徐星科 邊陽(yáng)萍 趙婉均王秋惠殷菲*

（1.重慶理工大學(xué)藥物化學(xué)與分子藥理學(xué)重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶400054； 2.重慶理工大學(xué)藥學(xué)與生物工程學(xué)院，重慶400054）

非酒精性脂肪性肝?。╪on-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是一種肝臟脂質(zhì)積累性疾病，主要表現(xiàn)為單純的肝臟脂肪變性或非酒精性脂肪性肝炎［1］。研究表明，富含甘油三酯（triglycerides，TG）的脂滴異常累積是導(dǎo)致NAFLD 的重要機(jī)制［2］。

中藥梔子是一種藥食兩用的植物，具有多種藥理學(xué)作用［3-4］。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究表明，梔子主要活性成分京尼平苷可降低血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）和谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）水平，影響脂質(zhì)代謝，改善糖尿病小鼠肝組織炎癥，并通過(guò)調(diào)節(jié)腸道菌群和炎癥因子水平等改善NAFLD 癥狀，在保肝和肝病防治中具有廣闊的應(yīng)用前景［5-10］。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，京尼平苷是一種選擇性胰高血糖素樣肽1（glucagon-like peptide 1，GLP-1）受體激動(dòng)劑，可通過(guò)激活GLP-1 受體調(diào)節(jié)胰腺β 細(xì)胞對(duì)葡萄糖的吸收和代謝，影響胰島素分泌［11-15］。目前尚不清楚京尼平苷是如何影響肝細(xì)胞脂滴的形成，因此，本研究分別在飽和脂肪酸油酸誘導(dǎo)的肝細(xì)胞和ob／ob 小鼠動(dòng)物模型上考察京尼平苷對(duì)脂滴形成的影響。

1 材料

1.1 細(xì)胞與動(dòng)物 人源HepG2 肝細(xì)胞，購(gòu)自美國(guó)ATCC庫(kù)，在含10%胎牛血清和1%青霉素／鏈霉素（P／S）的DMEM 培養(yǎng)基中，于37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。10 只雄性8～10 周齡C57BL／6 小鼠、20 只ob／ob 小鼠購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（京）2019-0008，飼養(yǎng)于重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，在12 h／12 h 光照／黑暗、溫度（25±2）℃，相對(duì)濕度50%～60%，自由進(jìn)食飲水的環(huán)境中適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)重慶理工大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查通過(guò)［批準(zhǔn)文號(hào)（2019）研審第（201918）號(hào)］。

1.2 試劑與藥物 京尼平苷購(gòu)自北京生物制品研究所有限責(zé)任公司。DMEM 細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基、蛋白酶抑制劑、RIPA 裂解液購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；胎牛血清購(gòu)自美國(guó)HyClone 公司；胰酶、青霉、鏈霉素購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司；Tris、Glycine 購(gòu)自美國(guó)Genview 公司；Prililipin-2抗體購(gòu)自美國(guó)Proteintech 公司；β-actin 抗體購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；ECL 發(fā)光底物購(gòu)自美國(guó)Millipore 公司；BCA 蛋白濃度檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；總RNA 提取試劑盒、PCR 相關(guān)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

2 方法

2.1 分組與給藥 將20 只ob／ob 小鼠隨機(jī)分為模型組和京尼平苷組，每組10只，10 只同月齡C57BL／6 小鼠作為對(duì)照組。京尼平苷組每天灌胃給予20 mg／kg 京尼平苷，模型組及對(duì)照組灌胃等體積蒸餾水，每天1次，連續(xù)4 周。

2.2 葡萄糖耐量檢測(cè) 小鼠灌胃給藥4 周后禁食14 h，記錄體質(zhì)量，每只按照2.5 g／kg 劑量灌胃給予葡萄糖，分別在給糖前（0 min）和給糖后15、30、60、120 min 尾靜脈采血，血糖儀檢測(cè)血糖水平，繪制糖耐量曲線，計(jì)算曲線下面積。

