水產(chǎn)品腐敗希瓦氏菌雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的全基因組鑒定與分析

李秋瑩，張婧陽，徐瑾秀，孫 彤，李學(xué)鵬，勵(lì)建榮*

（1 渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 遼寧錦州 121013 2 生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心 遼寧錦州 121013）

腐敗希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens）是一種革蘭氏陰性運(yùn)動(dòng)桿菌，在自然界分布廣泛，是水產(chǎn)品的一種特定腐敗菌[1]。腐敗希瓦氏菌具有較強(qiáng)的低溫適應(yīng)能力，能在冷藏水產(chǎn)品中生長繁殖成為優(yōu)勢腐敗菌，同時(shí)產(chǎn)生腐胺、尸胺等生物胺以及三甲胺、H2S 等異味物質(zhì)，并導(dǎo)致水產(chǎn)品表面黏滑、肌肉松散、品質(zhì)惡化，是引起冷藏水產(chǎn)品發(fā)生腐敗的重要因素之一[1]。據(jù)報(bào)道，腐敗希瓦氏菌是海鱸魚[2]、大黃魚[3]、凡爾納對蝦[4]、斑點(diǎn)叉尾鮰[5]等水產(chǎn)品的優(yōu)勢腐敗菌。鑒于此，腐敗希瓦氏菌逐漸成為水產(chǎn)品保鮮領(lǐng)域內(nèi)的研究焦點(diǎn)，尤其是在冷藏條件下致腐敗的分子機(jī)制研究。

微生物對不同環(huán)境進(jìn)行感知和響應(yīng)一般是通過雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)（Two-component signal transduction system，TCSs）完成的[6]。TCSs 是一種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，目前只在細(xì)菌、古生菌和植物中發(fā)現(xiàn)[7]。TCSs 可協(xié)助細(xì)菌適應(yīng)復(fù)雜多變的外部環(huán)境，可以提高細(xì)菌在不同環(huán)境下的生存能力[8]。TCSs使細(xì)菌能夠檢測環(huán)境信號(hào)，并將其與應(yīng)激響應(yīng)所需的基因表達(dá)和生化反應(yīng)過程聯(lián)系起來[9]。細(xì)菌中的TCSs 包含一個(gè)組氨酸激酶（Histidine protein kinase，HK）和一個(gè)同源的反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白（Response regulator protein，RR），這是簡單的組氨酸-天冬氨酸組合形式。HK 在感知信號(hào)時(shí)發(fā)生自身磷酸化，并將磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到RR 的保守天冬氨酸殘基上，RR 接收磷酸基團(tuán)后自身構(gòu)象發(fā)生變化，從而執(zhí)行輸出功能[10-12]。TCS 基因在細(xì)菌基因組中所占比例通常低于5%，然而具有眾多重要的功能[8]。根據(jù)現(xiàn)有報(bào)道，在食源性細(xì)菌中，MalNO[13]和RevSR[14]可分別影響產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌對麥芽糖的利用水平以及毒力調(diào)節(jié)。CesKR 和AgrAC 可影響單增李斯特菌對抗生素的抗性[15]。VraSR[16]和SrrAB[17]可分別影響金色葡萄球菌的耐藥性與致病性。

目前，關(guān)于腐敗希瓦氏菌TCSs 的研究較少。本文從NCBI 數(shù)據(jù)庫獲得來自水產(chǎn)品的腐敗希瓦氏菌WS13 基因組信息，對其TCSs 進(jìn)行篩選和鑒定，并對TCSs 的功能域、跨膜區(qū)、進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行分析。同時(shí)，結(jié)合互作蛋白分析和KEGG 數(shù)據(jù)庫對TCSs 功能進(jìn)行預(yù)測，全面分析水產(chǎn)品腐敗希瓦氏菌TCSs 的特征和功能，以期為抑制水產(chǎn)品中的腐敗希瓦氏菌提供新的研究思路。

