黃興武 羅 鋒 陽國彬

前列腺癌(prostate cancer,PCa)是老年男性中常見的惡性腫瘤，發(fā)病率和死亡率僅次于肺癌[1]。PCa由于發(fā)病隱匿且尚無有效早期診斷指標，發(fā)現(xiàn)時往往多為晚期，目前臨床上治療PCa的主要方法有內(nèi)分泌療法、手術(shù)療法、放射療法及化學(xué)療法[2]。但內(nèi)分泌療法因激素的依賴性而向惡性腫瘤轉(zhuǎn)化進而延誤治療，手術(shù)療法和放射療法對患者身心傷害較大，許多患者因無法忍受治療的痛苦而選擇退出治療[3]。因而尋找副作用小且療效好的治療方式成為了目前研究的熱點之一。隨著醫(yī)療的發(fā)展，基因治療越來越多地使用在腫瘤的治療中，微小RNA(micro-RNA，miRNA)是一種長度為20～25個核苷酸左右內(nèi)源性非編碼RNA，對腫瘤細胞的增殖、凋亡以及侵襲遷移有著一定的作用[4]。高棟梁等[5]研究表明：miR-497-5p可以靶向泛素蛋白連接酶1(WW domain-containing protein 1,WWP1)抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞的增殖，并誘導(dǎo)其凋亡。朱延杰等[6]研究表明：miR-142-5p可以通過靶向調(diào)控TOP2A基因抑制PCa細胞的增殖與侵襲能力。因此我們推測升高PCa細胞中的miR-142-5p或者降低WWP1的表達可能可以實現(xiàn)抑制其惡性生物學(xué)特征的目標?；诖吮狙芯款A(yù)測了miR-142-5p與WWP1的結(jié)合位點并驗證其靶向性，并體位培養(yǎng)PC-3細胞，檢測miR-142-5p靶向作用WWP1對PC-3細胞生物學(xué)行為的影響，旨在為PCa的治療提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要細胞

20例PCa組織及癌旁組織(>2 cm處)來自2020年1月至2021年1月于醫(yī)院行PCa手術(shù)治療的患者；PC-3(人PCa細胞；貨號：YS-E96354；培養(yǎng)基：90% DMEM+10%FBS)細胞購自上海研生實業(yè)有限公司。

1.2 主要試劑與儀器

DMEM和FBS均購自美國Gibco公司；TaqMan miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號：4427975)購自美國的Thermo公司；Matrigel購自美國的BD公司；質(zhì)粒購自上海吉瑪公司； E-cadherin抗體(貨號：ab763189)、N-cadherin抗體(貨號：76011)和Vimentin抗體(貨號：ab92547)均購自艾博抗有限公司；Transwell小室購自美國Millipore公司；超凈工作臺購自中國蘇凈安泰公司；BX51熒光顯微鏡購自日本Olympus公司；Rt2100c酶標儀購自美國Rayto公司；GNP-9080恒溫培養(yǎng)箱購自中國上海精宏實驗設(shè)備有限公司；Neofuge 15R低溫離心機購自中國Heal Force公司；DY89-I型勻漿機購自寧波新芝公司；熒光定量PCR儀購自中國博日有限公司。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養(yǎng)及傳代 提前準備37℃恒溫水浴，液氮中取出凍存的PC-3細胞，置于水浴中解凍。轉(zhuǎn)速：1000 rpm，時間：5 min，棄去上清。加入1 ml含10%胎牛血清(FBS)、同時加入1%的100 U/ml濃度的青霉素-鏈霉素雙抗以及90%的DMEM不完全培養(yǎng)基，緩慢吹打混勻，轉(zhuǎn)速：1000 rpm，時間：5 min，進行離心，然后棄去上清。再次加入1 ml培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶中，于37℃、CO2濃度為5%的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。待細胞單層貼壁生長至密度約90%時，采用胰蛋白酶進行消化傳代培養(yǎng)備用。

