蔡曼妮，韓向陽(yáng)，黃詠東，鄧桃極，王裕宣，丁祥武，顏悅?cè)?

(1.海南醫(yī)學(xué)院附屬海南醫(yī)院消化內(nèi)科，海南 ?？?570311；2.湖北文理學(xué)院附屬醫(yī)院，襄陽(yáng)市中心醫(yī)院消化內(nèi)科，湖北 襄陽(yáng) 441021)

近年來(lái)，從植物中尋找具有抗腫瘤作用的天然化合物是已成為腫瘤防治的研究熱點(diǎn)[1-2]。石榴作為一種常見(jiàn)的食用、藥用植物，在我國(guó)具有悠久的栽培歷史。目前，石榴以果汁、葡萄酒或天然水果的形式被廣泛食用。石榴多酚是從石榴皮、果肉、和石榴籽中提取的多酚類(lèi)化合物，其含量在石榴皮中尤其豐富。石榴多酚除具有抗菌、抗氧化、調(diào)節(jié)血脂等保健和藥用功能外，石榴多酚還具有抗腫瘤作用[3-6]。石榴皮多酚可誘導(dǎo)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞G2-M期阻滯，抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[7]。此外，石榴皮多酚對(duì)前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C-3具有顯著的生長(zhǎng)抑制和凋亡促進(jìn)作用[8]。然而，石榴皮多酚是否具有抗食管癌作用尚未可知。本研究通過(guò)觀察石榴皮多酚對(duì)體外培養(yǎng)的食管癌細(xì)胞EC9706增殖和凋亡的影響，進(jìn)一步探索其作用機(jī)制，以期為石榴皮多酚的后續(xù)開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞 人食管癌細(xì)胞EC9706購(gòu)自上海弘順生物科技有限公司。

1.2 試劑與藥物 石榴皮多酚(純度≥80%，CAS號(hào)65995-64-4)購(gòu)自西安萃之健生物科技有限公司。RNeasy試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；第一鏈cDNA合成試劑盒、SYBRTMGreen PCR Master Mix購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清、四甲基偶氮唑藍(lán)(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)、二甲基亞砜購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；FAM96B過(guò)表達(dá)質(zhì)粒(pcDNA-FAM96B)、質(zhì)?？蛰d體(pcDNA)、FAM96B小干擾RNA(si-FAM96B)、亂序無(wú)意義陰性對(duì)照(si-NC)由上海英杰制模有限公司提供；膜聯(lián)蛋白-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；兔抗人細(xì)胞周期素D1(CyclinD1)、p21、B細(xì)胞淋巴瘤2(B cell lymphoma 2，Bcl-2)、Bcl相關(guān)X蛋白(Bcl associated X protein，Bax)、磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗體以及山羊抗兔IgG二抗購(gòu)自艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)分組 EC9706細(xì)胞采用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液于37 ℃、5% CO2、濕潤(rùn)細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。石榴皮多酚采用二甲基亞砜溶解，配置成100 mg/mL的母液，于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆茫瑢?shí)驗(yàn)時(shí)稀釋為所需質(zhì)量濃度。將對(duì)數(shù)期EC9706細(xì)胞分為對(duì)照組(常規(guī)培養(yǎng))；石榴皮多酚低、中、高劑量組(分別采用石榴皮多酚終質(zhì)量濃度為100、200、400 μg/mL的培養(yǎng)液處理24 h)；pcDNA組(轉(zhuǎn)染pcDNA)；pcDNA-FAM96B組(轉(zhuǎn)染pcDNA-FAM96B)；石榴皮多酚+si-NC組(轉(zhuǎn)染si-NC后采用石榴皮多酚終質(zhì)量濃度為400 μg/mL的培養(yǎng)液處理24 h)；石榴皮多酚+si-FAM96B組(轉(zhuǎn)染si-FAM96B后采用石榴皮多酚終質(zhì)量濃度為400 μg/mL的培養(yǎng)液處理24 h)。細(xì)胞處理后，對(duì)各指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染參照Lipofectamine 3000說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.4 RT-qPCR檢測(cè)食管癌組織中FAM96B表達(dá) 利用RNeasy試劑盒分離總RNA。利用第一鏈cDNA合成試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA。以cDNA為模板，利用SYBRTMGreen PCR Master Mix進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng)。2-ΔΔCT法分析FAM96BmRNA表達(dá)。FAM96B正向引物5′-GGAGTTGAACGTAGTAGAGCAGG-3′，反向引物5′-GACAGACCAATAAGGGTGGC-3′；GAPDH正向引物5′-AACGGATTTGGTCGTATTGG-3′，反向引物5′-TTGATTTTGGAGGGATCTCG-3′。

