué)研究中心/物理與光電工程學(xué)院,光電子器件與系統(tǒng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,深圳 518060)

單分子定位顯微(single molecule localization microscopy,SMLM)成像技術(shù)利用熒光分子的稀疏發(fā)光、探測(cè)及定位,實(shí)現(xiàn)了納米級(jí)空間分辨率的超分辨成像.為了提高其時(shí)間分辨率,需要提高同時(shí)發(fā)光的熒光分子密度.但隨著分子密度的提高,不同分子的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)(point spread function,PSF)在探測(cè)器上將發(fā)生嚴(yán)重的重疊現(xiàn)象,導(dǎo)致空間分辨率降低,尤其是在進(jìn)行三維SMLM 成像時(shí).為了解決這一問(wèn)題,本文提出了一種基于正交像散的高密度三維單分子定位超分辨成像方法,并對(duì)該方法進(jìn)行分析和數(shù)值模擬研究.該方法的核心是在單分子定位顯微鏡中將采集的熒光分成兩束成像在同一個(gè)探測(cè)器的兩個(gè)區(qū)域,并在兩個(gè)通道中各引入一個(gè)光學(xué)參數(shù)相同但取向相互正交的柱透鏡,實(shí)現(xiàn)對(duì)同一個(gè)熒光分子正負(fù)兩個(gè)像散PSF 圖像的同時(shí)探測(cè),然后建立該成像過(guò)程的線性投影模型,利用壓縮感知算法求解出熒光分子的三維定位信息.結(jié)果表明,由于兩個(gè)正交柱透鏡產(chǎn)生的一組正交像散PSF 對(duì)作為一個(gè)分子的系統(tǒng)響應(yīng)時(shí)具有較低的相關(guān)性,該方法的高密度三維定位準(zhǔn)確性可顯著優(yōu)于采用單個(gè)柱透鏡的傳統(tǒng)像散方法,且離焦程度越大兩個(gè)像散PSF 的形狀差異越大,這種準(zhǔn)確定位的優(yōu)勢(shì)就越明顯.

1 引言

近十幾年來(lái),以隨機(jī)光學(xué)重建顯微[1?4]和光激活定位顯微[5]為代表的單分子定位顯微(single molecule localization microscopy,SMLM)成像技術(shù)繞過(guò)了光學(xué)衍射極限對(duì)成像分辨率的限制(約為觀察波長(zhǎng)的1/2),實(shí)現(xiàn)了納米級(jí)空間分辨率的超分辨成像,已被應(yīng)用于生命科學(xué)研究并推動(dòng)了相關(guān)領(lǐng)域的發(fā)展.SMLM 利用熒光分子的閃爍,將空間上原本相互重疊的分子像斑—即成像系統(tǒng)的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)(point spread function,PSF)—在時(shí)間上進(jìn)行分離,進(jìn)而通過(guò)對(duì)稀疏PSF 的探測(cè)和定位來(lái)重構(gòu)超分辨圖像,因此獲得一幅超分辨圖像通常需要采集數(shù)萬(wàn)幀原始圖像,時(shí)間分辨率很低.

采用高密度成像方法可顯著提高時(shí)間分辨率.所謂高密度成像,是指以更高的熒光分子密度記錄原始圖像,從而減少重構(gòu)一幅超分辨圖像所需的原始圖像數(shù)量.但這樣做同時(shí)增加了單幀圖像中PSF 之間的重疊程度,需要借助更復(fù)雜的算法來(lái)實(shí)現(xiàn)單分子定位.例如多點(diǎn)擬合算法采用多個(gè)PSF 模型來(lái)擬合,從而提高對(duì)重疊分子的識(shí)別能力和定位精度[6];壓縮感知算法利用分子定位信息滿足稀疏先驗(yàn)條件和探測(cè)過(guò)程的非自適應(yīng)線性投影關(guān)系,采用最優(yōu)化方法來(lái)重構(gòu)信號(hào)[7].目前這些方法在高密度二維單分子定位超分辨成像中已經(jīng)得到了較好的應(yīng)用.

