李章春孫海波黨榮敏葉勁松李珀胡先運楊政敏*

（1.黔南民族醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，貴州 都勻558000； 2.貴州醫(yī)科大學(xué)，貴州 貴陽550004）

慢性非細(xì)菌性前列腺炎（chronic abacterial prostatitis，CAP）是臨床男科較為常見的病癥，占慢性前列腺炎的90%以上［1］，我國成年人發(fā)病率為13.5%～21.3%［2］，全球發(fā)病率為3%～16%［3］?；颊咧饕憩F(xiàn)為腰骶部、會陰部等酸賬不適，并伴隨尿不盡、尿頻、尿急等癥狀，常用的藥物為抗生素、α1-受體阻滯劑、非甾體類抗炎藥等，然而，此類藥物易引發(fā)胃腸出血、頭暈等不良反應(yīng)，服用時間不宜過長，所以療效并不理想［4］。近年來，隨著CAP 治療藥物研究的不斷深入，中醫(yī)藥副作用小、療效好的優(yōu)勢逐漸顯現(xiàn)。五香血藤是貴州民間特色苗藥，具有消腫鎮(zhèn)痛、去風(fēng)絡(luò)、抗腫瘤等功效。miR-155 是與炎癥、自身免疫等疾病密切相關(guān)的一種小分子RNA，能夠參與炎癥、免疫等多種生物過程［5-6］，TLR4／NF-κB 是經(jīng)典的信號通路，在細(xì)胞氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)過程中具有重要作用［7］，通過調(diào)控TLR4／NF-κB 信號通路能抑制炎癥反應(yīng)［8］?；诖?，本實驗研究五香血藤醇提物對CAP 大鼠前列腺組織miR-155表達和TLR4／NF-κB 信號通路的影響并探討其作用機制。

1 材料

1.1 動物 雄性SPF 級SD 大鼠，體質(zhì)量200～220 g，由長沙市天勤生物技術(shù)有限公司提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK（湘）2019-0013。

1.2 試劑與藥物 五香血藤購自貴州都勻市中藥材市場，經(jīng)黔南民族醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校楊政敏副教授鑒定為正品。取五香血藤15 kg，粉碎，加入萃取釜中，80 L 80%乙醇萃取3次，得浸膏1.2 kg，得率為8%，0.5% 羥甲基纖維素溶液超聲溶解，制成灌胃藥液。前列舒通膠囊（批號20200909，國藥準(zhǔn)字Z20027140，保定天浩制藥有限公司）；消痔靈注射液（批 號 20022102，國藥準(zhǔn)字Z22026175，吉林省集安益盛藥業(yè)股份有限公司）；PrimeScriptTMRT reagent Kit（for real time）（批號RR037A）、SYBR ? Premix Ex TaqTMII（Tli RNaseH Plus）（批 號RR420A）（日本TaKaRa 公司）；DEPC（焦碳酸乙二酯）（批號40718，美國Sigma 公司）；TRIzol Reagent（批號15596026，美國 Ambion公司）；RIPA 裂解液（批 號G2002）、磷酸化蛋白酶抑制劑（批號G2007）、BCA 蛋白定量檢測試劑盒（批號G2026）、HRP 標(biāo)記山羊抗兔（批號GB23303）、HRP 標(biāo)記山羊抗大鼠（批號GB23302）（上海優(yōu)選生物科技有限公司）；TNF-α（批號20201008）、IL-6（批號20201020）、IL-8（批號20201011）檢測試劑盒（武漢純度生物科技有限公司）。

1.3 儀器 LightCycler ? 96 型熒光定量PCR 儀（瑞士羅氏公司）；MIKRO220R 型低溫高速離心機（德國Hettich 公司）；Rt2100c 型酶標(biāo)檢測儀（美國Rayto 公司）；DYCZ-24DN 型雙垂直電泳儀（北京市六一儀器廠）。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥 60 只大鼠隨機分為正常組，模型組，陽性藥物組，五香血藤醇提物低、中、高劑量組，每組10只，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d。按照文獻［9］報道，將大鼠用乙醚麻醉，取仰臥位固定在消毒毛巾上，于下腹正中部脫毛、消毒打開腹腔，找到膀胱及兩側(cè)的前列腺，將25%消痔靈注射液注入前列腺背葉內(nèi)0.1 mL／側(cè)，正常組在相同部位注入同體積的無菌生理鹽水，逐層縫合，模型形成期7 d，7 d 后開始給藥。按照文獻［10-11］報道，陽性藥物組大鼠灌胃給予前列舒通膠囊水溶液354 mg／kg，五香血藤低、中、高劑量組大鼠灌胃給予藥液63、126、252 mg／kg；模型組和正常組灌胃給予等體積無菌生理鹽水，每天1次，連續(xù)給藥28 d。于末次給藥2 h后，稱定大鼠體質(zhì)量，股動脈取血后處死大鼠，分離得血清，剝離前列腺、肝臟等組織，濾紙吸干稱得濕質(zhì)量，用4%多聚甲醛將部分前列腺組織進行固定。

