王振華 高國偉 谷曉華 陳利軍 張如楠 任民柱 薛 鳴

肺癌為臨床常見惡性腫瘤之一，多數患者入院確診時已處于晚期，喪失最佳手術時機[1]。目前，分割放療仍為晚期肺癌患者的重要治療方法之一，可提升5年生存率[2]。臨床常用分割放療模式包括常規(guī)分割放療、超分割放療、大分割放療，在腫瘤治療中有一定作用，但不同分割放療模式抑瘤作用存在差異。而且，一些肺癌患者在放療期間，受固定方式、重復性擺位誤差、呼吸運動、腫瘤自身變化及腫瘤周圍器官移動等因素的影響，可能造成照射誤差，累及部分正常組織如心臟，引發(fā)放射性心臟損傷，增加分割放療方式選擇難度[3]。基于此，本研究開展動物實驗，重點分析不同分割模式放療對肺癌小鼠的抑瘤作用及對放射性心臟損傷的影響，并探討其機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 收集無特定病原體(specific pathogen free，SPF)級昆明種小鼠50只，雌雄各半，8周齡，體質量18～22 g，購自北京科興生物制品有限公司，許可證號：SYXK(京)2019-0053。實驗前在濕度(50±10)%、溫度(22±2)℃環(huán)境內適應性喂養(yǎng)1周，12 h光照，自由獲得飲水、飼料。

1.1.2 主要試劑和儀器 心肌肌鈣蛋白I(cardiac troponin I，cTnI)、谷草轉氨酶(aspartate amino-transferase，AST)、肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzymes，CK-MB)酶聯(lián)免疫吸附法檢測試劑盒(上海晶抗生物工程有限公司)，蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin staining，HE)染色法試劑盒(北京索來寶科技有限公司)，TdT介導的dUTP缺口末端標記(TdT mediated-dUTP nick end labeling，TUNEL)染色試劑盒(上海澤葉生物有限公司)，兔抗小鼠表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)、細胞周期蛋白D1(CyclinD1)、B淋巴細胞瘤2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)、β-actin一抗及山羊抗兔IgG二抗(美國Abcam公司)。

PRIMUS醫(yī)用直線加速器治療床(德國西門子公司)，普通光學顯微鏡(日本奧林巴斯株式會社)，Infinite M200酶標儀(瑞士TECAN公司)。

1.2 方法

1.2.1 模型制備及分組 50只小鼠建立肺癌小鼠模型[4]：建模前3 d，預防性給予5萬單位注射用青霉素鈉、50 mg注射用硫酸鏈霉素肌肉注射預防肺內感染。建模當天，戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，仰臥位固定在鼠板上，經會咽部將特制鈍頭注射器插入氣管，以0.1 mL致癌碘油液緩慢注入肺內。實驗完成后剔除建模失敗小鼠。建模成功標準：建模后出現食欲不振、呼吸加快、咳嗽增多等癥狀，組織病理學檢查出現腫塊，伴癌細胞、肺泡囊及纖毛上皮細胞結構異常改變等變化。50只小鼠建模成功46只，成功率92.00%。小鼠隨機分為A組11只、B組11只、C組12只、D組12只。

1.2.2 動物干預 建模成功后24 h開始治療，戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，仰臥位固定于醫(yī)用直線加速器治療床，以專用畫線筆標記腫瘤區(qū)域，采用8 MeV電子線照射，表面覆蓋1 cm組織等效材料。激光定位在心臟部，照射野1 cm×1 cm，源皮距100 cm。B組實施常規(guī)分割放療，劑量為1.8～2.0 Gy/次，每日1次；C組實施超分割放療，劑量為1.4 Gy/次，每日2次，2次間隔12 h；D組實施大分割放療，劑量為2.5 Gy/次，每日1次。A組給予普通光照射，每日1次。各組均照射7 d。

1.2.3 取材及處理 觀察各組小鼠治療后行為學變化，包括飲水量、飲食量、活動度、精神狀態(tài)、呼吸狀況等。完成行為學評估后，戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，摘眼球取血2 mL，以備檢測心肌損傷指標。取血后，脫頸椎法處死，完整剝取腫瘤組織，生理鹽水沖洗2次，濾紙吸干表面水分，電子稱稱取瘤質量，計算抑瘤率[(1-治療后平均瘤質量/A組平均瘤質量)×100%]。腫瘤組織稱取瘤質量后，分為2份，1份置于4%多聚甲醛固定，以備檢測病理形態(tài)學，另1份置于液氮保存，以備檢測蛋白表達；同時，沿劍突縱軸線自下而上剪開胸腔，剝離心臟組織，置于4%多聚甲醛保存，以備檢測心肌細胞凋亡。

