施明雨，郭 亭,,3,，魏荷芬，應漢杰,,3，張宿義，陳 勇,,3，唐成倫

(1.江蘇集萃工業(yè)生物技術研究所有限公司，江蘇 南京 211800；2.南京高新工大生物技術研究院有限公司，江蘇 南京 211800；3.南京工業(yè)大學 國家生化工程技術研究中心，江蘇 南京 211800；4.瀘州老窖股份有限公司，四川 瀘州 646000)

唾液酸(SA)，化學名為N-乙酰基神經氨酸，是一種天然的碳水化合物[1]。在醫(yī)學領域中，唾液酸在大腦和神經系統(tǒng)的產生和發(fā)育中發(fā)揮非常重要的作用[2]。特別是對于出生體質量較輕的嬰兒，充足的唾液酸補給對嬰兒大腦的正常發(fā)育至關重要；孕婦分娩后體內的唾液酸含量水平逐漸下降，為維持體內唾液酸水平，孕婦乃至孕后仍需額外攝取足量的唾液酸。另外，唾液酸的含量還與DHA的含量有著明顯的相關性，這表明它極有可能與嬰兒的腦結構和腦功能發(fā)育有關，可能兩者都對早期腦發(fā)育有益[3]。目前，唾液酸作為一種“全能型”新食品資源，可以應用于食品、奶粉、醫(yī)藥和化妝品等眾多領域。

據(jù)中國燕窩市場分析報告顯示，2016—2020年，燕窩的需求與供給均以超過10%的速度增長，但供需矛盾非常突出，如2019年的供需差額約3 000 噸/年；隨著唾液酸的應用市場的不斷拓展，唾液酸的潛在市場需求估計為1 500 噸/年，其市場容量在300～1 000億元/年[6]。唾液酸的生產方法主要有天然提取法、酶合成法、化學合成法和微生物發(fā)酵法。唾液酸在天然原料中的含量很低，所以唾液酸的天然提取法應用有限；唾液酸酶合成法的缺點是原料成本高，這在一定程度上限制了酶合成法的規(guī)?；a；唾液酸的化學合成法所需的反應條件苛刻(如氧化過程需要在-78 ℃進行)，不具備優(yōu)勢；微生物發(fā)酵法生產唾液酸具有原料廉價、反應條件溫和、易于放大的優(yōu)勢，是最具產業(yè)化前景的方法。

聚唾液酸(polysialic acid，PSA)是唾液酸單體通過α-2，8和/或者α-2，9糖苷鍵連接而成的線性多聚糖，以莢膜的形式存在于少數(shù)幾種致病菌細胞的表面。1959年，Barry和Goebel首先在大腸桿菌(Escherichiacoli) K-235和K-1中發(fā)現(xiàn)該聚合物[4]。在固體發(fā)酵過程中,聚唾液酸通常以夾膜的形式附于細胞表面；在液體發(fā)酵過程中，由于攪拌等作用，聚唾液酸通常以黏液的形式脫落到發(fā)酵液中。將聚唾液酸進行酸水解或酶水解后，離純化可得到唾液酸,這是工業(yè)化發(fā)酵生產唾液酸的基礎[5]。

現(xiàn)階段的聚唾液酸生產菌株主要是大腸桿菌，野生型大腸桿菌聚唾液酸的產量一般都不高且發(fā)酵水平不穩(wěn)定，所以大腸桿菌的工業(yè)化發(fā)酵生產產量普遍較低(5～6 g/L)，一定程度上限制了其應用。Rode等[7]利用大腸桿菌E.coliK92發(fā)酵生產聚唾液酸，產量為1.6 g/L。Stark等[8]利用E.coli通過溶氧反饋補料發(fā)酵生產聚唾液酸，產量3 g/L。國內對聚唾液酸的研究起步較晚，目前國內聚唾液酸的發(fā)酵水平較低，發(fā)酵成本較高。詹曉北等[9]對聚唾液酸的發(fā)酵動力學以及pH控制補料進行了研究。張琦等[10]通過兩階段攪拌策略發(fā)酵生產聚唾液酸，產量為3.966 g/L。劉金龍[11]優(yōu)化聚唾液酸生產工藝，進行了500 L規(guī)模的中試放大驗證，聚唾液酸產量達到5.5 g/L。

誘變篩選技術是獲得高產菌株的有效手段之一，但高產聚唾液酸選育過程繁瑣。國外關于唾液酸的研究很多,但是主要都是關于唾液酸及其衍生物生物生理活性的研究。本研究利用常壓室溫等離子體(ARTP)誘變和微生物高通量自動挑選儀，誘變選育得到高產聚唾液酸菌株，通過高密度發(fā)酵條件的優(yōu)化，提升聚唾液酸的生產效率，為發(fā)酵法制備唾液酸的產業(yè)化提供良好的生產菌種。