2.2 前列腺組織病理學(xué)觀察 取經(jīng)過4%多聚甲醛固定的前列腺組織，經(jīng)常規(guī)組織脫水、石蠟包埋、切片等處理后，HE 染色，光鏡下進行組織病理學(xué)觀察。

2.3 Western blot 法檢測NF-κB p65、TLR4 蛋白表達 取適量前列腺組織，用冷PBS 洗滌2～3次，剪碎后放置勻漿管中，加入RIPA 裂解液充分勻漿，4 ℃裂解30 min，12 000 r／min 離心10 min，收集上清，即為總蛋白溶液。BCA 法測定蛋白濃度，將蛋白溶液加入蛋白上樣緩沖液，沸水浴變性，經(jīng)SDS-PAGE 電泳分離，轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%的脫脂牛奶（0.5%TBST 配制），封閉1 h，加入NF-κB p65（1∶1 000）、TLR4（1∶1 000）一抗，4 ℃孵育過夜，用TBST 清洗3次，再加入二抗，室溫下孵育30 min，TBST清洗3次，化學(xué)發(fā)光法顯色，Image J 軟件分析灰度值，以β-actin 為內(nèi)參，計算目標(biāo)蛋白相對表達。

2.4 RT-qPCR 法檢測miR-155 表達 取適量前列腺組織，用冷PBS 洗滌后，TRIzol 法提取細(xì)胞總RNA。依照cDNA試劑盒說明進行操作，mRNA 經(jīng)反轉(zhuǎn)錄為cDNA，miR-155以U6 為內(nèi)參進行PCR 擴增。反應(yīng)體系（20 μL）為10 μL SYBR premix Ex Taq，0.4 μL 50 × ROX Reference Dye，0.4 μL Primer F（10 μmol／L ），0.4 μL Primer R（10 μmol／L），2 μL cDNA（5 ng／μL），6.8 μL ddH2O；反應(yīng)條件為95 ℃5 min，95 ℃30 s，60 ℃30 s，95 ℃15 s，共40 個循環(huán)。用2-ΔΔCT法計算相對表達量，引物序列見表1。

表1 引物序列

2.5 ELISA 法檢測TNF-α、IL-6、IL-8 水平 取大鼠前列腺組織，嚴(yán)格按照試劑說明書進行操作，檢測TNF-α、IL-6、IL-8 水平。

2.6 大鼠前列腺組織病理評分 分?jǐn)?shù)賦值標(biāo)準(zhǔn)為0分，前列腺組織結(jié)構(gòu)正常，未見明顯炎性改變；1分，前列腺間質(zhì)有少量的炎細(xì)胞浸潤，伴隨輕度水腫；2分，前列腺間質(zhì)有炎細(xì)胞浸潤，水腫明顯，1／3 面積以下的腺上皮出現(xiàn)局灶性壞死；3分，前列腺間質(zhì)炎細(xì)胞浸潤、水腫明顯，1／3＜腺上皮塊狀壞死＜1／2；4分，前列腺間質(zhì)炎細(xì)胞浸潤明顯，高度水腫，1／2 以上面積的腺上皮出現(xiàn)壞死。

2.7 統(tǒng)計學(xué)分析 通過SPSS 22.0 軟件進行處理，數(shù)據(jù)以（）表示，組間比較采用單因素方差分析并進行多重比較，相關(guān)性分析采用Pearson 分析。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 五香血藤醇提物對CAP 大鼠前列腺組織TNF-α、IL-6、IL-8 水平的影響 與正常組比較，模型組大鼠前列腺組織TNF-α、IL-6、IL-8 水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，五香血藤醇提物各劑量組TNF-α、IL-6、IL-8 水平降低（P＜0.05），并呈劑量依賴性，見表2。提示五香血藤醇提物能夠降低CAP 大鼠炎癥因子水平。