1.2.4 血清cTnI、AST、CK-MB水平檢測 取小鼠眼球血樣，靜置30 min。4℃，12 000 r/min離心，離心半徑8 cm，15 min，取上清液。嚴格按照cTnI、AST、CK-MB酶聯(lián)免疫吸附法試劑盒說明書操作。

1.2.5 腫瘤組織病理形態(tài)學 采用HE染色法檢測。取1份4%多聚甲醛固定腫瘤組織，生理鹽水沖洗，磷酸緩沖液浸泡10 h。脫水，常規(guī)石蠟包埋，切片，厚度4 μm。展片，置于60℃烤箱內烘烤15 min，確保組織黏附在載玻片上。二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水。蘇木精液染色1 min，1%鹽酸乙醇分化，流水沖洗。伊紅染色1 min，蒸餾水沖洗。梯度酒精脫蠟，二甲苯透明，中性樹膠封片。鏡下觀察腫瘤組織病理形態(tài)學變化。

1.2.6 心肌細胞凋亡檢測 采用TUNEL染色法檢測。取1份4%多聚甲醛固定心臟組織，常規(guī)石蠟包埋，切片4 μm。嚴格按照TUNEL染色試劑盒說明書完成相關操作，顯微鏡400倍視野下隨機選擇4個視野，TUNEL染色凋亡細胞呈熒光綠色，計算細胞凋亡率(凋亡細胞數/總細胞數×100%)。

1.2.7 EGFR、CyclinD1、Bcl-2蛋白相對表達量 采用蛋白質印跡法檢測。取1份液氮保存腫瘤組織，生理鹽水沖洗，冰浴下制備10%勻漿。4℃，14000 r/min離心，離心半徑8 cm，10 min，取上清液。BCA法行蛋白定量，以2×上樣緩沖液加入，沸水浴變性，共10 min。10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜，5%脫脂奶粉封閉，共1 h。加兔抗小鼠EGFR、CyclinD1、Bcl-2、β-actin(1:1000)一抗，4℃搖床，孵育，過夜。TBST洗膜，每次10 min，重復4次。加二抗(1∶2500)，室溫孵育2 h。加入ECL發(fā)光液，膠片曝光，洗片，Image軟件分析條帶灰度值。以目的蛋白條帶灰度值與β-actin條帶灰度值比值計算蛋白表達水平。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 行為學變化

A組小鼠飲水量、飲食量減少，活動度減弱，且存在精神萎靡、毛發(fā)稀疏、呼吸加快、咳嗽增多、消瘦明顯等癥狀。與A組比較，B組、C組、D組小鼠飲水量、進食量、活動度、精神狀態(tài)、呼吸狀態(tài)等行為學異常減輕，其中D組改善更顯著。

2.2 瘤質量、抑瘤率

與A組比較，B組、C組、D組瘤質量降低，D組

表1 各組瘤質量、抑瘤率比較

2.3 血清cTnI、AST、CK-MB水平

與A組比較，B組、C組、D組血清cTnI、AST、CK-MB水平升高，D組

表2 各組cTnI、AST、CK-MB水平比較

2.4 腫瘤組織病理形態(tài)學

HE染色顯示，A組腫瘤細胞密集，呈團狀分布，生長旺盛，胞漿稀少，存在壞死細胞，但無明顯細胞凋亡。與A組比較，B組、C組、D組腫瘤細胞壞死、凋亡增多，體積縮小，其中D組改善更顯著。見圖1。

圖1 各組腫瘤組織病理形態(tài)學(HE×200)

2.5 心肌細胞凋亡

心肌細胞凋率分別為A組(2.12±1.48)%、B組(17.51±1.82)%、C組為(13.15±1.52)%、D組為(7.22±1.42)%，與A組比較，B、C、D組心肌細胞凋亡率升高，D組

圖2 各組小鼠心肌細胞凋亡情況(TUNEL×400)