1.3.2 細胞轉(zhuǎn)染 取出目的質(zhì)粒，按照說明書將適量DEPC水加入質(zhì)粒中數(shù)分鐘溶解質(zhì)粒，然后置于-20 ℃冰箱中保存。取PC-3細胞接種到6孔板中，待單層細胞密度生長至90%左右按實驗分組：NC組(轉(zhuǎn)染空載對照質(zhì)粒)、miR-142-5p組(轉(zhuǎn)染miR-142-5p質(zhì)粒)、WWP1組(轉(zhuǎn)染W(wǎng)WP1質(zhì)粒)、miR-142-5p+WWP1組(轉(zhuǎn)染miR-142-5p質(zhì)粒及miR-142-5p)進行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前提前半小時更換恢復(fù)室溫的新鮮培養(yǎng)基，將其放入培養(yǎng)箱。然后取EP管，采用DMEM不完全培養(yǎng)基溶解質(zhì)粒及LipofectamineTM 2000，待各自溶解約5 min后將兩管輕輕混合，然后靜置15～20 min。靜置混合后再將混合物加入各處理組孔板中，6 h后更換新鮮培養(yǎng)基，待48 h后收集細胞進行處理。

1.3.3 RT-PCR檢測基因表達 提取PCa組織、癌旁組織和細胞總RNA，使用電動勻漿機進行組織勻漿制備并在離心機中以3500 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min，將離心后的上清液轉(zhuǎn)移至EP管中，裂解細胞收集上清并使用氯仿抽提水相、異丙醇和75%的乙醇洗滌純化核酸，加入DEPC水將RNA沉淀進行溶解，測定RNA濃度進行逆轉(zhuǎn)錄。根據(jù)試劑盒方法于逆轉(zhuǎn)錄管中分別加入逆轉(zhuǎn)錄酶和RNA樣本以及水，反應(yīng)體系為10 μL，設(shè)置程序進行cDNA的合成。然后再根據(jù)RT-PCR說明書進行實時定量PCR的反應(yīng)，準備好引物、酶和水的反應(yīng)體系，設(shè)置程序95℃預(yù)變性5 min，90℃變性30 s，65℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40個循環(huán)，72℃延伸5 min，進行基因擴增，采用2-ΔΔCt法計算miR-142-5p和 WWP1 mRNA的相對表達，以U6為內(nèi)參基因，各基因序列見表1。

表1 基因序列

1.3.4 熒光素酶報告實驗 預(yù)測miR-142-5p和WW-P1的結(jié)合片段，用RT-PCR擴增miR-142-5p上兩者的結(jié)合片段，構(gòu)建WWP1野生質(zhì)粒(WWP1 WT)、突變質(zhì)粒(WWP1 MUT)和miR-142-5p，分別或同時對PC-3細胞進行轉(zhuǎn)染，用Dual Luciferase報告基因試劑盒檢測各組熒光素酶活性。

1.3.5 Transwell小室實驗檢測細胞侵襲能力 在4℃條件下稀釋配制Matrigel凝膠，吸取100 μL左右凝膠均勻加入小室上層，然后將小室放在孔板內(nèi)，分別于37℃下放置2 h，室溫超凈臺內(nèi)再進行風干4 h；取轉(zhuǎn)染成功的各組PC-3細胞，PBS洗滌后換用無血清培養(yǎng)基重懸細胞，計數(shù)調(diào)整細胞密度，以5×104每小室的密度加入，然后放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h；48 h后將Transwell小室取出，棄去培養(yǎng)基，采用酒精棉簽擦去上層Matrigel凝膠及未穿膜的細胞。另取干凈的24孔板，將小室置于其中，采用4%多聚甲醛進行固定30 min。棄去固定液，配制結(jié)晶紫染液，對染色細胞10 min，PBS洗3遍，棉簽擦去未結(jié)合的染料，適當風干后，顯微鏡下觀察，隨機選取5個視野計數(shù)不同處理組的穿膜細胞數(shù)量。

1.3.6 劃痕實驗檢測細胞遷移能力 取上述各組PC-3細胞，采用24孔板接種密度為1×105/mL的腫瘤細胞，待細胞單層密度生長至90 %左右，采用10 μL Tip頭對細胞進行劃痕操作。采用無血清不完全培養(yǎng)基對劃痕脫落的細胞進行輕柔的沖洗，重復(fù)3次，棄去培養(yǎng)基，然后加入新鮮培養(yǎng)基將其置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。分別于0和24 h時后，顯微鏡下觀察并采集照片，然后進行細胞遷移距離的測量，統(tǒng)計分析各轉(zhuǎn)染組細胞的相對遷移距離并計算劃痕愈合率。細胞劃痕愈合率(%)=(各實驗組劃痕愈合面積/各實驗組劃痕面積)×100%。