1 材料與方法

1.1 基因組數(shù)據(jù)的獲得

通過美國國立生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫（National Center for Biotechnology Information，NCBI，https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）檢索目前已有的腐敗希瓦氏菌基因組信息，下載腐敗希瓦氏菌WS13（NZ_CP028435.1）、腐敗希瓦氏菌CN-32（NC_009438.1）、腐敗希瓦氏菌FDAARGOS_681（NZ_CP046329.1）、腐敗希瓦氏菌NCTC12093（NZ_LR134303.1）、腐敗希瓦氏菌 200（NC_017566.1）的蛋白組和基因組序列，其中腐敗希瓦氏菌WS13（NZ_CP028435.1）是從南美白對蝦中分離得到的[5]，被主要用于TCSs 的挖掘和表征，其它腐敗希瓦氏菌基因組序列信息用于比較TCSs 在不同腐敗希瓦氏菌菌株中的分布差異。

1.2 TCSs 的全基因組鑒定

參照師舷等[18]的方法，根據(jù)雙組份信號(hào)系統(tǒng)HK 和RR 蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析腐敗希瓦氏菌WS13 基因組中可能存在的TCSs。本研究中的HK和RR 結(jié)構(gòu)域來自Pfam 蛋白數(shù)據(jù)庫（http：//pfam.xfam.org/），分別為 HATPase_c（Pfam00512、Pfam01627、Pfam02518、Pfam02895、Pfam06580、Pfam07536、Pfam07568、Pfam07730）和Response_reg（Pfam00072）。使用歐洲生物信息學(xué)研究所（European Molecular Biology Laboratory -European Bioinformatics Institute，EMBL-EBI） 研發(fā)的HMMER 軟件中的hmmbuild 命令，將獲取的HK 和RR 保守域?qū)Ρ刃蛄修D(zhuǎn)換成隱馬爾科夫模型，隨后使用hmmsearch 命令對腐敗希瓦氏菌WS13 蛋白組進(jìn)行搜索比對，分別鑒定基因組中的HKs 和RRs。通過NCBI 的BLASTp 程序?qū)λ训降腍K 和RR 進(jìn)行確認(rèn)。基因間距小于300 bp 的HK 和RR成功配對為成對TCS。如果HK 和RR 結(jié)構(gòu)域同時(shí)出現(xiàn)在一個(gè)蛋白序列位置上，那么該蛋白定義為融合HK；如果HK 和RR 找不到相連的RR 和HK，則該單個(gè)的HK 和RR 定義為孤兒HK 和孤兒RR。

1.3 結(jié)構(gòu)與功能分析

利用SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）來分析TCS 蛋白的功能域。TMHMM Serverv.2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）用于預(yù)測蛋白質(zhì)跨膜螺旋結(jié)構(gòu)域。利用MEGA7.0 軟件的MUSCLE 進(jìn)行多重序列比對，并采用NJ 法構(gòu)建進(jìn)化樹。利用BLASTp（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov）程序進(jìn)行序列相似性比對分析，并進(jìn)行功能注釋，預(yù)測分析各蛋白的功能。利用STRING（https：//string-db.org/）篩選TCSs 的互作蛋白。從KEGG 數(shù)據(jù)庫中獲取TCS 的功能信息，同時(shí)參考文獻(xiàn)報(bào)道對各TCS 進(jìn)行功能預(yù)測。