然而,高密度三維單分子定位超分辨成像至今仍相對(duì)困難.這是因?yàn)?三維PSF 不僅在軸向上變化緩慢并呈對(duì)稱分布,而且體積的擴(kuò)展使得彼此間更容易發(fā)生重疊,導(dǎo)致軸向定位精度低甚至難以定位.目前已有一些方法可以一定程度上實(shí)現(xiàn)高密度三維單分子定位成像.例如,2012 年Babcock 等[8]利用單個(gè)柱透鏡產(chǎn)生的像散破壞三維PSF 的軸向?qū)ΨQ性,并采用多點(diǎn)擬合算法進(jìn)行定位;2014 年Gu等[9]通過(guò)同時(shí)采集三維PSF 的兩個(gè)不同焦面,并結(jié)合壓縮感知算法進(jìn)行定位;同年,Min 等[10]則將兩種方法進(jìn)行結(jié)合,進(jìn)一步提高了軸向定位精度.這幾種方法都較好地實(shí)現(xiàn)了高密度三維單分子定位并提高了定位精度,但由于單個(gè)分子的三維像散PSF 離焦面較遠(yuǎn)時(shí)其形狀變化變得緩慢,這使得定位精度僅能在焦面附近保持較高水平.2015年,Huang 等[11]采用三個(gè)焦面互相錯(cuò)開(kāi)的柱透鏡對(duì)同一個(gè)PSF 產(chǎn)生不同程度的像散,并結(jié)合一種快速無(wú)偏離連續(xù)空間壓縮感知算法,較好地解決了軸向定位精度一致性的問(wèn)題.然而,需要同時(shí)對(duì)三個(gè)焦面錯(cuò)開(kāi)的三維PSF 進(jìn)行有效探測(cè)使得軸向范圍受到了嚴(yán)格的限制,這種三焦面方法的軸向定位范圍要小于傳統(tǒng)像散法.針對(duì)高密度三維單分子定位存在的上述問(wèn)題,本文提出了一種基于正交像散的高密度三維單分子定位超分辨成像方法,并對(duì)其進(jìn)行了詳細(xì)的分析和數(shù)值模擬研究.

2 成像方法

2.1 成像光路和正交像散原理

圖1(a)為正交像散單分子定位成像方法的光路示意圖.該方法與傳統(tǒng)基于單個(gè)柱透鏡的像散三維單分子定位成像方法[3]相比,最主要的不同之處在于顯微鏡采集的熒光信號(hào)被均分成傳播方向互相垂直的兩束,分別經(jīng)兩個(gè)探測(cè)通道后成像于同一個(gè)EMCCD 相機(jī)的兩個(gè)不同區(qū)域.圖1(a)中,可調(diào)光闌A 為兩個(gè)方向獨(dú)立可調(diào)的矩形光闌,位于顯微鏡成像透鏡的后焦面,用于調(diào)節(jié)視場(chǎng)大小.兩個(gè)探測(cè)通道中各包含有一個(gè)長(zhǎng)焦距(1000 mm)柱透鏡,兩者型號(hào)和參數(shù)相同但取向相互正交,用于實(shí)現(xiàn)對(duì)同一個(gè)熒光分子的正負(fù)兩種相反的像散.這樣,對(duì)于同一個(gè)熒光分子,當(dāng)其處于不同軸向深度z時(shí),將探測(cè)到一組正交像散PSF 圖像對(duì)(如圖1(b)所示),同時(shí)用于三維定位.

