劉雅雯 章玲玲 胡本輝 李 凌

全球調(diào)研數(shù)據(jù)顯示，在女性婦科惡性腫瘤中，宮頸癌的發(fā)病率僅次于乳腺癌[1]。TRIM37是TRIM家族中的一員，位于17q22-23染色體上,是具有RING結(jié)構(gòu)域的E3泛素化連接酶[2]。已有文獻(xiàn)報道，TRIM37發(fā)生突變可與15種以上的疾病相關(guān)[3-5]。研究證實(shí)TRIM37在多種腫瘤中呈過表達(dá)狀態(tài)，并發(fā)揮著多種重要的生物學(xué)功能[2,6-7]。然而，TRIM37在宮頸癌組織中的表達(dá)情況、生物學(xué)功能及機(jī)制尚不明確。本研究旨在探討TRIM37在宮頸癌組織中的表達(dá)情況，分析TRIM37的表達(dá)與宮頸癌患者生存間的關(guān)系，以及可能影響患者生存預(yù)后的相關(guān)因素。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選擇2012年1月至2012年12月間經(jīng)病理確診的131例宮頸癌患者，獲取這些患者的宮頸癌組織、癌旁組織(與病灶之間的距離大于2 cm)石蠟標(biāo)本；標(biāo)本由我院腫瘤科及病理科提供。選擇的癌組織及癌旁組織均經(jīng)過病理科醫(yī)師確定。收集患者的一般臨床病理資料。除此之外，2019年10月至2020年2月期間，收集我院8對新鮮的宮頸癌組織標(biāo)本和成對的相鄰宮旁組織標(biāo)本供后續(xù)研究所用。分期標(biāo)準(zhǔn)選用的是2018年國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟FIGO 提出的標(biāo)準(zhǔn)。總生存時間(overall survival)是確診日至隨訪截止日或死亡日。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑及儀器 TRIM37兔抗人單克隆抗體購自美國GeneTex公司。辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔一抗、二抗購自北京全式金公司。RIPA裂解液購自BOSTER公司。ECL Western blot Kit購自Pirece公司。

1.2.2 免疫組化 常規(guī)石蠟包埋、切片、脫蠟、水化。加入抗TRIM37蛋白抗體(1∶80)，4℃過夜，加二抗，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，常規(guī)脫水，中性樹脂封片。陽性結(jié)果判定需結(jié)合染色深淺程度及染色腫瘤細(xì)胞在總面積中的占比來判斷。染色深淺情況判斷：未染色=0分，淡黃色=1分，棕黃色=2分，褐黃色=3分；同時通過使用光學(xué)顯微鏡(×200)對腫瘤細(xì)胞進(jìn)行觀察，選擇5個顯微鏡下的視野，對染色腫瘤細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算其在總面積中的占比：無陽性細(xì)胞=0分，陽性細(xì)胞占比<25%=1分；陽性細(xì)胞≥25%～50%=2分，陽性細(xì)胞占比>50%=3分。根據(jù)兩者乘積總分將其分為TRIM37低表達(dá)組(得分<4分)和TRIM37高表達(dá)組(得分>4分)。

1.2.3 Western blot檢測宮頸組織中TRIM37蛋白的表達(dá) 宮頸組織標(biāo)本于液氮中研磨成粉狀，加入RIPA裂解液，冰浴裂解，BCA法對蛋白樣品進(jìn)行定量；上樣；電泳每個組織樣本取等量蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，取出PVDF膜，TRIM37向一抗、二抗中加入適量的封閉液對其進(jìn)行稀釋，洗膜，二抗封閉2 h，ECL發(fā)光，暗室壓片。使用紅光照射等，對X光片進(jìn)行裁剪，計(jì)算TRIM37條帶灰度值與GAPDH條帶灰度值的比值來表示TRIM37蛋白表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS Statistics22 統(tǒng)計(jì)軟件包。應(yīng)用卡方檢驗(yàn)(χ2)分析TRIM37的表達(dá)與臨床病理特征參數(shù)間的關(guān)系。Kaplan Meier繪制生存曲線。COX回歸進(jìn)行單因素及多因素分析。當(dāng)P<0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TRIM37在宮頸癌組織與癌旁正常組織中的表達(dá)差異

免疫組化對樣品組織進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，相較于癌旁正常組織，TRIM37在腫瘤組織中有較高的表達(dá)水平。此外，TRIM37在Ⅲ～Ⅳ期較Ⅰ～Ⅱ期的組織中表達(dá)增高。另外，本研究還顯示，在8對新鮮的宮頸癌組織中，其中7對組織中TRIM37蛋白表達(dá)水平相對較高(圖1)。

注：N為癌旁組織；C為癌組織。

2.2 TRIM37與宮頸癌臨床病理特征間的關(guān)系

TRIM37高表達(dá)與低表達(dá)的患者分別有39例、92例。本研究中TRIM37表達(dá)率為29.8%。卡方檢驗(yàn)結(jié)果顯示，在宮頸癌組織中，TRIM37的高表達(dá)與腫瘤直徑(P=0.005)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.007)、FIGO分期(P=0.000)密切相關(guān)，與年齡(P=0.175)、病理類型(P=0.074)等因素?zé)o顯著關(guān)聯(lián)。見表1。