1 材料與方法

1.1 材料

樣品采集自某天然水體。

EscherichiacoliSA-1，由江蘇集萃工業(yè)生物技術研究所有限公司微生物育種平臺誘變篩選并保藏。

葡萄糖(食品級)，山東西王藥業(yè)有限公司；山梨醇、瓊脂，NaCl、MgSO4、K2HPO4、KH2PO4，國藥集團化學試劑有限公司；酵母粉、蛋白胨(AR)，OXOID公司。

固體培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10、NaCl 10、酵母粉5、瓊脂20；滅菌前pH自然。

種子培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10、NaCl 10、酵母粉5；滅菌前pH自然。

鑒別培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖30、KH2PO41.0、蛋白胨10、MgSO40.6、瓊脂20；滅菌前pH 7.6。

搖瓶培養(yǎng)基(g/L)：山梨醇40、(NH4)2SO44.94、K2HPO4·3H2O 5.2、蛋白胨10、MgSO41.2；滅菌前pH 7.6。

上罐培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20、玉米漿20、K2HPO4·3H2O 2.5、KH2PO45.0，MgSO40.9、NaCl 5；pH 6.4。

1.2 主要儀器

ARTP-M型等離子誘變儀，無錫天木清源生物科技有限公司；QPix420型微生物高通量全自動挑選儀，美谷分子儀器(上海)有限公司；SW-CJ-1FD型超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司；GENESYS 10S型分光光度計，賽默飛世爾科技(中國)有限公司；ZQZY-CT型振蕩培養(yǎng)箱，上海知楚儀器有限公司；T&J-Btype 10 L*2發(fā)酵系統(tǒng)，迪必爾生物工程(上海)有限公司；PL600E/02型電子稱，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；G180DWS型立式自動壓力蒸汽滅菌鍋，致微(廈門)儀器有限公司；Centrifuge 5424R型高速離心機，艾本德中國有限公司。

1.3 方法

1.3.1 PSA含量測定

采用間苯二酚-鹽酸法[12]，測定PSA含量。

1.3.2 菌株的分離和純化

將所取水樣逐級稀釋，分別涂布在鑒別培養(yǎng)基(另加溴甲酚紫10 g/L)上，通過多次稀釋和挑選單菌落劃線進行純化，獲得多株菌株，編號保存于本實驗室。

1.3.3 菌種的生理生化鑒定和進化樹分析

Biolog細菌鑒定:采用Biolog微生物自動分析系統(tǒng)(MicroStation，Biolog公司)，細菌純培養(yǎng)采用Biolog BUG 的固體培養(yǎng)基,37 ℃恒溫培養(yǎng)12 h，再將菌落用液體培養(yǎng)基(IF - B)稀釋，稀釋的菌液加入到Gen Ⅲ微板中(每個孔100 μL),37 ℃ 恒溫培養(yǎng)24 h，然后用MicroStation進行鑒定。

將測序結果提交GenBank進行BLAST分析。選取同源性相近的序列，再用MEGA7軟件對選取的序列進行編輯，并構建系統(tǒng)進化樹。

1.3.4 ARTP誘變

從超低溫冰箱內取出甘油管劃線于LB固體平板，挑選單菌落接種至一級種子液(LB，裝液量20 mL，于100 mL搖瓶中)，于37 ℃、200 r/min培養(yǎng)過夜。按4%的接種量將一級種子液轉接至二級種子液(LB，裝液量20 mL)，于37 ℃、200 r/min培養(yǎng)約3 h，OD600達到0.6～0.8，取菌液1 mL，用無菌生理鹽水梯度稀釋104，制成誘變菌懸液。取10 μL菌懸液均勻涂布于載片上，放置在ARTP操作室中：高度2 mm，通氣量10 L/min(0 ℃，1個標準大氣壓)，功率100 W，分別處理0、10、20、30、35、40、45和50 s。處理完的載片，迅速轉移至1 mL生理鹽水中，充分振蕩后涂布于含溴甲酚紫的鑒別培養(yǎng)基中，每個梯度做3個平行實驗，平板放置于37 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，記錄平板上的活菌數(shù)并計算致死率。致死率按式(1)計算。

(1)