1.5 MTT法檢測(cè)EC9706細(xì)胞活力 每組取5×103個(gè)細(xì)胞分別鋪到96孔板，每孔加入20 μL MTT試劑，培養(yǎng)箱孵育2 h，棄去孔板中液體，每孔加入150 μL二甲基亞砜，振蕩器輕輕震蕩10 min?？瞻卓渍{(diào)零，全自動(dòng)酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm波長(zhǎng)各孔吸光度值(A)，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率=[1-(A實(shí)驗(yàn)組/A對(duì)照組)]×100%

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)EC9706細(xì)胞凋亡 收集細(xì)胞，PBS洗滌2次，加入適量結(jié)合緩沖液懸浮細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為5×105/mL，取100 μL細(xì)胞懸液，加入5 μL Annexin V-FITC混勻后，室溫避光孵育15 min，再加入5 μL PI染色，補(bǔ)充結(jié)合緩沖液至500 μL后上機(jī)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.7 Western blot檢測(cè)FAM96B、CyclinD1、p21、Bcl-2和Bax蛋白表達(dá) 收集各組EC9706細(xì)胞，PBS洗滌2次，采用RIPA裂解液提取細(xì)胞蛋白，BCA法檢測(cè)蛋白濃度。取30 μg變性后的細(xì)胞蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，濕法轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜；加入3%脫脂奶粉，于4 ℃封閉過(guò)夜，洗膜后加入稀釋的FAM96B、CyclinD1、p21、Bcl-2和Bax抗體室溫孵育2 h；洗膜后加入稀釋的二抗室溫孵育膜1 h，電化學(xué)發(fā)光試劑顯色，Quantity One軟件對(duì)蛋白條帶進(jìn)行灰度分析，以目的蛋白灰度值/GAPDH灰度值比值表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 石榴皮多酚對(duì)EC9706細(xì)胞增殖的影響 與對(duì)照組比較，石榴皮多酚各劑量組EC9706細(xì)胞增殖抑制率升高(P<0.05)，CyclinD1蛋白表達(dá)降低(P<0.05)，p21蛋白表達(dá)升高(P<0.05)；與石榴皮多酚低劑量組比較，石榴皮多酚中、高劑量組EC9706細(xì)胞增殖抑制率升高(P<0.05)，CyclinD1蛋白表達(dá)降低(P<0.05)，p21蛋白表達(dá)升高(P<0.05)；與石榴皮多酚中劑量組比較，石榴皮多酚高劑量組EC9706細(xì)胞增殖抑制率升高(P<0.05)，CyclinD1蛋白表達(dá)降低(P<0.05)，p21蛋白表達(dá)升高(P<0.05)，見(jiàn)圖1、表1。

圖1 各組細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白表達(dá)