與采用單個(gè)柱透鏡的傳統(tǒng)像散法[3]類似,正交像散法成像時(shí)在采集實(shí)際樣品圖像之前需要先利用稀疏分布的熒光珠樣品采集圖像并制作校準(zhǔn)曲線,即對(duì)不同軸向深度z處的PSF 在x和y兩個(gè)方向的寬度進(jìn)行標(biāo)定.不同的是,正交像散成像需要4 條校準(zhǔn)曲線,對(duì)應(yīng)兩個(gè)成像通道的兩個(gè)方向,如圖1(c)所示.其中散點(diǎn)數(shù)據(jù)為利用二維非對(duì)稱高斯模型對(duì)成像系統(tǒng)(采用100×/NA1.45 油浸物鏡)采集的不同深度熒光珠(直徑100 nm,發(fā)射中心波長(zhǎng)680 nm)的正交像散PSF 圖像進(jìn)行擬合獲得的x和y方向的PSF 寬度wx和wy(取2 倍標(biāo)準(zhǔn)差),實(shí)線為多項(xiàng)式擬合[3]結(jié)果,擬合參數(shù)在后續(xù)數(shù)據(jù)處理時(shí)用于待測(cè)樣品的三維定位.值得指出的是,雖然實(shí)際成像系統(tǒng)中兩通道的焦面(即wx=wy處)很難做到完全一致,但與多焦面成像方法不同的是,這種錯(cuò)開(kāi)并不是必須的,因此原則上采用這種方法是可以無(wú)需犧牲成像深度的.

圖1 正交像散單分子定位成像光路和原理示意圖 (a)成像光路示意圖;(b)正交像散PSF 圖像對(duì);(c)正交像散校準(zhǔn)曲線.OL,物鏡;DM,二向色鏡;EF,發(fā)射濾光片;BS,分束器;A,光闌;CL,柱透鏡;L,透鏡;M,平面鏡;EMCCD,電子倍增電荷耦合器件Fig.1.Schematic diagram of the optical path and principle of single molecule localization imaging based on orthogonal astigmatism:(a) Optical path;(b) orthogonal astigmatic PSFs;(c) calibration curves.OL,objective lens;DM,dichroic mirror;EF,emission filter;BS,beam splitter;A,aperture;CL,cylindrical lens;L,lens;M,mirror;EMCCD,electron-multiplying charge-coupled device.

2.2 分子定位及圖像重建方法

通過(guò)建立上述正交像散成像過(guò)程的線性投影模型,可利用壓縮感知算法求解熒光分子的三維定位信息.本文所采用的壓縮感知算法是在TVSTORM算法[12]的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)的.

如前所述,對(duì)于樣品中的一個(gè)熒光分子,EM CCD 將采集到一組正交像散PSF 圖像對(duì).因此,設(shè)樣品中N個(gè)熒光分子組成的“源信號(hào)”X如(1)式所示,則雙通道圖像μ(μ=[μ1,μ2])為X與兩個(gè)PSF 的卷積,可用(2)式表示:

其中θL=(θx,θy,θz)和θI分別為第i個(gè)分子的三維坐標(biāo)和強(qiáng)度;Θ為所有N個(gè)熒光分子的這4 個(gè)參數(shù)的組合;θb為背景噪聲;k=1,2 分別對(duì)應(yīng)通道I 和通道II;(u,v)為各通道圖像的像素坐標(biāo);Φk為對(duì)應(yīng)通道k的觀測(cè)矩陣,代表位于θL的熒光分子對(duì)通道k圖像的貢獻(xiàn),可根據(jù)正交像散校準(zhǔn)曲線構(gòu)造.因此,單分子定位的任務(wù),就是利用上述模型從實(shí)際探測(cè)到的雙通道圖像y(y=[y1,y2])中求解出Θ.考慮到EMCCD 對(duì)較弱的單分子熒光的探測(cè)滿足泊松分布,TVSTORM 算法采用泊松噪聲模型來(lái)構(gòu)建損失函數(shù)[12].這里,針對(duì)正交像散成像,將泊松損失函數(shù)L(y|X)定義為

其中,P代表概率,yk和μk分別為通道k的實(shí)際圖像和根據(jù)(2)式計(jì)算得到的“理想”圖像,0<β ?1,用于提高對(duì)數(shù)項(xiàng)的穩(wěn)定性.

