王 羊，鄧 倩,2，鄧群仙，張慧芬，張小艾，李紅春

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，成都 611130；2. 四川省廣安市鄰水縣經(jīng)果技術(shù)推廣所，四川廣安 638500；3. 四川省眉山市彭山區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局,四川眉山 620800)

棗是原產(chǎn)中國的優(yōu)勢特色果樹[1]。中國棗產(chǎn)業(yè)分為北方產(chǎn)區(qū)和南方產(chǎn)區(qū)[2]，南方產(chǎn)區(qū)以栽植酸甜適口的鮮食棗為主[3]。

糖酸是果實最重要的內(nèi)在品質(zhì)，其組分、含量及比例共同決定果實風(fēng)味[4]。桃、梨等成熟果實以蔗糖為主要糖組分[5-6]，蔗糖磷酸合酶基因(SPS)、轉(zhuǎn)化酶基因(INV)、蔗糖合酶基因(SS)等共同影響蔗糖含量[7]。蘋果以積累果糖為主[8]，葡萄以積累葡萄糖為主[9]，己糖激酶基因(HK)、果糖激酶基因(FK)、尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因(Zj UGP)等協(xié)同調(diào)控果糖和葡萄糖含量[10]。李主要積累蘋果酸，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)、蘋果酸酶(NADP+-ME)、NAD+-蘋果酸脫氫酶(NAD+-MDH)是影響蘋果酸含量的關(guān)鍵因子[11]。柑橘為檸檬酸積累型，檸檬酸合酶基因(CS)、烏頭酸合酶基因(Aco)、蘋果酸酶基因(ME)等基因共同影響檸檬酸含量[12-13]。

‘駿棗’‘冬棗’‘贊皇大棗’屬蔗糖積累型，‘山東梨棗’和‘北京雞蛋棗’屬果糖積累型[14-15]；‘冬棗’和‘新鄭灰棗’等大多數(shù)棗的蘋果酸含量最高，‘稷山板棗’奎寧酸含量最高，而‘太古雞心蜜’琥珀酸含量最高[14,16]。不同品種的棗果實糖酸積累模式不同。目前北方棗的糖酸代謝分子機理研究較為深入，而南方鮮食棗的相關(guān)報道較少。

“蜀脆棗”為‘魯北冬棗’引種四川后發(fā)現(xiàn)的早果豐產(chǎn)優(yōu)質(zhì)芽變材料，定植第3年進入豐產(chǎn)期，無需環(huán)剝畝產(chǎn)量達2 000 kg以上，肉質(zhì)細(xì)脆，酸甜爽口，鮮食品質(zhì)極佳[17]。課題組前期已開展“蜀脆棗”果實發(fā)育規(guī)律及基本營養(yǎng)品質(zhì)的相關(guān)研究，但果實糖酸積累規(guī)律及相關(guān)代謝的機理尚不清楚。本試驗以“蜀脆棗”為試材，測定果實發(fā)育過程中可溶性糖和有機酸組分與含量，分析糖酸代謝相關(guān)基因的表達，探索“蜀脆棗”果實糖酸形成與調(diào)控機制，以期為南方鮮食棗的分子輔助育種和品質(zhì)調(diào)控奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗園位于四川省德陽市羅江區(qū)白馬關(guān)鎮(zhèn)萬佛村五組(31°26′34″N，104°46′18″E)，海拔約660 m，氣候?qū)儆趤啛釒駶櫺?，氣候溫和，四季分明，最高氣?6.6 ℃，最低氣溫-6.7 ℃，年均氣溫16.5 ℃；年均降水量910 mm，年無霜期278 d，年均日照時數(shù)1 260 h[17]。

1.2 供試材料

試驗樹為露地栽培3 a生嫁接苗“蜀脆棗”，株行距為2 m×3 m，單株為一小區(qū)，3次重復(fù)。謝花20 d后開始采集大小一致、無病蟲害的果實，前期每隔14 d采樣一次，中后期每隔7 d采樣一次[17]。花后20～34 d為幼果期，花后48～69 d為膨大期，花后76 d為白熟期，花后83 d為著色初期，花后90 d為成熟期(半紅期)。果實置冰盒中帶回實驗室，切碎，液氮處理后立即放入-80 ℃超低溫冰箱中保存。

1.3 測定指標(biāo)及方法

1.3.1 果實糖酸組分及含量的測定 糖組分及含量的測定：用液氮將果實研磨成粉末，準(zhǔn)確稱取0.5 g，加入5 mL乙醇-水(80∶20,V∶V)，80 ℃水浴30 min，常溫6 000 r/min離心10 min，上清液移至25 mL容量瓶，重復(fù)提取1次，定容后經(jīng)0.22 μm濾膜過濾待測[18]。色譜柱Innoval NH2(250 mm×4.6 mm, 5 μm)，流動相乙腈∶水 (80∶20，V∶V)，示差檢測器，流速1 mL/min，檢測池溫度40 ℃，柱溫35 ℃，進樣量10 μL[19]。