2 結(jié)果與討論

2.1 腐敗希瓦氏菌WS13 基因組中TCSs 的分布

利用保守結(jié)構(gòu)域?qū)Ω瘮∠Ｍ呤暇鶺S13 全基因組中的TCSs 進(jìn)行搜索，結(jié)果表明，腐敗希瓦氏菌WS13 菌株具有31 個(gè)HKs 和36 個(gè)RRs，其中HK 與RR 成對的TCS 有3 對，融合HK 為3 個(gè)，孤兒HKs 和RRs 分別為25 個(gè)和33 個(gè)，操縱子上排列方式均為RR-HK（表1）。不同腐敗希瓦氏菌株中孤兒HK/RR 的數(shù)量相近，而腐敗希瓦氏菌WS13 中成對的TCSs 數(shù)量明顯少于其它4 株腐敗希瓦氏菌，并且缺少HK-RR 排列方式的TCS，這可能與腐敗希瓦氏菌WS13 的基因組全長小于其它4 株菌有關(guān)（表2）。此外，這種TCS 多樣性差異可能與菌株的遺傳背景有關(guān)。腐敗希瓦氏菌CN-32、腐敗希瓦氏菌FDAARGOS_681 以及腐敗希瓦氏菌200 這3 株菌分離自無機(jī)物（巖石、管道）環(huán)境，其融合HK 數(shù)量均為5，多于腐敗希瓦氏菌WS13 中融合HK 的數(shù)量，與腦脊髓液來源的腐敗希瓦氏菌NCTC12093 相差較大。融合HK 較成對的TCSs 對信號(hào)的響應(yīng)更加靈活，可更及時(shí)、準(zhǔn)確地對細(xì)菌中各信號(hào)通路進(jìn)行調(diào)控[19]。水產(chǎn)品中的腐敗希瓦氏菌可分解動(dòng)物肌肉中的肌原蛋白；無機(jī)環(huán)境中的腐敗希瓦氏菌需要面對極端環(huán)境，同時(shí)還能廣泛利用各種物質(zhì)，其中包括具有強(qiáng)毒性的環(huán)境污染物、氯代有機(jī)污染物、重金屬和放射性元素[20]。腦脊髓液中的腐敗希瓦氏菌則要面對和適應(yīng)復(fù)雜的宿主環(huán)境。環(huán)境和利用碳源的不同，可能導(dǎo)致這幾株菌之間遺傳背景存在差異，從而產(chǎn)生TCSs 分布的差異。

表1 腐敗希瓦氏菌WS13 基因組中TCSs 的蛋白ID 和類型Table 1 Protein ID and types of TCSs in the whole genome of S.putrefaciens WS13

表2 腐敗希瓦氏菌WS13 與其它菌株基因組中TCSs 分布情況比較Table 2 Comparison of TCSs distribution in genomes WS13 and other strains of S.putrefaciens

2.2 HKs 的結(jié)構(gòu)域組成和分類

SMART 蛋白結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果顯示：腐敗希瓦氏菌WS13 基因組中的31 個(gè)HKs 具有16 種結(jié)構(gòu)域組成形式（圖1）。11 種結(jié)構(gòu)域組成形式中HKs的N 端為跨膜區(qū)，HKs 的跨膜區(qū)與其感受胞外信號(hào)有關(guān)。在成對的TCSs 中，跨膜區(qū)數(shù)量為1～3 個(gè)，而融合HKs 的跨膜區(qū)數(shù)量為1～12 個(gè)，其中融合HK01 的跨膜區(qū)為12 個(gè)。28 個(gè)HKs 的C 端具有典型的HATPase_c 激酶催化結(jié)構(gòu)域；而另外3 個(gè)孤兒HK01、孤兒HK03 和孤兒HK17 通過BLASTp 分析發(fā)現(xiàn)具有類似HATPase_c 激酶催化結(jié)構(gòu)域；少部分HKs 的C 端具有CheW 接受域、DNA 修復(fù)結(jié)構(gòu)域、MutL_c 終端二聚體結(jié)構(gòu)域；融合HKs 還具有REC 結(jié)構(gòu)域。

圖1 腐敗希瓦氏菌WS13 中HKs 的結(jié)構(gòu)域組成Fig.1 Structural domain composition of HKs in S.putrefaciens WS13