表2 五香血藤醇提物對CAP 大鼠前列腺組織TNF-α、IL-6、IL-8 水平的影響（， n＝10）

表2 五香血藤醇提物對CAP 大鼠前列腺組織TNF-α、IL-6、IL-8 水平的影響（， n＝10）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，＃P＜0.05；與陽性藥物組比較，＆P＜0.05。

3.2 五香血藤醇提物對CAP 大鼠前列腺組織NF-κB p65、TLR4 蛋白表達的影響 與正常組比較，模型組大鼠NF-κB p65、TLR4 蛋白表達升高（P＜0.05）；與模型組比較，五香血藤醇提物各劑量組大鼠NF-κB p65、TLR4 蛋白表達降低（P＜0.05），并呈劑量依賴性，見圖1、表3。提示五香血藤醇提物能夠抑制CAP 大鼠NF-κB p65、TLR4 蛋白表達。

圖1 各組大鼠前列腺組織NF-κB p65、TLR4 蛋白表達

表3 五香血藤醇提物對CAP 大鼠前列腺組織NF-κB p65、TLR4 蛋白表達的影響（， n＝10）

表3 五香血藤醇提物對CAP 大鼠前列腺組織NF-κB p65、TLR4 蛋白表達的影響（， n＝10）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，＃P＜0.05；與陽性藥物組比較，＆P＜0.05。

3.3 五香血藤醇提物對CAP 大鼠前列腺組織miR-155 表達的影響 與正常組比較，模型組大鼠miR-155 表達升高（P＜0.05）；與模型組比較，五香血藤醇提物各劑量組miR-155 表達降低（P＜0.05），并呈劑量依賴性，見表4。提示五香血藤醇提物能夠抑制CAP 大鼠miR-155 表達。

表4 五香血藤醇提物對大鼠前列腺組織中miR-155 表達的影響（， n＝10）

表4 五香血藤醇提物對大鼠前列腺組織中miR-155 表達的影響（， n＝10）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，＃P＜0.05；與陽性藥物組比較，＆P＜0.05。

3.4 NF-κB p65、TLR4 表達與TNF-α、IL-6、IL-8 水平的相關(guān)性 CAP 大鼠前列腺組織內(nèi)NF-κB p65、TLR4 蛋白相對表達值與TNF-α、IL-6、IL-8 水平呈正相關(guān)（P＜0.01），見表5。提示抑制CAP 大鼠NF-κB p65、TLR4 蛋白表達，能夠降低TNF-α、IL-6、IL-8 水平。

表5 NF-κB p65、TLR4 表達與TNF-α、IL-6、IL-8 水平的相關(guān)性分析

3.5miR-155 表達與NF-κB p65、TLR4 表達及TNF-α、IL-6、IL-8 水平的相關(guān)性 CAP 大鼠前列腺組織內(nèi)miR-155 表達與NF-κB p65、TLR4 表達及TNF-α、IL-6、IL-8 水平呈正相關(guān)（P＜0.01），見表6。提示抑制miR-155 表達，能夠?qū)F-κB p65、TLR4 及下游炎癥因子發(fā)揮正向調(diào)控作用。

表6 miR-155 表達與NF-κB p65、TLR4 表達及TNF-α、IL-6、IL-8 水平的相關(guān)性分析

3.6 五香血藤醇提物對大鼠前列腺組織病理評分的影響 與正常組比較，模型組大鼠前列腺組織病變平均分值升高（P＜0.05）；與模型組比較，五香血藤醇提物各劑量組與陽性藥物組大鼠前列腺組織病變平均分值降低（P＜0.05），見表7。提示五香血藤醇提物能夠改善CAP 大鼠前列腺組織病變程度，呈劑量依賴性。

