陳文忠，丘曉丹，肖 杭，莊 翌，程 光

(1.南京綠葉制藥有限公司 研發(fā)中心，江蘇 南京 210061；2.南京醫(yī)科大學 實驗動物中心，江蘇 南京 210009)

羥基喜樹堿(hydroxycamptothecin，HCPT)為拓撲異構酶Ⅰ特異性抑制劑，是有效的抗腫瘤藥物。羥基喜樹堿注射液(M-HCPT)已經用于臨床，因為存在半衰期較短、靶向性較差的缺點，臨床應用時需延長給藥時間或延長療程，導致骨髓抑制和消化道毒性相關的劑量限制性毒性(DLT)也隨之增加，從而限制了其臨床應用[1-5]。脂質體作為一種新型劑型，可以通過增加羥基喜樹堿重要活性基團δ內酯環(huán)在水溶液和血液中的穩(wěn)定性來改善藥物的藥代動力學特性和體內組織分布，增加其對腫瘤組織的靶向性和緩釋性，從而達到增強療效、降低毒性的目的[6-13]。

本課題組前期已經完成羥基喜樹堿脂質體的研制及制備，同時評價了羥基喜樹堿脂質體的小鼠體內抗腫瘤藥效且取得突破性的進展[14]。本研究依據中國食品藥品監(jiān)督管理局(NMPA)發(fā)布的新藥非臨床藥理毒理相關指導原則[11-12]，進行了羥基喜樹堿脂質體給予Beagle犬靜脈滴注4周的長期毒性試驗，觀察其毒性反應及其可逆性，發(fā)現潛在毒性靶器官，并與市售普通制劑羥基喜樹堿注射液的毒性進行比較研究，以期為臨床研究提供依據。

1 材料與方法

1.1 藥品與儀器

羥基喜樹堿原料藥，美爾雅(集團)美升藥業(yè)有限公司；蛋黃卵磷脂，南京綠葉制藥有限公司；膽固醇，南京新百藥業(yè)有限公司；環(huán)磷酰胺(批號：03112721)，江蘇省恒瑞醫(yī)藥股份有限公司；甲醇、乙腈為色譜純試劑，其他試劑為市售分析純。

ADVIA 120型全自動血液分析儀，拜耳公司；CA-1500型血凝儀，希森美康醫(yī)用電子(上海)有限公司；XPAND全自動生化儀，Dade-Behring公司；EasyLyte plus鉀鈉氯電解分析儀，MEDICA公司；ECG-651心電圖儀，上海光電公司；徠卡-2015切片機，德國徠卡公司；TSJ-Q型全自動封閉式組織脫水機、BMJ-III型包埋機、PHY-III型病理組織漂烘儀，常州中威公司；顯微鏡，尼康儀器(上海)有限公司；Mastersize 2000型激光粒徑分析儀，英國MALVERN公司；島津高效液相色譜儀，日本島津公司。

1.2 動物

普通級Beagle犬30只，雌雄對半，7～8月齡，體質量7～9 kg，南京新學人科技開發(fā)有限公司，合格證號：SCXK(蘇)2002-0028。

1.3 方法

1.3.1 羥基喜樹堿脂質體的制備及表征

1)羥基喜樹堿脂質體的制備。將蛋黃卵磷脂、膽固醇、羥基喜樹堿溶于適量無水乙醇中，過0.22 μm濾膜除菌，濾液置茄形瓶中旋轉蒸發(fā)，減壓抽干成膜[13]。將枸櫞酸鈉、枸櫞酸溶于適量質量分數5%葡萄糖注射液，pH 5.0左右過0.22 μm濾膜除菌，再將此溶液加入上述茄形瓶中洗膜，洗膜完全后置于熱水浴中孵育20 min，再冷卻后進行高壓均質處理，并經0.22 μm濾膜過濾除菌。按每瓶含2 mg羥基喜樹堿進行分裝、凍干、壓塞、出箱、軋口，即得羥基喜樹堿脂質體。

2)羥基喜樹堿脂質體的粒徑及分布研究。取一瓶羥基喜樹堿脂質體，加5%葡萄糖注射液4 mL振蕩溶解，搖勻，取適量樣品加入到5%葡萄糖分散溶劑中，用Mastersize2000型激光粒徑分析儀進行測定。

3)羥基喜樹堿脂質體的含量測定。采用高效液相色譜外標法測定含量，該法準確、靈敏、分離效果好，專屬性強，是制劑分析的首選方法。色譜柱為Lichrospher 5- C18，4.6 mm×250 mm，5 μm(江蘇漢邦科技有限公司)，流動相為甲醇-水溶液(兩者體積為55∶45)，檢測波長266 nm，流速1 mL/min，進樣量20 μL，理論塔板數≥1 500。精密稱取羥基喜樹堿對照品適量，用甲醇制成每1 mL中約含100 μg的溶液作為儲備液，然后分別取儲備液適量，加流動相2 mL并用甲醇稀釋制成1 mL中含0.2、1.0、5.0、10.0、20.0、35.0和50.0 μg羥基喜樹堿溶液作為標準溶液，取20 μL進樣，記錄色譜圖，以質量濃度ρ為Y，峰面積A為X，進行線性回歸，繪制標準曲線。將樣品峰面積帶入標準曲線即可測得羥基喜樹堿含量。