2.3 甘油三酯、總膽固醇水平檢測(cè) 采集小鼠全血，靜置0.5 h，4 ℃、3 000 r／min 離心15 min，吸取上層血清，采用Vitros-250 化學(xué)分析儀檢測(cè)血清甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）水平。

2.4 HE 染色 將小鼠肝組織進(jìn)行固定，經(jīng)脫水、包埋、切片后用蒸餾水潤(rùn)洗1～2次，蘇木素染色1～2 s，流水洗去蘇木素染液，1%鹽酸乙醇溶液分化3～5 s，流水清洗5～10 s，堿水返藍(lán)20 s，流水清洗5～10 s，伊紅染色30～60 s，蒸餾水漂洗3～5 s，經(jīng)80%乙醇1～2 s、95%乙醇1～2 s、無(wú)水乙醇1～2 s、二甲苯（Ⅰ）2～3 s、二甲苯（Ⅱ）2～3 s 處理后中性樹膠封片，在倒置顯微鏡下觀察。

2.5 油紅O 染色 將HepG2 細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、京尼平苷組，模型組、京尼平苷組用0.6 mmol／L 油酸進(jìn)行誘導(dǎo)，對(duì)照組不作任何處理，處理8 h 后京尼平苷組加入10 μmol／L 該成分，對(duì)照組、模型組加入DMEM 培養(yǎng)基，處理24 h 后將各組細(xì)胞爬片用PBS 漂洗2次，4%多聚甲醛固定10 min，PBS 漂洗3次，60%異丙醇處理2 min，油紅O 工作液染色20 min，棄去染色液，在倒置顯微鏡下觀察。

2.6 RT-qPCR 法檢測(cè)Perilipin-2 mRNA 表達(dá) 采用RNA 提取試劑盒提取各組細(xì)胞或肝組織總RNA，定量后取1 μg，iScript cDNA 合成試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)條件為25 ℃5 min，42 ℃30 min，85 ℃5 min，4 ℃保持，反應(yīng)結(jié)束后在-20 ℃下保存，SYBR PCR MASTER MIX 試劑盒檢測(cè)Perilipin-2 mRNA 表達(dá)，反應(yīng)條件為95 ℃變性15 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共40 個(gè)循環(huán)，以βactin為參照基因，2-ΔΔCT法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)，并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理。β-actin正向引物序列為5′-GCAAGTGCTTCTAGGCGGAC-3′，反向引物序列為5′-AAGAAAGGGTGTAAAACGCAGC-3′；人Perilipin-2 基因正向引物序列為 5′-TTGCAGTTGCCAATACCTATGC-3′，反向引物序列為 5′-CCAGTCACAGTAGTCGTCACA-3′；小鼠Perilipin-2 基因正向引物序列為 5′-TGGTGAGTGGCCTGTGTTAG-3′，反向引物序列為5′-GCACACGCCTTGAGAGAAAC-3′。

2.7 Western blot 法檢測(cè)目的蛋白表達(dá) 使用RIAP 裂解液裂解細(xì)胞或肝組織，離心收集上清，得總蛋白，BCA 法定量后取20～30 μg 上樣，10%SDS-PAGE 電泳后轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上，加入5% 脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入一抗Perilipin-2（1∶2 000），在4 ℃下孵育過(guò)夜，TBST 漂洗3次，每次15 min，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗（1∶10 000）孵育1 h，TBST 漂洗3次，每次15 min，ECL 試劑顯影、成像，采用Image J 軟件分析條帶灰度值，以GAPDH 為內(nèi)參，計(jì)算Perilipin-2 蛋白相對(duì)表達(dá)。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過(guò)Origin 8.0 軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)以（）表示，2 組間比較采用Student’st檢驗(yàn)，多項(xiàng)比較采用單因素方差分析和Bonferroni檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 京尼平苷對(duì)ob／ob 小鼠體質(zhì)量、葡萄糖耐量及血清TG、TC 水平的影響 如圖1 所示，與對(duì)照組比較，模型組ob／ob 小鼠體質(zhì)量增加（P＜0.01），葡萄糖耐量降低（P＜0.05），血清TG、TC 水平均升高（P＜0.01）；與模型組比較，京尼平苷組ob／ob 小鼠體質(zhì)量減輕（P＜0.05），葡萄糖耐量升高（P＜0.05），血清TG、TC 水平均降低（P＜0.01）。