通過(guò)最小化該損失函數(shù),可求解(逼近)源信號(hào)X的參數(shù)Θ,重構(gòu)出超分辨圖像.TVSTORM算法的迭代過(guò)程主要包含兩層[12]:第一層是從圖像中尋找到一個(gè)新的熒光分子并初步確定其位置及強(qiáng)度,第二層是進(jìn)一步優(yōu)化該分子的定位和強(qiáng)度.針對(duì)正交像散法得到的雙通道圖像.第一層迭代的具體做法是在第n+1 次迭代中,利用第n次迭代得到的已有熒光分子信息(記為Θ(n))和觀測(cè)矩陣Φ(Φ=[Φ1,Φ2])生成雙通道理想圖像μ,然后通過(guò)最小化泊松損失函數(shù)的一階泰勒近似(如(4)式所示,其中S為雙通道圖像的圖像尺寸),從其中一個(gè)通道(k(n+1))的圖像中定位到一個(gè)新的熒光分子,獲得其位置信息,并通過(guò)最小二乘準(zhǔn)則估計(jì)其強(qiáng)度(如(5)式所示),從而得到第n+1 次迭代的結(jié)果Θ(n+1),由第二層的迭代進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化.

第二層采用迭代梯度下降方法,通過(guò)最小化(3)式的雙通道圖像泊松損失函數(shù)獲得Θ(n+1)的極大似然估計(jì)來(lái)進(jìn)一步優(yōu)化定位結(jié)果.其中,下降方向通過(guò)分別計(jì)算損失函數(shù)在x,y,z和I這4 個(gè)方向的偏導(dǎo)數(shù)來(lái)確定,下降步長(zhǎng)采用回溯線搜索方法來(lái)確定,以加快迭代收斂速度.精煉后的熒光分子信息Θ(n+1)返回第一層并進(jìn)入下一次迭代,當(dāng)新增熒光分子的強(qiáng)度低于預(yù)設(shè)閾值時(shí)迭代終止.

3 結(jié)果與討論

3.1 PSF 相關(guān)性分析

柱透鏡像散法能夠?qū)崿F(xiàn)單分子三維定位的基本原理,是基于不同軸向深度的熒光分子的二維PSF 呈現(xiàn)為不同取向和不同橢圓度的橢圓.因此,兩個(gè)不同熒光分子的PSF 區(qū)別越明顯,就越容易被準(zhǔn)確定位和分辨.可通過(guò)計(jì)算兩個(gè)PSF 之間的相關(guān)系數(shù)來(lái)半定量地表征兩個(gè)分子能夠被準(zhǔn)確定位的概率[10].

圖2 以偽彩圖的形式直觀地展示了位于(0,0,z1)和(dx,dy,z2)的兩個(gè)熒光分子PSF 的相關(guān)系數(shù),偽彩色從藍(lán)到紅對(duì)應(yīng)相關(guān)系數(shù)從0 到1.圖2(a)對(duì)應(yīng)傳統(tǒng)采用單個(gè)柱透鏡的像散成像,圖2(b)對(duì)應(yīng)正交像散成像.值得注意的是,對(duì)于正交像散,每個(gè)熒光分子的PSF 實(shí)際上是一組正交像散PSF圖像對(duì)(如圖1(b)).圖2 中第1—3 列為兩個(gè)熒光分子位于同一深度(z1=z2=–550,0 和550 nm)但橫向錯(cuò)開(kāi)不同距離時(shí)的情況,第4 列為兩個(gè)熒光分子橫向位置相同(即dx=dy=0)但分別位于不同深度(z1,z2)時(shí)的結(jié)果.

圖2 PSF 相關(guān)系數(shù) (a)傳統(tǒng)像散法;(b)正交像散法Fig.2.Mutual correlation values between PSFs:(a) Traditional astigmatic method;(b) orthogonal astigmatic method.