酸組分及含量的測定：用液氮將果實研磨成粉末，準(zhǔn)確稱取0.5 g，加入3 mL 0.04 mol/L的KH2PO4，超聲20 min，常溫6 000 r/min離心20 min，上清液過0.22 μm濾膜過濾待測[20]。色譜柱MZ PerfectSil Target C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm)，流動相4%甲醇水溶液，流速0.5 mL/min，柱溫25 ℃，檢測波長210 nm，進樣量10 μL[20]。

1.3.2 糖酸代謝相關(guān)基因相對表達量的分析 總RNA的提取及cDNA第一鏈的合成：參照改良CTAB法提取RNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質(zhì)量，核酸蛋白儀檢測RNA濃度。cDNA第一鏈的合成參照TOYOBO反轉(zhuǎn)錄試劑盒(ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover)。

實時熒光定量PCR：根據(jù)NCBI上棗的全基因組序列，利用Primer Premier 5.0設(shè)計有機酸代謝相關(guān)基因的引物，糖代謝引物及內(nèi)參基因引物序列參考張春梅[21](表1)。采用TOYOBO熒光定量試劑盒(THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix Without ROX)在定量PCR儀(Bio-Rad，USA)上進行擴增反應(yīng)。UBQ為內(nèi)參基因，反應(yīng)總體積10 μL，包含：THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix Without ROX 5 μL，10 μmol/L 上下游引物各0.4 μL，cDNA模板1 μL和無RNA酶水3.2 μL。PCR擴增程序：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，Tm 30 s，72 ℃ 30 s，40個循環(huán)。基因表達水平用相對表達量2-ΔΔCt表示。以上所有試驗均設(shè)3次重復(fù)，每次試驗設(shè)陰性對照。

表1 引物序列Table 1 Primers used in this study

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Excel 2016軟件進行數(shù)據(jù)處理，采用SPSS 22.0系統(tǒng)進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 “蜀脆棗”果實發(fā)育過程中的糖酸積累

2.1.1 可溶性糖組分及含量的動態(tài)分析 “蜀脆棗”發(fā)育過程中總糖含量大致呈逐漸上升趨勢，成熟期達到最大值146.83 mg/g(圖1)。果糖和葡萄糖含量相當(dāng)，為14.66.47～27.48 mg/g，發(fā)育過程中變化平穩(wěn)，約占發(fā)育前中期總糖的80%。白熟期蔗糖含量迅速上升，并在成熟期上升至最大值107.43 mg/g，約占總糖的73%。

誤差線為標(biāo)準(zhǔn)誤，不同小寫字母表示同一組分不同花后時間在0.05水平上差異顯著。下同

2.1.2 有機酸組分及含量的動態(tài)分析 “蜀脆棗”總酸含量隨果實發(fā)育整體呈現(xiàn)“W”型的變化趨勢，花后48 d達到峰值6.67 mg/g(圖2)?！笆翊鄺棥钡挠袡C酸組分主要有3種，其含量和變化趨勢均不一致。蘋果酸含量最高，呈上升-下降-上升趨勢，成熟期達3.30 mg/g，占總酸的 65.74%。檸檬酸含量次之，呈“W”型趨勢，成熟期含量為1.56 mg/g，占總酸的31.08%。酒石酸發(fā)育過程中變化不大，且含量最低，成熟期含量為0.16 mg/g，僅占總酸的3.19%。

圖2 “蜀脆棗”果實發(fā)育過程中有機酸組分及含量Fig.2 Components and contents of tartaric acid, citric acid, and malic acid during development of “Shucuizao” fruits

2.2 糖代謝相關(guān)基因的表達分析

2.2.1 蔗糖代謝途徑中相關(guān)基因的表達分析 “蜀脆棗”果實發(fā)育過程中蔗糖代謝途徑中相關(guān)基因的表達模式各不相同(圖3)。Zj SS1和Zj SS2在花后20 d的表達最高，隨果實發(fā)育整體逐漸下降；Zj SS3的表達在成熟期達峰值。Zj SPS1、Zj SPS2和Zj SPS4的表達整體呈先上升后下降的趨勢，均于花后83 d達到最大值。Zj nINV1、Zj vINV2和Zj cINV3在幼果期和膨大期有高表達，Zj vINV2在白熟期以后幾乎不表達。

圖3 “蜀脆棗”果實發(fā)育過程中蔗糖代謝途徑中相關(guān)基因的表達分析Fig.3 Analysis of relative genes expression in sucrose metabolism during development of “Shucuizao” fruits