2.6 EGFR、CyclinD1、Bcl-2蛋白相對表達量

與A組比較，B組、C組、D組EGFR、CyclinD1蛋白相對表達量降低，且EGFR、CyclinD1蛋白相對表達量；D組

圖3 各組EGFR、CyclinD1、Bcl-2蛋白表達

表3 各組EGFR、CyclinD1、Bcl-2蛋白相對表達量比較

3 討論

目前，肺癌治療以手術、放療、化療、生物治療等綜合療法為主，但多數患者確診時已處于晚期，僅可經放療、化療、生物治療等保守療法緩解病情[5]。放療可殺滅腫瘤病灶，利于提升局部控制率，但目前臨床對放療總劑量、分割方式等選擇尚無統(tǒng)一標準。而且，肺癌患者放療期間，也易受心臟接受照射劑量、照射體積、接觸到射線持續(xù)時間等因素影響，發(fā)生放射性心臟損傷，增加病死幾率[6]。目前臨床常用分割放療模式包括常規(guī)分割放療、超分割放療及大分割放療，但就其在肺癌中抑瘤作用及對放射性心臟損傷影響、機制分析仍不多。

研究發(fā)現[7]，與常規(guī)分割放療相比，超分割放療提升放療劑量，可增強腫瘤殺滅作用，降低肺纖維化、食管狹窄等晚期反應損傷，但就其劑量選擇仍存在爭議。大分割放療是單次放療分割劑量超過2.5 Gy的方法，在確保總放射劑量相同情況下，其放療次數較常規(guī)分割放療少，且可縮短腫瘤細胞加速再增殖時間，提升局部控制率，獲得較高等效生物劑量[8]。李卓華[9]還發(fā)現，大分割放療在局限性小細胞癌中的應用，可在保證治療安全性同時，經增加劑量、縮短療程等方式，提升腫瘤局部控制效果。本研究發(fā)現，大分割放療后小鼠異常行為學及腫瘤組織異常病理學改變明顯減輕，瘤質量降低，抑瘤率升高，提示大分割放療對肺癌生長抑瘤作用更明顯。另外，大分割放療后小鼠血清cTnI、AST、CK-MB水平及心肌細胞凋亡率降低，這提示大分割放療還可減輕放射性心臟損傷。

近年來，EGFR通路及靶向治療逐漸成為肺癌研究熱點之一。EGFR為原癌基因c-ErbB-1表達產物，在表皮細胞、基質細胞內廣泛表達，且高表達于多種惡性腫瘤細胞中[10]。研究發(fā)現[11]，經抑制EGFR受體活性，可減弱有絲分裂信號，對細胞核內CyclinD1表達產生影響，抑制腫瘤細胞生長。葛琴等[12]還發(fā)現，大分割放療治療局部晚期非小細胞肺癌可獲得較高局部控制率，作用機制可能與抑制EGFR表達有關。另外，EGFR通路激活還可引發(fā)Bcl-2低表達，參與細胞增殖、分化、凋亡等過程[13]。Bcl-2是一種抑制凋亡基因，可提升谷胱甘肽表達，調節(jié)細胞氧化還原平衡，抑制細胞凋亡[14]。趙風利等[15]還發(fā)現，Bcl-2蛋白表達降低參與小鼠同步放化療所致放射性心臟損傷過程，心臟損傷發(fā)生機制可能與抗凋亡蛋白Bcl-2低表達有關。這些研究均提示，肺癌治療中腫瘤抑制效果及放射性心臟損傷發(fā)生可能與EGFR通路有關。本研究結果顯示，大分割放療后小鼠EGFR、CyclinD1蛋白相對表達量降低，Bcl-2蛋白相對表達量升高，這提示大分割放療可抑制EGFR通路，這可能是其發(fā)揮對肺癌小鼠抑瘤作用及減輕放射性心臟損傷的機制之一。

綜上所述，相較于常規(guī)分割放療、超分割放療，大分割放療可提升對肺癌小鼠抑瘤作用，且可減輕放射性心臟損傷，作用機制可能與抑制EGFR通路有關。本研究不足之處在于不同分割放療模式對肺癌抑瘤作用及放射性心臟損傷影響途徑較多，本研究僅分析了經EGFR通路的作用，未就其他途徑進行探討，今后仍需進一步分析。