典型的HK 有3 個(gè)組成部分在發(fā)揮重要的生物學(xué)功能，第1 部分為N 末端可感應(yīng)外界變化；第2 部分負(fù)責(zé)連接N 末端和C 末端區(qū)域；第3 部位為具有組氨酸殘基的C 端激酶結(jié)構(gòu)域。此外，還有一種雜合的HK，即除了典型的HK 結(jié)構(gòu)域外，同時(shí)還含有一個(gè)天冬氨酸接受結(jié)構(gòu)域[21-22]。根據(jù)結(jié)構(gòu)域和跨膜區(qū)可將HKs 分為：含有PAS 和GAF 結(jié)構(gòu)域的胞質(zhì)感應(yīng)HK；含有跨膜區(qū)和HAMP 結(jié)構(gòu)域的胞外感應(yīng)HK；以及僅含有跨膜區(qū)和HATPase_c 的膜感應(yīng)HK[8]。根據(jù)分析結(jié)果，腐敗希瓦氏菌WS13 中的HKs 絕大多數(shù)是胞外感應(yīng)和膜感應(yīng)類型。在結(jié)構(gòu)域組成上，同時(shí)含有HisKA 和HATPase_c 結(jié)構(gòu)域的HKs 有12 個(gè)，同時(shí)含有HAMP、HisKA 和HATPase_c 結(jié)構(gòu)域的HKs 有8個(gè)，其余的HKs 具有多種結(jié)構(gòu)域組成，如PAS、PAC、HPT、H-Kinasedim 等結(jié)構(gòu)域。HisKA 是磷酸受體結(jié)構(gòu)域；HAMP 域是二聚體的四螺旋束，可能調(diào)節(jié)同型二聚體受體的磷酸化或甲基化作用，可在細(xì)菌受體中轉(zhuǎn)導(dǎo)構(gòu)象信號(hào)[23]。PAS 結(jié)構(gòu)域作為細(xì)胞內(nèi)傳感器，在包括信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、發(fā)色團(tuán)形成、運(yùn)動(dòng)、孢子形成和氮固定等不同方面中發(fā)揮作用[24]。PAC 可修飾PAS，可能有助于PAS 的折疊[15]。除了常規(guī)結(jié)構(gòu)域的HKs 外，孤兒HK01 具有TOP2c結(jié)構(gòu)域，與DNA 拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ功能相關(guān)。孤兒HK10 的C 端有一個(gè)DNA 錯(cuò)配修復(fù)蛋白結(jié)構(gòu)域。一個(gè)MutL_C 末端二聚結(jié)構(gòu)域，這是DNA 修復(fù)機(jī)制中糾正復(fù)制錯(cuò)誤的關(guān)鍵組件。孤兒HK21 的N端為HPT 結(jié)構(gòu)域，中部有H-Kinase dim 結(jié)構(gòu)域，C 端有一個(gè)CheW 接受域，其結(jié)構(gòu)與張娜等[15]發(fā)現(xiàn)的單増李斯特菌中HK02（RS05925） 結(jié)構(gòu)相似。HPT 結(jié)構(gòu)域可介導(dǎo)HKs 和RRs 間的信號(hào)傳遞。H-Kinase dim 是含有該結(jié)構(gòu)域的組氨酸激酶形成二聚體的區(qū)域；CheW 參與細(xì)菌的趨化性信號(hào)傳導(dǎo)[15]。