表1 石榴皮多酚對(duì)食管癌EC9706細(xì)胞增殖的影響

2.2 石榴皮多酚對(duì)EC9706細(xì)胞凋亡的影響 與對(duì)照組比較，石榴皮多酚各劑量組EC9706細(xì)胞凋亡率升高，Bcl-2蛋白表達(dá)降低，Bax蛋白表達(dá)升高(P<0.05)；與石榴皮多酚低劑量組比較，石榴皮多酚中、高劑量組EC9706細(xì)胞凋亡率升高，Bcl-2蛋白表達(dá)降低，Bax蛋白表達(dá)升高(P<0.05)；與石榴皮多酚中劑量組比較，石榴皮多酚高劑量組EC9706細(xì)胞凋亡率升高，Bcl-2蛋白表達(dá)降低，Bax蛋白表達(dá)升高(P<0.05)，見(jiàn)圖2、表2。

圖2 石榴皮多酚對(duì)EC9706細(xì)胞凋亡蛋白(A)及凋亡率(B)的影響

表2 石榴皮多酚對(duì)EC9706細(xì)胞凋亡的影響

2.3 FAM96B在食管癌組織中的表達(dá) 與癌旁組織比較，食管癌組織中FAM96B mRNA和蛋白表達(dá)均降低(P<0.05)，見(jiàn)圖3、表3。

圖3 食管癌組織及癌旁組織中FAM96B蛋白表達(dá)

表3 FAM96B在食管癌組織中的表達(dá)

2.4 FAM96B過(guò)表達(dá)對(duì)EC9706細(xì)胞增殖和凋亡的影響 與pcDNA組比較，pcDNA-FAM96B組EC9706細(xì)胞中FAM96B蛋白表達(dá)升高(P<0.05)，說(shuō)明轉(zhuǎn)染成功。與pcDNA組比較，pcDNA-FAM96B組EC9706細(xì)胞增殖抑制率、凋亡率、p21和Bax蛋白表達(dá)均升高(P<0.05)，p21和Bcl-2蛋白表達(dá)均降低(P<0.05)，見(jiàn)圖4、表4。

注：A為FAM96B和增殖、凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)，B為細(xì)胞凋亡流式圖。圖4 FAM96B過(guò)表達(dá)對(duì)EC9706細(xì)胞增殖和凋亡的影響

表4 FAM96B過(guò)表達(dá)對(duì)EC9706細(xì)胞增殖和凋亡的影響

2.5 石榴皮多酚對(duì)EC9706細(xì)胞中FAM96B表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較，石榴皮多酚各劑量組EC9706細(xì)胞中FAM96B mRNA和蛋白表達(dá)均升高(P<0.05)；與石榴皮多酚低劑量組比較，石榴皮多酚中、高劑量組EC9706細(xì)胞中FAM96B mRNA和蛋白表達(dá)均升高(P<0.05)；與石榴皮多酚中劑量組比較，石榴皮多酚高劑量組EC9706細(xì)胞中FAM96B mRNA和蛋白表達(dá)均升高(P<0.05)，見(jiàn)圖5、表5。

圖5 各組細(xì)胞中FAM96B蛋白表達(dá)

表5 石榴皮多酚對(duì)EC9706細(xì)胞中FAM96B表達(dá)的影響

2.6 抑制FAM96B表達(dá)逆轉(zhuǎn)了石榴皮多酚對(duì)EC9706細(xì)胞增殖和凋亡的作用 與對(duì)照組比較，石榴皮多酚高劑量組EC9706細(xì)胞增殖抑制率、凋亡率、FAM96B、p21和Bax蛋白表達(dá)均升高，CyclinD1和Bcl-2蛋白表達(dá)降低；與石榴皮多酚高劑量+si-NC組比較，石榴皮多酚高劑量+si-FAM96B組EC9706細(xì)胞增殖抑制率、凋亡率、FAM96B、p21和Bax蛋白表達(dá)均降低，CyclinD1和Bcl-2蛋白表達(dá)升高(P<0.05)，見(jiàn)圖6、表6。

注：A為FAM96B和增殖、凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)，B為細(xì)胞凋亡流式圖。圖6 各組細(xì)胞增殖和凋亡水平