1.3.7 蛋白質(zhì)印跡實驗檢測相關(guān)蛋白表達水平 取上述各組PC-3細胞，消化后重懸計數(shù)并調(diào)整細胞密度為1×105個/mL，并接種于6孔板中加入等量的DMSO進行培養(yǎng)48 h后，棄去培養(yǎng)基，4℃預(yù)冷PBS洗滌細胞3次，冰上加入蛋白裂解液裂解40 min，裂解完成后提取細胞總蛋白，利用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，隨后將獲得的蛋白按配膠、上樣、電泳、電轉(zhuǎn)、封閉、孵育一抗、孵育二抗、顯影的步驟檢測樣品中侵襲遷移相關(guān)蛋白(E-cadherin，N-cadherin和Vimentin)的相對表達水平，以GADPH蛋白為內(nèi)參對照。

1.3.8 流式細胞儀檢測細胞凋亡率 取上述各組PC-3細胞，消化后重懸計數(shù)并調(diào)整細胞密度為1×105個/mL，收集培養(yǎng)液于流式管中，六孔板中的細胞用PBS洗滌一次，加入0.5 mL 0.25%胰酶消化細胞，待細胞變圓且有部分細胞脫落，即加入培養(yǎng)基終止消化，用移液槍輕輕吹打細胞，使細胞懸浮。收集于上一步的流式管中，300 g離心5 min。加入1 mL PBS重新懸浮細胞，300 g離心5 min，沉淀用300 μL的Binding Buffer重懸加入5 μL Annexin V-PE，混勻后避光孵育10 min，加入5 μL 7-AAD，混勻后避光孵育5 min，上機檢測。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 癌組織及癌旁組織中miR-142-5p和WWP1 mRNA表達情況

采用RT-PCR檢測20例患者癌組織及癌旁組織中miR-142-5p和WWP1 mRNA表達情況發(fā)現(xiàn)，癌組織中miR-142-5p相對表達水平為(0.68±0.16)，顯著低于癌旁組織中(1.88±0.22)，差異存在統(tǒng)計學(xué)意義(t=19.727；P<0.05)。癌組織中WWP1 mRNA相對表達水平為(2.07±0.24)，顯著高于癌旁組織(0.24±0.13)，差異存在統(tǒng)計學(xué)意義(t=32.027；P<0.05)，見圖1。

圖1 癌組織及癌旁組織中miR-142-5p和WWP1 mRNA表達情況

2.2 miR-142-5p和WWP1靶向性驗證結(jié)果

經(jīng)過靶點預(yù)測miR-142-5p和WWP1存在結(jié)合位點，采用熒光霉素實驗檢測發(fā)現(xiàn)加入兩種野生純合子時熒光霉素活性顯著降低(P<0.05)；突變質(zhì)粒組熒光霉素活性無顯著改變(P>0.05)，見圖2。

注：**表示P<0.05；Ⅰ為miR-142-5p和WWP1結(jié)合靶點預(yù)測；Ⅱ為miR-142-5p和WWP1靶向性熒光霉素驗證結(jié)果。

2.3 各組細胞中miR-142-5p和WWP1 mRNA表達

采用RT-PCR檢測各組細胞中miR-142-5p和WWP1 mRNA表達情況發(fā)現(xiàn)，相比NC組，miR-142-5p組miR-142-5p相對表達水平顯著升高，WWP1 mRNA相對表達水平顯著降低(P<0.05)。相比NC組，WWP1組miR-142-5p相對表達水平顯著降低，WWP1 mRNA相對表達水平顯著升高(P<0.05)。相比WWP1組，miR-142-5p+WWP1組miR-142-5p相對表達水平顯著升高，WWP1 mRNA相對表達水平顯著降低(P<0.05)，見圖3。