式中：A為未誘變處理平板上菌落數(shù)；L為誘變處理后平板上菌落數(shù)。

1.3.5 高產菌株篩選

1) 初篩。利用微生物高通量自動挑選儀掃描鑒別培養(yǎng)基平板上變色光圈直徑(D)與菌落直徑(d)比值較大的菌落，自動挑選至含搖瓶培養(yǎng)基的96孔板(裝液量100 μL)，37 ℃、150 r/min培養(yǎng)72 h，測定各孔菌株的PSA含量。每株單菌落做2個平行試驗，復挑至Copy板培養(yǎng)24 h，作為初篩種子保藏甘油管。

2) 搖瓶復篩。將初篩得到菌株甘油管從超低溫冰箱取出劃線接種于LB固體平板，挑選單菌落接種至一級種子液(LB，裝液量20 mL)，于37 ℃、200 r/min培養(yǎng)過夜。按2%的接種量將一級種子液轉接至含搖瓶培養(yǎng)基的搖瓶中(LB，裝液量100 mL于500 mL搖瓶中)，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)72 h。以間苯二酚法檢測PSA含量，以出發(fā)菌株為對照，篩選PSA產量較高的菌株。

1.3.6 細胞生物量測定

菌體量測定取一定量發(fā)酵液稀釋一定倍數(shù)后測定OD600，OD600=1.0相當于0.45 g干菌體的質量(以1 L發(fā)酵液計)。

1.3.7 遺傳穩(wěn)定性驗證

對獲得的突變菌株進行5次傳代，經過搖瓶(裝液量100 mL)37 ℃、200 r/min下培養(yǎng)72 h，測定其各代的SA產量、生物量、發(fā)酵結束pH，驗證菌種的遺傳穩(wěn)定性。

1.3.8 高密度發(fā)酵條件優(yōu)化

在10 L發(fā)酵罐上對篩選的高產菌株進行高密度發(fā)酵，優(yōu)化最佳產高PSA的高密度培養(yǎng)條件。優(yōu)化后的培養(yǎng)條件：10 L玻璃發(fā)酵罐裝液量為5 L、接種量為4%、發(fā)酵溫度為37 ℃并以15%氨水控制pH在6.4，通過聯(lián)動調節(jié)攪拌和通氣量控制溶解氧在30%以上，采用恒速補料策略(發(fā)酵5 h開始以100 mL/h的速率)進行補料至發(fā)酵結束,補料培養(yǎng)基為500 g/L葡萄糖。

2 結果與分析

產聚唾液酸大腸桿菌菌株的選育過程通常是酸堿指示劑為初篩條件，然后通過間苯二酚法檢測聚唾液酸含量來篩選出高產菌株，如高霖等[13]以溴甲酚紫為酸堿指示劑，對大腸桿菌SA-1進行常溫常壓等離子體(ARTP)和硫酸二乙酯(DES)誘變，然后在含酸堿指示劑的平板上人工挑選光圈、菌落較大的菌株，整個過程工作枯燥，步驟單一，操作人員容易疲勞、出錯。高產聚唾液酸的大腸桿菌菌株的獲得一定是基于龐大的突變庫，本研究將酸堿指示劑和高通量自動挑選儀結合進行自動化高通量篩選，經過多輪篩選獲得高產唾液酸大腸桿菌菌株。

2.1 產唾液酸菌株篩選

從天然水體取得水樣，通過溴甲酚紫的鑒別培養(yǎng)基共分離純化出50株菌，并借助全自動菌落挑選儀的顏色識別功能進行高通量自動化挑選培養(yǎng)基上各菌株的變色光圈直徑(D)/菌落直徑(d)比值較大的唾液酸突變株，經過多輪篩選獲得高產唾液酸大腸桿菌菌株，篩選出6株菌株，見表1。進一步檢測6株菌株聚唾液酸含量(間苯二酚法)，其產量為0.01～0.20 g/L，其中5號菌株產量最高(0.20 g/L)，記為SA-1，選作為后續(xù)研究菌株。

表1 產聚唾液酸菌株的初篩結果Table 1 Preliminary screening results of polysialic acid producing strains

2.2 菌株鑒定

將菌株SA-1接種于LB固體培養(yǎng)基中，菌落邊緣整齊、濕潤、透明、有光澤；對菌株SA-1進行Biolog鑒定(表2)，相似度大于0.5；另外，對菌株SA-1系統(tǒng)進化樹同源性分析，結果見圖1。由圖1可知：菌株SA-1與大腸桿菌144的同源性達100%。選取序列相近的序列進行系統(tǒng)進化樹的分析，測序序列與大腸桿菌K235的同源性達100%。綜合2種鑒定結果判定該菌為大腸桿菌。