可以看出,當(dāng)離焦較遠(yuǎn)時(shí),兩種成像模式得到的PSF 相關(guān)性有很大差異.采用傳統(tǒng)像散法時(shí),在焦面以下550 nm 處,x方向錯(cuò)開(kāi)了將近2 μm 的兩個(gè)PSF 相似程度依然較高,難以準(zhǔn)確定位;反之,在焦面以上550 nm 處的兩個(gè)PSF 則是在y方向相似程度較高不易定位.這與之前文獻(xiàn)中關(guān)于像散法在兩個(gè)方向上分辨能力不同的報(bào)道[13]是符合的,是由加入柱透鏡后兩個(gè)方向的實(shí)際焦面位置不同導(dǎo)致的.但當(dāng)采用正交像散成像方法時(shí),這種情況得到了很大程度的改善,即不管是在焦面以上還是以下,PSF 的相關(guān)性在x和y兩個(gè)方向變得更加對(duì)稱,且總體要明顯低于傳統(tǒng)像散法,說(shuō)明采用這種方法在離焦較遠(yuǎn)時(shí)仍能得到相似程度較低的PSF 對(duì),從而為準(zhǔn)確定位距離較近的熒光分子提供了條件,提高了系統(tǒng)的高密度定位能力.

3.2 數(shù)值模擬實(shí)驗(yàn)

為定量評(píng)估該正交像散成像方法的性能,基于圖1(c)中的校準(zhǔn)曲線進(jìn)行數(shù)值模擬實(shí)驗(yàn)研究.在模擬實(shí)驗(yàn)中,利用校準(zhǔn)曲線產(chǎn)生一系列三維位置隨機(jī)的PSF 來(lái)模擬實(shí)驗(yàn)中采集的原始圖像.圖3(a)所示為模擬實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生的正交像散成像的單幀雙通道閃爍圖像,圖像大小32×32 像素/通道,像素尺寸160 nm×160 nm,熒光分子密度1/μm2,單個(gè)PSF 的探測(cè)光子數(shù)為500/通道,并添加泊松噪聲.圖中黑色小叉表示隨機(jī)生成的“分子”的橫向位置,其軸向深度則體現(xiàn)在PSF 的形狀上.作為對(duì)比的傳統(tǒng)像散法模擬時(shí)采用通道I 的閃爍圖像,但光子數(shù)設(shè)置為1000.

圖3 單幀雙通道圖像及定位結(jié)果 (a)單幀雙通道圖像;(b)正交像散法定位結(jié)果;(c)傳統(tǒng)像散法定位結(jié)果Fig.3.Single frame image and localization results:(a) Single frame of two-channel image;(b) localization results using orthogonal astigmatic method;(c) localization results using traditional astigmatic method.

3.2.1 三維定位結(jié)果的直觀比較

利用前述算法對(duì)該單幀閃爍圖像中的PSF 對(duì)進(jìn)行定位,結(jié)果如圖3(b)所示,其中兩個(gè)圖像分別顯示了定位結(jié)果與兩個(gè)通道的原始圖像之間的對(duì)比.作為對(duì)照,圖3(c)給出了采用傳統(tǒng)像散成像的定位結(jié)果.圖中黑色小叉仍代表模擬圖像中“分子”的真實(shí)橫向位置,白色小橢圓中心代表橫向定位結(jié)果,其與黑色小叉重合的程度直觀表示橫向定位的準(zhǔn)確性;虛線黑色橢圓和實(shí)線白色橢圓分別代表根據(jù)已知的軸向深度和軸向定位結(jié)果得到的PSF 形狀(依據(jù)校準(zhǔn)曲線),兩者的相似程度直觀表示軸向定位的準(zhǔn)確性.對(duì)比圖3 結(jié)果可以看出,采用正交像散法可顯著提高三維定位的準(zhǔn)確性,尤其是在PSF 重疊程度較大(即局部密度較高,如圖3(c)中黑色箭頭所指區(qū)域),或PSF 橢圓度較高的情況下(即離焦較遠(yuǎn),如圖3(c)中白色箭頭所指),準(zhǔn)確定位的優(yōu)勢(shì)更加明顯,說(shuō)明該方法適用于處理高密度數(shù)據(jù),且對(duì)于離焦較遠(yuǎn)的分子會(huì)有更好的定位效果,與前面的分析是一致的.