2.3 TRIM37與宮頸癌患者生存預(yù)后的關(guān)系

本研究的中位隨訪時間為62個月(9～96個月)，所有患者整體的中位OS為56個月(95%CI:41.342～70.658)。TRIM37低表達(dá)的患者，中位OS為70個月(95%CI:54.538～85.462)；而TRIM37高表達(dá)組的中位OS為40個月(95%CI:34.653～45.347)。TRIM37高表達(dá)組與低表達(dá)組患者的5年生存率分別是21.34%、53.25%。 隨后我們對2組患者進(jìn)行了生存分析，結(jié)果提示：2組患者的生存差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001)。見圖2。

2.4 預(yù)后影響因素分析

單因素分析結(jié)果表明： FIGO分期(P=0.000)、腫瘤直徑(P=0.002)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.000)、TRIM37表達(dá)(P=0.000)與生存預(yù)后密切相關(guān)；為了減少統(tǒng)計(jì)偏倚，我們對單因素分析結(jié)果中有意義的因素進(jìn)行了COX多因素分析，最終分析結(jié)果表明：FIGO分期晚(P=0.000)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.020)、TRIM37高表達(dá)(P=0.002)與宮頸癌患者生存差密切相關(guān)。見表2。

表2 與宮頸癌患者預(yù)后相關(guān)的COX因素分析

3 討論

RBCC結(jié)構(gòu)域作為TRIM家族蛋白中的特征結(jié)構(gòu)首次在非洲爪蟾核因子(XNF7)中被發(fā)現(xiàn)[8]。TRIM37是其家族中的一員，參與了機(jī)體的多種生理及病理過程。多項(xiàng)報道證實(shí)，TRIM37的高表達(dá)與多種腫瘤的預(yù)后差密切相關(guān)，或可成為腫瘤治療的潛在靶標(biāo)[9-13]。

既往的研究已證實(shí)TRIM37在多種腫瘤中呈高表達(dá)，且與生存預(yù)后差密切相關(guān)。Zhao等[14]報道TRIM37在腸癌細(xì)胞系HCT116中呈高表達(dá)，且在蛋水平也得到了驗(yàn)證。隨后，Li等[15]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，無論是mRNA還是蛋白水平，與癌旁組織及正常組織相比，TRIM37在非小細(xì)胞肺癌組織及細(xì)胞系中均呈高表達(dá),且與預(yù)后差密切相關(guān)。研究者分析了189例肺癌患者的蠟塊組織，結(jié)果證明TRIM37表達(dá)升高與侵襲性強(qiáng)相關(guān)，同時該研究結(jié)果還顯示TRIM37表達(dá)高的患者相較于表達(dá)低的患者生存期明顯縮短(28個月vs.61個月)；且多因素分析結(jié)果提示，TRIM37與較晚的臨床分期是非小細(xì)胞肺癌患者的預(yù)后不良因素。為了明確TRIM37在胃癌中的功能，Chen等[16]在對55對胃癌及癌旁組織的檢測中發(fā)現(xiàn)，TRIM37在胃癌組織中的表達(dá)均高于癌旁組織且TRIM37表達(dá)高的患者生存期更短；因素分析結(jié)果可知，胃癌患者的T分期(P<0.001)、pTNM分期(P=0.001)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P<0.001)與TRIM37的表達(dá)密切相關(guān)，因此在胃癌中，TRIM37也被認(rèn)為是預(yù)后不良因素。也有研究者分析了肝癌中TRIM37與患者臨床病理因素的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：TRIM37高表達(dá)與腫瘤分期晚(P=0.002)、腫瘤直徑大于5 cm(P=0.025)相關(guān)；同時還發(fā)現(xiàn)TRIM37高表達(dá)的患者，其總生存時間明顯縮短(P=0.029)[7]。該研究結(jié)果認(rèn)為TRIM37可成為肝癌的獨(dú)立預(yù)后因素。本研究同樣證明TRIM37在宮頸癌組織中呈高表達(dá)，而且TRIM37在Ⅲ～Ⅳ期較Ⅰ～Ⅱ期的宮頸癌中表達(dá)更高。生存分析結(jié)果提示：相較于TRIM37低表達(dá)患者而言，TRIM37高表達(dá)的患者生存期明顯縮短(40個月 vs.70個月；P=0.001)，低表達(dá)者中位生存期幾乎是高表達(dá)者的兩倍。COX回歸分析探索影響生存的相關(guān)因素。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：FIGO分期晚、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TRIM37高表達(dá)與生存差密切相關(guān)。以上均表明本研究的結(jié)果與上述既往的研究結(jié)果相似，即均可證明TRIM37在腫瘤的進(jìn)程中發(fā)揮著促癌作用。但本研究也存在一定的局限，由于樣本量較少無法進(jìn)行更詳盡的因素分析可能造成明顯的生存差異，如：納入患者的分期遵循FIGO2009分期原則且未能進(jìn)行更詳盡的分期，病理類型僅將其分為鱗癌與非鱗癌，實(shí)際上非鱗癌中包括多種病理類型，且生存預(yù)后本身存在較大的差異，以上均可能影響結(jié)果。

綜上所述，本研究初步證明TRIM37在宮頸癌組織中的表達(dá)高，其與宮頸癌的不良預(yù)后密切相關(guān)。然而，TRIM37能否成為宮頸癌治療的新靶標(biāo)，仍需更大樣本量，進(jìn)行更詳細(xì)的亞組分析來驗(yàn)證這一結(jié)果。后續(xù)的研究中，我們將探討TRIM37在宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮的生物學(xué)功能及機(jī)制，以明確其在宮頸癌中的意義。