圖1 京尼平苷對(duì)ob／ob 小鼠體質(zhì)量、葡萄糖耐量及血清TG、TC 水平的影響（， n＝10）Fig.1 Effects of geniposide on the body weight，glucose tolerance，and serum TG and TC levels in ob／ob mice（， n＝10）

3.2 京尼平苷對(duì)ob／ob 小鼠肝組織中脂滴形成的影響 如圖2 所示，與對(duì)照組比較，模型組ob／ob小鼠肝組織呈現(xiàn)大量的空泡，呈明顯脂肪變性，脂滴數(shù)量和大小均增加；與模型組比較，京尼平苷組ob／ob 小鼠肝組織中的空泡減少，脂肪變性得到改善，組織更加致密，脂滴數(shù)量和大小均減少。

圖2 京尼平苷對(duì)ob／ob 小鼠肝組織中脂滴的影響Fig.2 Effect of geniposide on lipid droplets in liver tissue of ob／ob mice

3.3 京尼平苷對(duì)ob／ob 小鼠肝組織中Perilipin-2表達(dá)的影響 如圖3 所示，與對(duì)照組比較，模型組ob／ob 小鼠肝組織中Perilipin-2 mRNA 和蛋白表達(dá)均升高（P＜0.01）；與模型組比較，京尼平苷組ob／ob 小鼠肝組織中Perilipin-2 mRNA 和蛋白表達(dá)均降低（P＜0.05）。

圖3 京尼平苷對(duì)ob／ob 小鼠肝組織中Perilipin-2 mRNA（A）和蛋白（B）表達(dá)的影響（， n＝3）Fig.3 Effects of geniposide on hepatic mRNA（A）and protein（B）expressions of Perilipin-2 in ob／ob mice（， n＝3）

3.4 京尼平苷對(duì)油酸誘導(dǎo)的HepG2 細(xì)胞中脂滴形成的影響 如圖4 所示，油酸處理可明顯誘導(dǎo)HepG2 細(xì)胞中脂滴的形成，而京尼平苷干預(yù)后可明顯抑制油酸誘導(dǎo)的HepG2 細(xì)胞中脂滴的積累。

圖4 京尼平苷對(duì)油酸誘導(dǎo)的HepG2 細(xì)胞中脂滴形成的影響Fig.4 Effects of geniposide on lipid droplet formation in oleic acid-induced HepG2 cells

3.5 京尼平苷對(duì)油酸誘導(dǎo)HepG2 細(xì)胞中Perilipin-2 表達(dá)的影響 如圖5 所示，與對(duì)照組（不含京尼平苷和油酸）比較，油酸誘導(dǎo)可增加HepG2 細(xì)胞中Perilipin-2 mRNA 和蛋白表達(dá)（P＜0.01）；與模型組（0.6 mmol／L 油酸）比較，京尼平苷干預(yù)后可降低油酸誘導(dǎo)的HepG2 細(xì)胞中Perilipin-2 的mRNA 和蛋白表達(dá)（P＜0.05，P＜0.01）。

圖5 京尼平苷對(duì)油酸誘導(dǎo)的HepG2 細(xì)胞中Perilipin-2 mRNA（A）和蛋白（B）表達(dá)的影響（， n＝3）Fig.5 Effects of geniposide on mRNA（A）and protein（B）expressions of Perilipin-2 in oleic acid-induced HepG2 cells（， n＝3）