3.2.2 不同軸向深度定位結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析

為了定量分析定位性能,可產(chǎn)生若干幀模擬閃爍圖像并重復(fù)上述定位過(guò)程,計(jì)算各“分子”的定位坐標(biāo)與真實(shí)坐標(biāo)之間的均方根誤差(root mean squared error,RMSE),以定量描述定位的準(zhǔn)確性.計(jì)算公式如下:

其中,j=x,y,z,N表示定位得到的分子總數(shù);(θxi,θyi,θzi)表示第i個(gè)分子的定位坐標(biāo);(θxi0,θyi0,θzi0)表示其真實(shí)坐標(biāo).

圖4 給出了位于不同軸向深度的“分子”沿各方向定位的RMSE 值,并與傳統(tǒng)像散法定位結(jié)果進(jìn)行對(duì)比.模擬實(shí)驗(yàn)中同一幀閃爍圖像不同“分子”的橫向位置設(shè)置為隨機(jī),但軸向深度設(shè)置為相同(如200 nm),熒光分子密度固定為1/μm2,每個(gè)深度處累計(jì)定位1000 幀.從圖4 可以明顯看出,采用正交像散法相比傳統(tǒng)像散法,離焦“分子”在3 個(gè)方向的定位準(zhǔn)確性均有顯著提高,尤其是焦面以下x方向定位準(zhǔn)確性和焦面以上y方向定位準(zhǔn)確性的提高,與前面的PSF 相關(guān)性分析是完全符合的,進(jìn)一步驗(yàn)證了該方法對(duì)于離焦較遠(yuǎn)的分子會(huì)有更好的定位效果的結(jié)論.除了RMSE,圖4 還給出了定位召回率和錯(cuò)誤率的比較,同樣可以看出正交像散法要明顯優(yōu)于傳統(tǒng)像散法.

圖4 不同軸向深度分子定位準(zhǔn)確性、召回率和錯(cuò)誤率比較Fig.4.Comparison of localization accuracy,recall rate and error rate of molecules with different axial depths.

3.2.3 不同熒光分子密度定位結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析

此外,為了更好地表征正交像散法對(duì)于高密度數(shù)據(jù)的定位性能,圖5 給出了不同分子密度下的各方向定位的RMSE 值及定位召回率和錯(cuò)誤率的比較.其中,模擬實(shí)驗(yàn)中不同“分子”的三維位置均設(shè)置為隨機(jī),每個(gè)分子密度下累計(jì)定位1000 幀.從圖5 可以明顯看出,與傳統(tǒng)像散法相比,正交像散法在分子密度越高時(shí)優(yōu)勢(shì)越明顯,說(shuō)明該方法適用于高密度數(shù)據(jù)的處理.

圖5 不同密度分子的定位準(zhǔn)確性、召回率和錯(cuò)誤率比較Fig.5.Comparison of localization accuracy,recall rate and error rate of molecules with different densities.

3.2.4 模擬樣品的超分辨圖像

為了更直觀地展示正交像散法的超分辨成像效果,以一些特定結(jié)構(gòu)作為模擬樣品,按照前述相同方法產(chǎn)生正交像散閃爍圖像進(jìn)行定位和超分辨重構(gòu).圖6 給出了螺旋線的三維定位超分辨圖像.其中,圖6(a)和圖6(b)分別為正交像散和傳統(tǒng)像散兩種方法得到的結(jié)果.螺旋線半徑為1200 nm,相鄰層軸向距離為400 nm.從圖6 可以直觀地看出,采用傳統(tǒng)像散法在遠(yuǎn)離焦面時(shí),在螺旋線以外存在很多不準(zhǔn)確的定位點(diǎn),而采用正交像散法則能在整個(gè)軸向探測(cè)范圍內(nèi)更加準(zhǔn)確地還原出螺旋線的結(jié)構(gòu).

圖6 螺旋線的模擬成像結(jié)果 (a)正交像散法;(b)傳統(tǒng)像散法Fig.6.Simulated imaging results of a helix structure:(a) Orthogonal astigmatic method;(b) traditional astigmatic method.