表2 菌株SA-1的Biolog鑒定結果Table 2 Results of strain SA-1 by Biolog identification

圖2 菌體SA-1系統(tǒng)進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain SA-1

2.3 ARTP誘變結果

產唾液酸大腸桿菌ARTP誘變存活曲線如圖3所示。

圖3 E.coli SA-1的ARTP誘變存活曲線Fig.3 Survival curve of E.coli SA-1 by ARTP

由圖3可知：在0～30 s時，隨著照射時間的增加，存活率在逐步降低；照射時間≥40 s時存活率接近于0；而當照射時間為35 s時，存活率為19.20%，選取該照射時間下誘變的菌落進行培養(yǎng)。

2.4 高產菌株篩選

出發(fā)菌株SA-1通過ARTP誘變后，經溴甲酚紫鑒別培養(yǎng)基初篩，再通過搖瓶復篩，經過5輪篩選獲得搖瓶發(fā)酵唾液酸產量最高的突變菌株SA-18，其搖瓶產量為0.95 g/L，是出發(fā)菌株產量(0.20 g/L)的4.75倍。

2.5 菌株遺傳穩(wěn)定性驗證

為檢測突變菌株E．coliSA-18產PSA的遺傳穩(wěn)定性，連續(xù)培養(yǎng)了8代，測定各代發(fā)酵參數(shù)，實驗結果如表3所示。

表3 E.coli SA-18的遺傳穩(wěn)定性測試Table 3 Genetic stability test of E.coli SA-18

由表3可知：各代菌株發(fā)酵結束時的PSA產量在0.95 g/L左右，檢測指標較為穩(wěn)定，說明菌株SA-18具有良好的遺傳穩(wěn)定性。

2.6 高密度發(fā)酵過程中磷酸鹽濃度優(yōu)化

目前，聚唾液酸發(fā)酵生產過程通常都采用較高濃度磷酸鹽和山梨醇為碳源的培養(yǎng)基，高質量濃度磷酸鹽(20 g/L K2HPO4)可以有效提高PSA的產量和菌體濃度[14]，但以山梨醇碳源進行發(fā)酵時，山梨醇并非速效碳源，導致細胞生長代謝較慢，發(fā)酵結束培養(yǎng)基中會積累大量的磷酸鹽，磷酸鹽在發(fā)酵體系中的另外一個重要作用就是作為緩沖體系，而SA的分離需要經過高濃度的酸來酸解，過高濃度的磷酸鹽勢必會大幅增加酸解過程酸的消耗，不利于SA的分離。本研究在10 L發(fā)酵罐中進行SA的高密度發(fā)酵，以葡萄糖為碳源，采用恒速補料的方式，發(fā)酵初始培養(yǎng)基不變，通過在補料培養(yǎng)基中分別添加0、2.5、5.0、7.5和10.0 g/L K2HPO4進行發(fā)酵，發(fā)酵結果如圖4和5所示。

圖4 磷酸鹽用量對誘變菌株SA-18發(fā)酵過程細胞生長的影響Fig.4 Effects of phosphate concentrations on cell growth in the fermentation process of SA-18 mutated strain

圖5 K2HPO4用量對菌株SA-18產SA的影響Fig.5 Effects of different phosphate concentrations on SA in SA-18

由圖4和5可知：補料培養(yǎng)基中K2HPO4用量為0、2.5 g/L時，菌體生長速率相對偏慢，最終唾液酸產量相較低；而當K2HPO4為7.5、10.0 g/L時，菌體前期生長迅猛，但發(fā)酵后期菌濃下降，即菌體自溶，后期SA合成速率也下降；當K2HPO4為5.0 g/L時，菌體生長穩(wěn)定，最終SA產量也達到最高值16.10 g/L。

3 結論

為獲得高產聚唾液酸的菌株，本研究首先從天然水體中獲得樣品，經鑒別培養(yǎng)基篩選到產唾液酸出發(fā)菌株SA-1。進一步通過優(yōu)化最佳致死率等條件得到最佳誘變條件，出發(fā)菌株經ARTP等離子體誘變后獲得大量突變株。借助全自動菌落挑選儀的顏色識別功能進行高通量自動化挑選高產唾液酸突變株，經過多輪篩選獲得高產聚唾液酸大腸桿菌菌株SA-18(搖瓶水平達0.95 g/L)。在10 L發(fā)酵罐中，對突變菌株SA-18進行高密度發(fā)酵培養(yǎng)，優(yōu)化補料培養(yǎng)基中的K2HPO4濃度，當K2HPO4用量為5.0 g/L時，此時SA產量達到16.10 g/L。