2.3 RRs 的結(jié)構(gòu)域組成和分類

與HKs 相比，RRs 在結(jié)構(gòu)域的組成上相對保守，它由N 端高度保守的含天冬氨酸殘基的磷酸受體接受域（REC），以及C 端的輸出結(jié)構(gòu)域兩部分組成[7]。TMHMM 的跨膜區(qū)分析結(jié)果顯示RRs 均不具備跨膜區(qū)。腐敗希瓦氏菌WS13 基因組中共有36 個(gè)RRs，然而，只有10 種結(jié)構(gòu)域組成形式（圖2）。每種結(jié)構(gòu)域組成形式中均含有REC 結(jié)構(gòu)域，表明磷酸受體結(jié)構(gòu)域?qū)Rs 是必需的。15 個(gè)RRs 屬于REC 和Transreg_C 兩種結(jié)構(gòu)域組成形式。1 個(gè)RRs 屬于2 個(gè)REC 結(jié)構(gòu)域組成形式。23個(gè)RRs 屬于由單個(gè)REC 結(jié)構(gòu)域或REC 結(jié)構(gòu)域與其它C 端的輸出結(jié)構(gòu)域組成形式。C 端的輸出結(jié)構(gòu)域種類主要包括CheW 結(jié)構(gòu)域、AAA 結(jié)構(gòu)域、HTH_LUXR 結(jié)構(gòu)域、EAL 結(jié)構(gòu)域、GGDEF 結(jié)構(gòu)域和HDc 結(jié)構(gòu)域。不同的C 端的輸出結(jié)構(gòu)域賦予RRs 的不同的功能。例如，CheW 結(jié)構(gòu)域與細(xì)菌趨化性信號(hào)傳導(dǎo)有關(guān)；AAA 結(jié)構(gòu)域是與多種細(xì)胞活動(dòng)相關(guān)的ATPase；HDc 結(jié)構(gòu)域是具有保守結(jié)構(gòu)的金屬依賴性磷酸水解酶，包含環(huán)狀核苷酸磷酸水解酶；HTH_LUXR 結(jié)構(gòu)域，它可激活生物發(fā)光操縱子，也可能與DNA 轉(zhuǎn)錄作用相關(guān)；EAL 結(jié)構(gòu)域，具有二鳥苷酸磷酸二酯酶活性；GGDEF 結(jié)構(gòu)域具有二鳥苷酸環(huán)化酶活性[25]。

圖2 腐敗希瓦氏菌WS13 中RRs 的結(jié)構(gòu)域組成Fig.2 Structural domain composition of RRs in S.putrefaciens WS13

2.4 HKs 和RRs 進(jìn)化分析

為了解腐敗希瓦氏菌WS13 基因組中TCSs的進(jìn)化關(guān)系，分別對所有HKs 和RRs 進(jìn)行多序列比對和進(jìn)化分析（圖3a，3b）。從進(jìn)化關(guān)系來看，HKs 主要分為4 個(gè)聚簇（圖3a），不同結(jié)構(gòu)域的HKs 具有不同的進(jìn)化關(guān)系。成對TCSs 中的HK1（WP_011789577.1）和HK3（WP_025007934.1）聚在一起，具有較近的親緣關(guān)系，而HK2（WP_025007619.1）位于另外一個(gè)聚簇。3 個(gè)融合HK，分別位于3 個(gè)聚簇，表明其親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，可能具有不同功能特點(diǎn)。從結(jié)構(gòu)域組成和序列比對分析來看，RRs 的保守性比HKs 要強(qiáng)一些，其進(jìn)化樹主要?jiǎng)澐譃? 個(gè)聚簇（圖3b）。成對TCSs 中的 RRs 分別位于不同聚簇，其中 RR1（WP_011788995.1）和RR3（WP_128090270.1）分別位于第5 和第6 聚簇，表明其親緣關(guān)系更近，這與HK 的分析結(jié)果類似。位于同一聚簇的HKs 和RRs 顯示較近的親緣關(guān)系和高度的同源性，它們更可能具有相近的功能。

圖3 腐敗希瓦氏菌WS13 中HKs 和RRs 的系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.3 Phylogenetic analysis of HKs and RRs in S.putrefaciens WS13