圖7 所示的是6 組平行線的模擬超分辨成像結(jié)果.其中,x方向和y方向平行線的間距從小到大分別為50,100 和150 nm,平行線的軸向深度連續(xù)變化,如圖中偽彩色所示.圖7(a)和圖7(b)分別對(duì)應(yīng)正交像散和傳統(tǒng)像散兩種方法.從圖7 可以看出,兩種方法都能夠清晰地分辨出間距150 nm的平行線,但隨著間距越來(lái)越小,在軸向深度離焦較遠(yuǎn)時(shí),傳統(tǒng)像散法的圖像開(kāi)始變得模糊,而正交像散法則依然可以清楚地分辨出兩條平行線.圖7(c)—圖7(f)是距離50 nm 的兩組平行線的放大圖.可以直觀地看出,采用傳統(tǒng)像散法在軸向深度約大于400 nm 時(shí),y方向的分辨能力開(kāi)始變得很差,因此x方向的平行線變得幾乎無(wú)法分辨(圖7(d)綠色方框所示),而焦面另一側(cè)的情況則剛好相反(圖7(f)黃色方框所示).但是采用正交像散法時(shí),x和y兩個(gè)方向上均能清楚地分辨出兩條平行線(圖7(c)和圖7(e)中對(duì)應(yīng)的方框所示).對(duì)方框區(qū)域內(nèi)的定位結(jié)果進(jìn)行y方向或x方向(即垂直于直線方向)的雙峰擬合,可得到正交像散成像時(shí)兩組平行線雙峰間距分別為46 和48 nm,與模擬時(shí)設(shè)置的真實(shí)值50 nm 很接近,可見(jiàn)正交像散法在離焦較遠(yuǎn)的情況下仍能準(zhǔn)確得到三維定位信息.

圖7 平行線的模擬成像結(jié)果 (a),(c),(e)正交像散法;(b),(d),(f)傳統(tǒng)像散法;(c)—(f)間距最小(50 nm)平行線的放大圖;(g)圖(c)和(d)的綠色方框區(qū)域的強(qiáng)度分布曲線;(h)圖(e)和(f)的黃色方框區(qū)域的強(qiáng)度分布曲線.標(biāo)尺大小:(a),(b) 500 nm;(c)—(f) 200 nmFig.7.Simulated imaging results of parallel line structures:(a),(c),(e) Orthogonal astigmatic method;(b),(d),(f) traditional astigmatic method;(c)–(f) zoomed-in view of the minimum spacing (50 nm) lines;(g) cross-sectional profiles of the green boxes in panel (c) and (d);(h) cross-sectional profiles of the yellow boxes in panel (e) and (f).Scale bars:(a),(b) 500 nm;(c)–(f) 200 nm.

3.2.5 雙通道圖像偏差的影響分析

在實(shí)際的成像實(shí)驗(yàn)中,盡管在光路調(diào)節(jié)上可以盡量保證兩個(gè)成像通道的一致性,但兩個(gè)通道采集到的圖像之間仍不可避免地會(huì)存在偏差,包括橫向偏移、旋轉(zhuǎn)和縮放等,從而影響正交像散成像三維定位的準(zhǔn)確性.圖8 給出了雙通道圖像偏差對(duì)正交像散法橫向和軸向定位RMSE 值的影響分析,以及經(jīng)過(guò)圖像配準(zhǔn)之后的定位重構(gòu)結(jié)果.其中圖8(a)分別為通道II 圖像相比通道I 圖像存在不同橫向偏移量Δx、旋轉(zhuǎn)角度α和縮放倍數(shù)Γ時(shí)xy方向和z方向定位的RMSE 值.熒光分子密度固定為1/μm2,軸向深度在–600—600 nm 之間變化.可見(jiàn),雙通道圖像之間的這幾種偏差,都會(huì)導(dǎo)致定位精度不同程度的降低.因此,兩個(gè)成像通道采集的圖像需要先進(jìn)行配準(zhǔn),以盡量消除兩通道圖像之間的不匹配導(dǎo)致的定位精度下降.這里采用常用的傅里葉-梅林變換法對(duì)雙通道圖像進(jìn)行配準(zhǔn)[10,11],并對(duì)配準(zhǔn)效果進(jìn)行模擬分析.圖8(b)為一組存在雙通道圖像偏差并經(jīng)過(guò)配準(zhǔn)后的正交像散成像模擬結(jié)果,其中雙通道原始圖像偏差設(shè)為Δx=320 nm,α=2°,Γ=0.95.利用雙通道熒光珠圖像進(jìn)行配準(zhǔn),得到配準(zhǔn)參數(shù)分別為Δx'=–352 nm 和Δy'=–41 nm,α'=–1.9125°,Γ'=1/0.9505.作為對(duì)比,圖8(c)給出了雙通道圖像不存在任何偏差時(shí)的模擬成像結(jié)果.可以看出,存在雙通道偏差的圖像數(shù)據(jù)配準(zhǔn)后仍能很好地重構(gòu)出超分辨結(jié)構(gòu),但由于圖像配準(zhǔn)后仍有一定誤差(如橫向偏移配準(zhǔn)精度約為30—40 nm),因此與理想無(wú)偏差情況相比,定位效果略有下降.從圖8(a)的定量結(jié)果還可以看出,配準(zhǔn)誤差導(dǎo)致的RMSE 值的改變幅度已經(jīng)很小,而采用具有更高配準(zhǔn)精度的方法還可以進(jìn)一步減少雙通道圖像偏差對(duì)定位的影響.