注：與NC組相比，**為P<0.05；與WWP1組相比，##為 P<0.05；Ⅰ為各組細胞中miR-142-5p的相對表達水平；Ⅱ為各組細胞中WWP1 mRNA的相對表達情況。

2.4 miR-142-5p靶向作用WWP1對PC-3細胞侵襲和遷移能力影響

采用Transwell小室實驗檢測各組細胞侵襲能力發(fā)現(xiàn)，相比NC組，miR-142-5p組單位面積內(nèi)侵襲細胞數(shù)目顯著降低，WWP1組單位面積內(nèi)侵襲細胞數(shù)目顯著升高(P<0.05)；相比WWP1組，miR-142-5p+WWP1組單位面積內(nèi)侵襲細胞數(shù)目顯著降低(P<0.05)。采用劃痕實驗檢測各組細胞遷移能力發(fā)現(xiàn)，相比NC組，miR-142-5p組24 h后細胞劃痕愈合率顯著降低，WWP1組24 h后細胞劃痕愈合率顯著升高(P<0.05)；相比WWP1組，miR-142-5p+WWP1組24 h后細胞劃痕愈合率顯著降低(P<0.05)，見圖4。

注：與NC組相比，**為P<0.05；與WWP1組相比，##為 P<0.05；Ⅰ為Transwell小室拍照；Ⅱ為單位面積侵襲細胞數(shù)目；Ⅲ為劃痕實驗0 h和24 h拍照圖；Ⅳ為劃痕愈合率；A為NC組；B為miR-142-5p組；C為WWP1組；D為miR-142-5p+WWP1組。

2.5 miR-142-5p靶向作用WWP1對PC-3細胞侵襲和遷移相關(guān)蛋白表達影響

采用蛋白質(zhì)印跡實驗檢測各組細胞侵襲和遷移相關(guān)蛋白表達發(fā)現(xiàn)，相比NC組，miR-142-5p組E-cadherin蛋白相對表達水平顯著升高，N-cadherin和Vimentin相對表達水平顯著降低(P<0.05)；相比NC組，WWP1組E-cadherin蛋白相對表達水平顯著降低，N-cadherin和Vimentin相對表達水平顯著升高(P<0.05)；相比WWP1組，miR-142-5p+WWP1組E-cadherin蛋白相對表達水平顯著升高，N-cadherin和Vimentin相對表達水平顯著降低(P<0.05)，見圖5。

注：與NC組相比，**為P<0.05；與WWP1組相比，##為 P<0.05；Ⅰ為侵襲和遷移相關(guān)蛋白印跡圖；Ⅱ為侵襲和遷移相關(guān)蛋白相對表達水平；A為NC組；B為miR-142-5p組；C為WWP1組；D為miR-142-5p+WWP1組。

2.6 miR-142-5p靶向作用WWP1對PC-3細胞凋亡影響

流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，相比NC組，miR-142-5p組細胞凋亡率顯著升高，WWP1組細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)；相比WWP1組，miR-142-5p+WWP1組細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)，見圖6。

注：與NC組相比，**為P<0.05；與WWP1組相比，##為 P<0.05；Ⅰ為流式細胞檢測結(jié)果圖；Ⅱ為細胞凋亡率；A為NC組；B為miR-142-5p組；C為WWP1組；D為miR-142-5p+ WWP1組。