2.5 成對TCSs 和融合HKs 的互作蛋白分析及功能預(yù)測

利用STRING 對腐敗希瓦氏菌WS13 成對TCSs 和融合HKs 的互作蛋白進(jìn)行分析，結(jié)果如圖4所示。每種TCSs 與多種蛋白存在相互作用，通過Blast P 和KEGG 蛋白數(shù)據(jù)庫注釋對其功能進(jìn)行預(yù)測和分析（表3）。與TCSs01 存在相互作用的蛋白主要有pdsR 蛋白酶（ABP75463.1）、組氨酸激酶（ABP76854.1、ABP75462.1、ABP76854.1、ABP77677.1）、分選酶（ABP75465.1）、分選酶靶蛋白（ABP75464.1）、次黃嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶（ABP76895.1）。BLASTp 結(jié)果表明：TCSs01 為PdsR/PsdS 系統(tǒng)，目前該TCS 系統(tǒng)在細(xì)菌中的功能未知，結(jié)合KEGG 數(shù)據(jù)庫結(jié)果可推測TCSs01 主要含有多糖結(jié)合位點(diǎn)，可影響細(xì)胞壁代謝（表3）。預(yù)測TCSs02 的互作蛋白包括組氨酸激酶（ABP76854.1、ABP76486.1）、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（ABP76707.1）、分選酶靶蛋白（ABP76704.1）、功能未知的DUF 家族蛋白（ABP76703.1）、ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白蛋白（ABP76705.1）、RNA 聚合酶因子（ABP74445.1）、鐵氧化還原蛋白（ABP74700.1）、二硫鍵交換蛋白（ABP74702.1）。BLASTp 注釋分析TCSs02RR 可能屬于NtrC 亞家族，推測TCSs02 的功能可能同NtrX/NtrY，該TCS 在苜蓿中華根瘤菌和變形紅細(xì)菌中可影響胞外被膜的生成并影響細(xì)胞形態(tài)[26]。此外，可能影響細(xì)胞壁代謝和乙酰乙酸代謝。TCSs03 可能的互作蛋白包括轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子（ABP73784.1、ABP76790.1）、鉀轉(zhuǎn)運(yùn) ATP 酶（kdpB、kdpC、kdpA）、整合膜傳感器組氨酸激酶（ABP73785.1）、K+通道信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)組氨酸激酶（ABP76791.1）、整合膜傳感器組氨酸激酶（ABP75803.1）、組氨酸激酶（ABP76854.1、ABP75703.1）。注釋分析表明TCSs03 的功能同kdpDE，包括感應(yīng)K+信號(hào)刺激、調(diào)節(jié)滲透壓等。與融合HK01 存在相互作用的蛋白包括組氨酸激酶（ABP76854.1）、LuxR 家族的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子（ABP75968.1）、L-脯氨酸脫氫酶（ABP76812.1）、乙酰輔酶A 合成酶（acsA）、CheA 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)組氨酸激酶（ABP76277.1）。注釋分析表明融合HK01 可能參與Na+/脯氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)，并與三甲胺形成相關(guān)。與融合HK02 存在互作的蛋白包括組氨酸激酶（ABP76040.1）、應(yīng)答調(diào)節(jié)劑受體調(diào)節(jié)的CheW 蛋白（ABP76214.1、ABP76517.1、ABP76320.1）、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子（ABP75664.1）。融合HK02 含有WalK（NF033092）超家族的保守結(jié)構(gòu)，是一種細(xì)胞壁代謝傳感器組氨酸激酶，結(jié)合BLASTp 結(jié)果，推測融合HK02 可能參與滲透壓調(diào)節(jié)，并與細(xì)胞壁代謝、三甲胺形成相關(guān)。融合HK03 的互作蛋白可能包括組氨酸激酶（ABP76854.1、ABP76040.1）、LuxR家族的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子（ABP75364.1）、雙鳥苷酸環(huán)化酶（ABP76798.1）、應(yīng)答調(diào)節(jié)劑受體調(diào)節(jié)的CheW蛋白（ABP76214.1）。注釋分析表明融合HK03 可能參與碳代謝的調(diào)節(jié)，并與三甲胺形成相關(guān)。3 個(gè)融合HK 均有TorS 結(jié)構(gòu)域，在希瓦氏菌中，Tor 在缺氧環(huán)境下參與氧化三甲胺呼吸，表明可能與三甲胺生成相關(guān)[27]。碳源的利用影響細(xì)菌的生長繁殖，融合HK 與氧化三甲胺的還原有關(guān)，這可能有助于腐敗希瓦氏菌的營養(yǎng)物質(zhì)攝入。