2.2.2 己糖代謝途徑中相關(guān)基因的表達分析 己糖代謝相關(guān)基因在“蜀脆棗”果實不同發(fā)育時期存在差異表達(圖4)。Zj HK1、Zj HK5的表達在幼果期最高，隨果實發(fā)育下調(diào)，成熟期的表達最低。Zj HK3、Zj HK6、Zj UGP、Zj FK2的表達整體呈上升-下降-上升趨勢。Zj FK4的表達隨果實成熟先上升后略微下降。

2.3 果實發(fā)育過程中有機酸代謝相關(guān)基因的表達分析

2.3.1 蘋果酸代謝途徑中相關(guān)基因的表達分析 “蜀脆棗”蘋果酸代謝相關(guān)基因在不同發(fā)育時期有不同的表達模式(圖5)。Zj NADP-ME1的表達量在成熟期最低；Zj NADP-ME4的表達呈現(xiàn)“M”型趨勢。MS在果實發(fā)育前中期表達較低，于成熟期急劇上調(diào)。Zj MDH1、Zj MDH4的表達在成熟期最高。Zj FUM的表達量在花后69 d達峰值。Zj PEPC1在幼果期和膨大期的表達量較高，隨后下調(diào)，在成熟期略微上調(diào)；Zj PEPC4的表達量在花后20 d最低。Zj PEPCK1-1在果實發(fā)育中期幾乎不表達，成熟期的表達量最高。

2.3.2 檸檬酸代謝途徑中相關(guān)基因的表達分析 “蜀脆棗”果實發(fā)育過程中檸檬酸代謝相關(guān)基因有不同的表達模式(圖6)。Zj ATP-CS2和Zj ATP-CS3的表達整體呈先上升后下降趨勢，均在花后34 d表達量最高。Zj CS3、Zj NAD-IDH1-2、Zj NADP-IDH2、Zj NAD-IDH1-1、Zj Aco2-1隨果實成熟大致上升-下降-上升，在幼果期的表達量均最低。

圖6 “蜀脆棗”果實發(fā)育過程中檸檬酸代謝途徑中相關(guān)基因的表達分析Fig.6 Analysis of relative genes expression in critic acid metabolism during development of “Shucuizao” fruits

2.4 果實糖酸含量與代謝相關(guān)基因的相關(guān)性分析

2.4.1 糖含量與其代謝基因的相關(guān)性 表2是“蜀脆棗”17個糖代謝基因表達量與可溶性糖含量的相關(guān)系數(shù)。果糖含量與Zj nINV1、Zj cINV3、Zj HK1呈極顯著或顯著負(fù)相關(guān)，與Zj SPS4、Zj HK2、Zj HK6、Zj UGP呈顯著或極顯著正相關(guān)。Zj SS1、Zj nINV1、Zj cINV3與葡萄糖含量呈顯著或極顯著負(fù)相關(guān)，而與Zj HK2、Zj HK6、Zj UGP呈顯著或極顯著正相關(guān)。蔗糖含量與Zj SS2、Zj vINV2、Zj HK1、Zj HK2、Zj HK5、Zj FK4表達量呈顯著或極顯著負(fù)相關(guān)，與Zj SS3、Zj SPS1、Zj SPS2極顯著正相關(guān)。

表2 “蜀脆棗”果實發(fā)育過程中糖含量與其代謝基因的相關(guān)系數(shù)Table 2 Correlation coefficient between sugar content and its metabolism gene during development of “Shucuizao” fruits

2.4.2 有機酸含量與其代謝基因的相關(guān)性 表3為“蜀脆棗”17個有機酸代謝基因表達量與有機酸含量的相關(guān)系數(shù)。酒石酸含量與Zj NADP-ME1、Zj PEPCK1-1、Zj ATP-CS2表達量呈顯著負(fù)相關(guān)，而與Zj PEPC1呈顯著正相關(guān)。檸檬酸含量與Zj NADP-ME1、Zj NADP-ME4、Zj ATP-CS2、Zj ATP-CS3表達量呈極顯著或顯著負(fù)相關(guān)，而與Zj MS、Zj PEPCK1-1、Zj CS3、Zj NAD-IDH1-2呈顯著正相關(guān)。蘋果酸含量與Zj PEPC1、Zj PEPC4、Zj NAD-IDH1-1、Zj Aco2-1、Zj NADP-IDH1表達量呈極顯著或顯著正相關(guān)。

表3 “蜀脆棗”果實發(fā)育過程中酸含量與其代謝基因的相關(guān)系數(shù)Table 3 Correlation coefficient between organic acid content and its metabolism gene during development of “Shucuizao” fruits