3 討論

PCa已成為僅次于肺癌的癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一，尋找有效的診斷和治療方法對PCa患者非常重要[7]。越來越多的證據(jù)表明，miRNAs可能調(diào)控各種癌癥過程，并有作為惡性腫瘤的特異性生物標志物的潛力[8]。研究表明，許多miRNA可以靶向調(diào)控相關(guān)蛋白，改善腫瘤細胞的惡性生物學(xué)特征，達到治療腫瘤的作用[9]。Su等[10]研究表明：miR-142-5p靶向作用MCL 1可以調(diào)控卵巢癌細胞凋亡。WWP1是一種 HECT家族的 E3 泛素連接酶，在WWP1蛋白中包含922個氨基酸殘基，含1個 C2 結(jié)構(gòu)域，4個 WW結(jié)構(gòu)域和1個 HECT 結(jié)構(gòu)域，其分子量約為105000[10]。近年來研究發(fā)現(xiàn)WWP1在腫瘤組織中異常表達[11]。Jia等[12]研究表明：WWP1在黑色素瘤中呈高表達，降低其表達可有效抑制黑色素瘤的發(fā)展。本研究檢測了前列腺組織中WWP1和miR-142-5p的表達情況發(fā)現(xiàn)，相比正常的癌旁組織，PCa組織中WWP1呈異常高表達，miR-142-5p呈異常低表達。這與前人研究其他腫瘤組織中的WWP1和miR-142-5p表達相一致。同時在本研究中，我們通過以PC-3細胞作為研究對象，通過生物信息學(xué)以及雙熒光素酶報告試驗確定WWP1與miR-142-5p存在靶向性發(fā)現(xiàn)，同時加入野生純合子的WWP1和miR-142-5p組熒光霉素活性顯著低于其他各組，說明WWP1上存在于miR-142-5p結(jié)合的位點，miR-142-5p可以靶向作用WWP1調(diào)控PC-3細胞的相關(guān)生物學(xué)特征。Wang等[13]研究表明：降低miR-142可以上調(diào)WWP 1表達表明miR-142與WWP 1存在靶向結(jié)合性，與本研究得出的結(jié)論相一致，在本試驗中這一驗證結(jié)果為后續(xù)的實驗奠定了理論基礎(chǔ)。

腫瘤較強的增殖和侵襲能力是促進腫瘤惡化的重要原因[14]。因此本研究采用了Transwell小室實驗[15]和劃痕實驗[16]檢測了PC-3細胞的侵襲和遷移能力，發(fā)現(xiàn)miR-142-5p靶向作用WWP1后PC-3細胞單位面積侵襲細胞數(shù)目和劃痕愈合率顯著降低，說明miR-142-5p靶向作用WWP1可以抑制PC-3細胞的侵襲和遷移能力。上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化則是影響腫瘤侵襲和遷移的主要因素[17]。E-cadherin蛋白表達的下降和Vimentin蛋白表達的升高被認為是上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化發(fā)生的主要標志[18]。N-cadherin為N黏附蛋白，其表達量高說明其黏附能力降低，升高其表達會使得腫瘤細胞間的黏附能力下降，運動能力增強[19]。本研究檢測這幾種蛋白發(fā)現(xiàn)，E-cadherin可以通過多個途徑影響腫瘤的浸潤與轉(zhuǎn)移，同時在多種腫瘤中也發(fā)現(xiàn)Vimentin蛋白表達的上調(diào)[20]。在本研究中，miR-142-5p靶向作用WWP1后E-cadherin蛋白相對表達水平顯著升高，N-cadherin和Vimentin相對表達水平顯著降低，說明miR-142-5p靶向作用WWP1使得腫瘤的侵襲和遷移能力降低，其作用機制可能是通過抑制PC-3細胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程來實現(xiàn)的。腫瘤細胞的凋亡也是其重要生物學(xué)特征，促進腫瘤細胞的凋亡可以有效抑制腫瘤的發(fā)展[21]。基于此本研究檢測了各組體外培養(yǎng)的PC-3細胞的凋亡情況發(fā)現(xiàn)，相比NC組，miR-142-5p組細胞凋亡率顯著升高，WWP1組細胞凋亡率顯著降低；相比WWP1組，miR-142-5p+WWP1組細胞凋亡率顯著升高，說明miR-142-5p靶向作用WWP1可以促進腫瘤細胞的凋亡，通過促進其凋亡調(diào)控PCa的發(fā)展。

綜上所述，PCa組織中miR-142-5p表達水平低于正常前列腺組織，WWP1水平高于正常組織。miR-142-5p靶向作用WWP1是通過抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程來抑制前列腺PC-3細胞的侵襲和遷移，同時促進其凋亡。但本研究也存在一定的不足之處，因為時間和經(jīng)費的限制，尚未對miR-142-5p靶向作用WWP1促進PC-3細胞凋亡的機制進行深入探究，在后續(xù)的研究中將進一步深入探究miR-142-5p靶向作用WWP1對PC-3細胞凋亡的機制。