表3 腐敗希瓦氏菌WS13 TCSs 功能預(yù)測Table 3 Functional prediction of TCSs in S.putrefaciens WS13

圖4 腐敗希瓦氏菌WS13 TCSs 的互作蛋白Fig.4 Interaction proteins of TCSs in S.putrefaciens WS13

2.6 孤兒HKs 和RRs 的功能預(yù)測

通過Blast P 和KEGG 蛋白數(shù)據(jù)庫注釋對孤兒HKs 和RRs 的功能進(jìn)行預(yù)測和分析。25 個(gè)孤兒HK 預(yù)測的功能主要包括：參與DNA 解旋、錯(cuò)配修復(fù)；響應(yīng)滲透壓、氮信號(hào)、金屬離子和重金屬信號(hào)刺激；調(diào)節(jié)三甲胺形成、C4-二羧酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)、有氧呼吸過程、分子伴侶表達(dá)、磷酸鹽代謝以及檸檬酸/蘋果酸代謝。2 個(gè)孤兒HK 與3 個(gè)融合HKs 一樣具有TorS 結(jié)構(gòu)域，可能與三甲胺生成相關(guān)[27]。

33 個(gè)孤兒RR 主要屬于OmpR、CheB、CheC、CheW、CheY、NarL、NtrC 等亞家族，預(yù)測其主要功能包括：控制細(xì)菌運(yùn)動(dòng)能力、磷酸化介導(dǎo)起始、調(diào)節(jié)DNA 結(jié)合、轉(zhuǎn)錄和乙酰乙酸代謝等。OmpR 是孤兒RR 中最多的亞家族，也是最大的RR 蛋白家族，在傷寒桿菌中可參與酸化，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)pH值，而未見其在希瓦氏菌屬中的報(bào)道[28]。其它部分孤兒RR 分屬于CitB、PhoB、PhoP、FixJ、KdpE、RpfG、RssB、RstA、RcpA 等亞家族，預(yù)測功能包括：參與氧化還原反應(yīng)、細(xì)菌色素調(diào)節(jié)；調(diào)節(jié)細(xì)胞表面的黏附性、磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)以及檸檬酸/蘋果酸代謝；影響細(xì)菌毒力和致病性等。

3 結(jié)論

采用生物信息學(xué)方法對腐敗希瓦氏菌WS13的TCSs 進(jìn)行全基因組鑒定、結(jié)構(gòu)域組成分析和功能預(yù)測。腐敗希瓦氏菌WS13 菌株含有3 對TCSs，3 個(gè)融合HK，25 個(gè)孤兒HKs 和33 個(gè)孤兒RRs。這些HKs 和RRs 的結(jié)構(gòu)域組成類型豐富。其中，HKs 具有16 種結(jié)構(gòu)域組成，大多數(shù)HKs 的N 末端具有接受信號(hào)的信號(hào)輸入結(jié)構(gòu)域，如跨膜區(qū)、HisKA、HAMP、PAS、PAC 等結(jié)構(gòu)域。RRs 有10種結(jié)構(gòu)域組成，并主要屬于OmpR、CheB、CheC、CheW、CheY、NarL、NtrC 等亞家族。腐敗希瓦氏菌WS13 中的成對的TCSs 與融合HKs 的數(shù)量較少，同時(shí)與多種蛋白存在相互作用。研究結(jié)果呈現(xiàn)了腐敗希瓦氏菌WS13 全基因組中TCSs 的整體情況，為后續(xù)開展TCSs 在腐敗希瓦氏菌中的功能研究及水產(chǎn)品腐敗希瓦氏菌新型抑制劑的篩選提供一定的參考。