3 討 論

在本研究中，“蜀脆棗”幼果期和膨大期主要積累果糖和葡萄糖，成熟期主要積累蔗糖，與‘金鈴圓棗’成熟期主要積累己糖不一致[22]?！笆翊鄺棥庇袡C酸主要由蘋果酸、檸檬酸和酒石酸組成，蘋果酸含量始終最高，與‘梨棗’等一致[23]?！笆翊鄺棥睂僬崽恰⑻O果酸積累型的優(yōu)質(zhì)鮮食棗。

糖代謝由多基因綜合調(diào)控，SS調(diào)控果糖合成蔗糖，葡萄糖在HK、UGP和SPS作用下合成蔗糖，INV調(diào)控蔗糖降解成果糖和葡萄糖[24-25]。本試驗中，Zj nINV1、Zj cINV3與果糖和葡萄糖含量呈顯著負(fù)相關(guān)，果實發(fā)育中后期INV的表達下調(diào)致使果糖和葡萄糖合成減少；ZjHK2、Zj HK6和Zj UGP與果糖和葡萄糖含量呈顯著或極顯著正相關(guān)，果實發(fā)育后期其表達量較低或變化不大，致使果糖和葡萄糖降解減少，兩方面結(jié)合導(dǎo)致果糖和葡萄糖含量變化不大。MdHK1的上調(diào)表達顯著促進了富士蘋果葡萄糖轉(zhuǎn)化[26]，與本研究不一致，推測是不同種類的果實糖代謝相關(guān)基因差異表達的結(jié)果?！笆翊鄺棥卑资炱谝院笳崽茄杆俜e累，Zj SS3、Zj SPS1和Zj SPS2迅速上調(diào)，且與蔗糖含量極顯著正相關(guān)；Zj vINV2幾乎不表達，與蔗糖呈顯著負(fù)相關(guān)。果實發(fā)育后期Zj SS3、Zj SPS1和Zj SPS2的高表達與Zj vINV2的低表達協(xié)同促進蔗糖的快速積累。本研究結(jié)果與蔣爽等[27]研究結(jié)果一致，但與Zj SS3表達促進‘駿棗’‘灰棗’和‘冬棗’果實還原糖積累的研究結(jié)果[15]相反，推測是不同品種間的糖代謝差異所致。蔗糖的迅速積累是“蜀脆棗”糖代謝的基礎(chǔ)，Zj SS3、Zj SPS1、Zj SPS2和Zj vINV2是糖代謝關(guān)鍵基因。

PEPC催化磷酸烯醇式丙酮酸生成草酰乙酸，草酰乙酸經(jīng)MDH催化生成蘋果酸，草酰乙酸與乙酰輔酶A經(jīng)CS催化形成檸檬酸，運輸至液泡，檸檬酸又被Aco可逆催化形成異檸檬酸，NADP-IDH促進異檸檬酸合成α-酮戊二酸，NAD-IDH則催化異檸檬酸生成α-酮戊二酸[28]。CS的高表達促進西瓜[29]、碰柑[30]和酸棗[21]果實中的檸檬酸積累。本試驗中，成熟期Zj PEPCK1-1、ZjMS、Zj CS3、Zj NAD-IDH1-2的高表達共同促進果實檸檬酸含量上升。Zj PEPCK1-1與檸檬酸含量相關(guān)性最強，是調(diào)控“蜀脆棗”檸檬酸代謝的關(guān)鍵基因?；ê?8～55 d和花后90 d 的Zj PEPC1、Zj PEPC4、Zj NAD-IDH1-1、Zj Aco2-1、Zj NADP-IDH1高表達協(xié)同促進了蘋果酸高水平積累。Zj PEPC1與蘋果酸含量相關(guān)性最強，是影響蘋果酸含量變化的主要因素。但馬倩倩[31]認(rèn)為Zj PEPC對酸棗中蘋果酸的代謝調(diào)控作用不大，推測果實種類的不同是造成這種差異的主要因素。蘋果酸含量是“蜀脆棗”總酸積累的主要因素，Zj PEPC1對“蜀脆棗”有機酸代謝起主導(dǎo)作用，Zj PEPC4、Zj NAD-IDH1-1、Zj Aco2-1、Zj NADP-IDH1起輔助作用。

4 結(jié) 論

“蜀脆棗”發(fā)育前期以積累果糖和葡萄糖為主，隨后蔗糖迅速積累，成為成熟期的主要糖組分；蘋果酸含量在發(fā)育過程中始終最高，其次是檸檬酸，酒石酸含量最低。“蜀脆棗”果實發(fā)育過程中糖酸代謝相關(guān)基因表達模式存在差異，相關(guān)基因的表達和調(diào)控共同影響果實的糖酸積累。Zj SS3、Zj SPS1、Zj SPS2和Zj vINV2是調(diào)控果實糖代謝的關(guān)鍵基因，Zj PEPC1是影響有機酸代謝的主要因素。