圖8 雙通道圖像偏差的影響和有無(wú)圖像偏差及配準(zhǔn)的模擬成像結(jié)果比較 (a)定位準(zhǔn)確性隨橫向偏移量、旋轉(zhuǎn)角度和縮放倍率的變化;(b)有偏差雙通道圖像配準(zhǔn)后的模擬成像結(jié)果;(c)無(wú)偏差雙通道圖像的模擬成像結(jié)果.標(biāo)尺大小:500 nmFig.8.Influence of deviation between two channel images,and comparison of simulated imaging results with and without image deviation and registration:(a) Localization accuracy versus lateral offset,rotation angle and scaling ratio;(b) simulated image obtained after registration of biased dual channel images;(c) simulated image of unbiased dual channel images.Scale bars:500 nm.

4 總結(jié)與展望

針對(duì)高密度三維單分子定位中PSF 重疊導(dǎo)致的定位能力下降的問(wèn)題,發(fā)展了一種基于正交像散的高密度三維單分子定位超分辨成像方法.詳細(xì)闡述了該正交像散單分子定位成像方法的原理和實(shí)現(xiàn)過(guò)程,并對(duì)該成像方法進(jìn)行了分析和數(shù)值模擬研究.結(jié)果表明,利用該方法可以在無(wú)需犧牲成像深度的前提下顯著提高離焦熒光分子的三維定位精度.其根本原因在于,采用正交像散法時(shí)一個(gè)熒光分子對(duì)應(yīng)一組正交像散PSF 圖像對(duì),離焦情況下這一組自身形狀差異很大的PSF 對(duì)作為一個(gè)整體,與另一個(gè)分子的PSF 對(duì)之間具有比單獨(dú)的PSF圖像更低的相關(guān)性.換句話說(shuō),采用兩個(gè)取向相互正交的柱透鏡,可以一定程度上抵消x和y方向的兩個(gè)焦面分別位于成像焦面兩側(cè)對(duì)單分子定位的影響,從而提高高密度三維定位能力.

在實(shí)際的成像實(shí)驗(yàn)中,兩個(gè)成像通道之間總是不可避免地會(huì)存在偏差,因此除了在光路上盡量保證兩個(gè)成像通道的一致性之外,對(duì)于兩個(gè)通道采集到的圖像通常需要先進(jìn)行配準(zhǔn),以盡量消除兩通道圖像的不匹配導(dǎo)致的定位精度下降.在此基礎(chǔ)上,考慮兩個(gè)成像通道之間引入的不同像差,以及因成像在探測(cè)器的不同區(qū)域而導(dǎo)致的微小差別,分區(qū)域進(jìn)行配準(zhǔn),將有利于進(jìn)一步提升雙通道圖像之間的配準(zhǔn)精度,從而消除實(shí)際實(shí)驗(yàn)中存在的雙通道圖像偏差對(duì)定位精度的影響.