表7 各組大鼠前列腺組織病理評分結(jié)果比較（%， n＝10）

3.7 五香血藤醇提物對CAP 大鼠前列腺組織病理學(xué)改變的影響 正常組大鼠前列腺組織結(jié)構(gòu)正常；模型組大鼠前列腺組織內(nèi)慢性炎癥細(xì)胞浸潤、間質(zhì)毛細(xì)血管充血、腺體上皮細(xì)胞增生及纖維組織增生等慢性炎癥病理學(xué)改變未見改善；各給藥組大鼠前列腺組織的慢性炎癥病理學(xué)改變均有不同程度緩解，其中五香血藤醇提物高劑量組大鼠前列腺組織內(nèi)的慢性炎癥細(xì)胞浸潤、腺體增生、血管擴張充血等慢性炎癥病理學(xué)改變明顯好轉(zhuǎn)，病理改變接近陽性藥物組，見圖2。提示五香血藤醇提物能夠緩解CAP 大鼠前列腺組織炎癥病理學(xué)改變。

圖2 各組大鼠前列腺組織病理切片（HE，×100）

4 討論

在慢性非細(xì)菌性前列腺炎免疫學(xué)病因研究中，TNF-α、IL-6、IL-8 均具有高表達。TNF-α 是促炎癥細(xì)胞因子，在免疫源、感染等因素作用下產(chǎn)生，能夠增加一氧化氮合酶和前列腺素的表達，進一步加劇前列腺組織炎癥反應(yīng)［12］；IL-6 是抗炎細(xì)胞因子，能夠下調(diào)TNF-α 等炎癥因子的合成，與前列腺炎患者疼痛呈負(fù)相關(guān)［13］；IL-8 是趨化性細(xì)胞因子，在癌癥和腫瘤相關(guān)研究中具有高表達［14］。在本研究中，與正常組比較，模型組TNF-α、IL-6、IL-8 水平升高；與模型組比較，五香血藤醇提物各劑量組和陽性藥物組大鼠的炎癥因子水平降低，其中五香血藤醇提物高劑量組下降最為明顯，逐漸接近陽性藥物組水平，表明五香血藤醇提物能夠降低炎癥因子水平，并呈劑量依賴性，能緩解CAP 大鼠的炎癥。

TLR4／NF-κB 是炎癥反應(yīng)和先天性免疫的重要信號通路，NF-κB 作為關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子是TLR4 信號通路的下游，在免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)中起到重要作用［7］。激活的TLR4 和NF-κB能夠上調(diào)TNF-α、IL-6、IL-1 等炎癥因子水平，通過降低TLR4、NF-κB 表達可以下調(diào)炎癥因子水平［15］。在本研究中，與模型組比較，五香血藤醇提物各劑量組的NF-κB p65、TLR4 蛋白表達降低，并呈劑量依賴性，五香血藤醇提物高劑量組和陽性藥物組下降最為明顯。NF-κB p65、TLR4 表達與TNF-α、IL-6、IL-8 水平呈正相關(guān)，表明五香血藤醇提物能夠通過降低TLR4 和NF-κBp65 的表達，實現(xiàn)對TNF-α、IL-6、IL-8 水平的下調(diào)。

miR-155 是一種親炎癥小分子miRNA，能夠參與免疫、炎癥、血細(xì)胞生成等生物學(xué)過程，巨噬細(xì)胞和炎癥因子能夠使其被誘導(dǎo)進而使表達升高［16］。在CAP 模型和前列腺癌研究中，miR-155 能夠激活TLR4 使NF-κB 表達升高，通過抑制miR-155 表達能夠降低NF-κB 活性［17-19］。在本研究中，與正常組比較，模型組大鼠前列腺組織miR-155 表達升高；與模型組比較，五香血藤醇提物各劑量組miR-155 表達降低，呈劑量依賴性，其中五香血藤醇提物高劑量組下降最為明顯，接近陽性藥物組水平。miR-155 表達與NF-κB p65、TLR4 表達及TNF-α、IL-6、IL-8 水平呈正相關(guān)。病理評分結(jié)果表明，五香血藤醇提物高劑量組與陽性藥物組平均分值最低；病理學(xué)檢測顯示，五香血藤醇提物高劑量組大鼠前列腺組織內(nèi)的慢性炎癥細(xì)胞浸潤等病理改變也接近陽性藥物組，表明五香血藤醇提物能夠通過抑制miR-155表達對TLR4／NF-κB p65 信號通路及下游炎癥因子水平發(fā)揮調(diào)控作用。

綜上所述，五香血藤醇提物能夠?qū)AP 大鼠炎癥起到緩解作用，其作用機制可能與下調(diào)miR-155 表達，抑制TLR4／NF-κB p65 信號通路有關(guān)。