表6 抑制FAM96B表達(dá)逆轉(zhuǎn)了石榴皮多酚對(duì)EC9706細(xì)胞增殖和凋亡的作用

3 討論

食管癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，是引起腫瘤相關(guān)死亡的第六大原因。我國(guó)是食管癌高發(fā)國(guó)家之一，在衛(wèi)生資源匱乏的西部地區(qū)居民的主要疾病負(fù)擔(dān)[9]。臨床手術(shù)是本病最常見(jiàn)的治療方法，但由于食管癌復(fù)發(fā)率高，食管癌患者預(yù)后較差，5年生存率仍然很低[10]。因此，研究具有抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的藥物具有重大意義。本研究檢測(cè)了不同質(zhì)量濃度石榴皮多酚對(duì)EC9706細(xì)胞增殖和凋亡的影響。結(jié)果顯示，石榴皮多酚可抑制EC9706細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。隨著石榴皮多酚劑量的增加，其對(duì)EC9706細(xì)胞增殖抑制和凋亡促進(jìn)作用明顯增強(qiáng)。CyclinD1是一種細(xì)胞周期調(diào)控蛋白，其通過(guò)與細(xì)胞周期蛋白激酶結(jié)合，促進(jìn)細(xì)胞周期向S期轉(zhuǎn)化發(fā)揮促增殖作用，p21通過(guò)抑制CyclinD1/CDKs的形成發(fā)揮抗增殖作用[11]。Bax和Bcl-2是細(xì)胞抗凋亡家族的主要成員，Bax表達(dá)增加、Bcl-2表達(dá)降低可促進(jìn)線粒體膜轉(zhuǎn)換孔開(kāi)放，促進(jìn)細(xì)胞色素C釋放，激活caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，石榴皮多酚可抑制CyclinD1、Bcl-2蛋白表達(dá)，促進(jìn)p21和Bax蛋白表達(dá)。以上結(jié)果表明，石榴皮多酚通過(guò)抑制EC9706細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡在食管癌中具有抗腫瘤作用。

96序列相似的家庭成員B(family with sequence similarity 96,member B，F(xiàn)AM96B)是一種由193個(gè)氨基酸組成的小分子蛋白。目前研究顯示，F(xiàn)AM96B除在血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移及微管形成中發(fā)揮作用外，還可能就抑癌功能[13]。FAM96B在胃癌、肝癌、結(jié)腸癌中表達(dá)下調(diào)，其低表達(dá)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，上調(diào)其表達(dá)可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[14-17]。本研究發(fā)現(xiàn)食管癌組織中FAM96B表達(dá)降低，石榴皮多酚可增加EC9706細(xì)胞FAM96B的表達(dá)，提示石榴皮多酚的抗食管癌作用可能與上調(diào)FAM96B表達(dá)有關(guān)。進(jìn)一步驗(yàn)證顯示，過(guò)表達(dá)FAM96B可抑制EC9706細(xì)胞增殖，抑制CyclinD1、Bcl-2蛋白表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，促進(jìn)p21和Bax蛋白表達(dá)，與石榴皮多酚的抗腫瘤作用一致，表明FAM96B在食管癌中具有抑癌作用。此外，本研究顯示，抑制FAM96B表達(dá)可逆轉(zhuǎn)石榴皮多酚對(duì)EC9706細(xì)胞的增殖抑制和凋亡促進(jìn)作用，并影響其相關(guān)蛋白的表達(dá)。以上結(jié)果表明，石榴皮多酚在食管癌中的抗腫瘤作用與上調(diào)FAM96B表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，食管癌中FAM96B表達(dá)降低，石榴皮多酚通過(guò)上調(diào)FAM96B可抑制食管癌細(xì)胞EC9706增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。因此，石榴皮多酚在食管癌的預(yù)防治療方面具有廣闊的前景，本研究為石榴皮多酚的開(kāi)發(fā)利用奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。