4 討論

Perilipin-2 是一種脂肪細(xì)胞因子，屬于PAT 家族蛋白成員，位于多種細(xì)胞的脂滴表面，是脂滴的主要成分之一，主要在分化的脂肪細(xì)胞中表達(dá)，在脂質(zhì)運(yùn)輸、脂滴形成和貯存中起重要作用［16］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，京尼平苷可降低ob／ob 小鼠體質(zhì)量，改善胰島素抵抗，降低血清中TG、TC 水平，同時(shí)還可減少肝臟中脂滴的積累和脂滴相關(guān)蛋白Perilipin-2 的表達(dá)，并在體外抑制油酸誘導(dǎo)的HepG2 細(xì)胞中脂滴的積累和Perilipin-2 表達(dá)。提示，京尼平苷可能在防止肥胖和過(guò)量飽和脂肪酸攝入引起的NAFLD 中發(fā)揮一定的作用。

脂滴是一種亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，由中心的中性脂質(zhì)如TG、膽固醇酯和周圍包裹的磷脂單分子層所構(gòu)成，其生命周期始于脂肪酸及膽固醇酯。在眾多調(diào)節(jié)脂滴形成和分解的分子中，脂滴表面磷脂中鑲嵌的Perilipin 對(duì)于脂滴的代謝及調(diào)節(jié)具有重要作用［17-19］。研究表明，在NAFLD中，Perilipin-2 蛋白普遍存在于肝細(xì)胞和肝星狀細(xì)胞，包裹在脂滴周圍，在所有Perilipin 蛋白中上調(diào)最為明顯［20］。Perilipin-2 會(huì)促進(jìn)TG 積累，抑制肝臟脂質(zhì)分解，促進(jìn)高脂食物誘導(dǎo)的NAFLD 癥狀［21-22］。本研究發(fā)現(xiàn)，京尼平苷在調(diào)節(jié)Perilipin-2 表達(dá)的同時(shí)抑制脂滴形成。提示，調(diào)節(jié)Perilipin-2 表達(dá)可能是京尼平苷減少脂滴積累，進(jìn)而改善NAFLD 癥狀的重要途徑。

由于NAFLD 是一種與胰島素抵抗和遺傳易感密切相關(guān)的代謝應(yīng)激性肝臟損傷，因此，首要治療目標(biāo)是改善胰島素抵抗，防治代謝綜合征及其相關(guān)終末期器官病變，目前臨床上尚缺乏安全有效的藥物。GLP-1 受體激動(dòng)劑是NAFLD 在研藥物中極有發(fā)展前景的一類［23］。肝細(xì)胞上普遍表達(dá)GLP-1 受體，GLP-1 受體激動(dòng)劑可直接調(diào)節(jié)肝臟脂質(zhì)代謝、抑制炎性反應(yīng)來(lái)保護(hù)肝細(xì)胞［24-25］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，京尼平苷是一種選擇性GLP-1 受體激動(dòng)劑，不僅可通過(guò)激活GLP-1 受體發(fā)揮抗氧化和抗炎作用［11，26］，還能調(diào)節(jié)胰腺β 細(xì)胞對(duì)葡萄糖的吸收和代謝，影響分泌胰島素，拮抗高糖和高脂誘導(dǎo)的胰腺β 細(xì)胞損傷［13-14，27-30］。本研究發(fā)現(xiàn)，京尼平苷能在體內(nèi)外降低肝細(xì)胞中脂滴的數(shù)量和大小。盡管京尼平苷調(diào)節(jié)脂滴形成的分子機(jī)制還有待于進(jìn)一步深入研究，但綜合國(guó)內(nèi)外研究進(jìn)展和本研究結(jié)果，京尼平苷可能在NAFLD 的防治中具有廣闊的應(yīng)用前景。