4)羥基喜樹堿脂質體的包封率及載藥量測定。精密量取供試品溶液0.2 mL，加入已平衡好的凝膠柱內，用洗脫溶液洗脫。先定量收集15 mL混濁液(脂質體部分)，置于25 mL量瓶中加水至刻度后搖勻，精密量取1 mL置于2 mL量瓶中加甲醇至刻度后搖勻，按照含量測定方法精密量取20 μL，進行液相色譜分析，記錄色譜圖，測得峰面積(Ae)。

凝膠柱接著用5 mL 33%乙醇、5 mL 66%乙醇和100%乙醇進行梯度洗脫，定量收集25 mL(即未包入脂質體的游離羥基喜樹堿部分)，搖勻，按照含量測定方法精密量取20 μL，進行液相色譜分析，記錄色譜圖，測得峰面積(Af)。

另精密吸取供試品溶液0.2 mL置于10 mL量瓶內，先加2 mL流動相，再用甲醇稀釋至刻度后搖勻，照含量測定方法精密量取20 μL，進行液相色譜分析，記錄色譜圖，測得總峰面積(At)。

按式(1)～(2)計算包封率和回收率。

羥基喜樹堿脂質體載藥量的計算見式(3)。

(1)

(2)

(3)

1.3.2 劑量選擇依據

根據前期荷瘤小鼠藥效學結果，羥基喜樹堿脂質體1 mg/kg劑量對小鼠移植性腫瘤H22、S180均有明顯抑制作用，與溶媒對照組比較，抑瘤率為80%左右。羥基喜樹堿脂質體的臨床擬用劑量為6 mg/(人·日)，按體質量60 kg計，約相當于0.10 mg/(kg·d)。

綜合動物模型有效劑量、臨床擬用劑量及毒性預試驗結果，設置本研究高、中、低組劑量為1.2、0.6和0.3 mg/kg，約相當于臨床擬用劑量的12、6和3倍。

1.3.3 分組與給藥

成年Beagle犬30只按照體質量和性別隨機分為生理鹽水對照組，市售羥基喜樹堿注射液對照組，羥基喜樹堿脂質體低、中、高劑量實驗組，每組6只，雌雄對半。低、中、高劑量實驗組分別給藥0.3、0.6和1.2 mg/kg的羥基喜樹堿脂質體，市售普通制劑對照組給予1.2 mg/kg羥基喜樹堿注射液，4.0 mL/kg靜脈滴注，給藥速度為1 mL/min，每日1次，連續(xù)給藥2 d停藥2 d，共連續(xù)滴注4周，共給藥14次。停藥后繼續(xù)觀察兩周。

1.3.4 檢測指標

給藥期及恢復期每日兩次觀察動物的臨床癥狀，體質量和攝食量每周稱量1次。給藥前、給藥4周及恢復2周結束時檢查動物的體溫、心電、尿液和糞便，采集靜脈血液進行血生化及血液學檢查。

給藥結束每組取4只動物，恢復期結束取剩余2只動物安樂死后進行解剖，對肝、肺、腎及腦等臟器進行稱質量并計算臟器系數(臟器系數=器官質量(濕質量)/體質量×100%)。

所有臟器采用10%福爾馬林溶液室溫固定24 h以上，用全自動封閉式組織脫水機對固定的組織進行脫水，采用石蠟包埋機進行包埋，用切片機進行切片，切片厚度為3～5 μm，將組織切片移入40 ℃的恒溫熱水器中，待組織片完全展開后將其貼附于載玻片上，經組織漂烘儀56～60 ℃烤片30～60 min后，采用蘇木素和伊紅進行染色(HE染色)和封片后，在顯微鏡下觀察組織病理學變化。同時采集胸骨骨髓制作涂片，瑞氏和姬姆薩氏混合染色后進行骨髓細胞分類計數。

1.3.5 統(tǒng)計分析

所有數據均采用x±s 表示，試驗計量數據以方差分析、t-檢驗進行藥物組與對照組之間的差異比較。

2 結果與討論

2.1 羥基喜樹堿脂質體的表征

2.1.1 羥基喜樹堿脂質體粒徑及分布

經馬爾文激光粒度分析儀測定，所得羥基喜樹堿脂質體031031、031105及031109這3批平均粒徑結果見表1。由表1可知：3個批號的羥基喜樹堿脂質體的平均粒徑(D50)為0.357～0.406 μm，粒徑分布特征值D10、D50和D90的結果相似，說明制備的羥基喜樹堿脂質體的重現性好。

表1 羥基喜樹堿脂質體粒徑及分布Table 1 Particle size and distribution of hydroxycamptothecin liposomes

2.1.2 羥基喜樹堿脂質體的含量測定

采用高效液相色譜外標法測定含量，羥基喜樹堿對照品以質量濃度(ρ)對主峰面積A進行回歸，結果見表2。由表2的數據得ρ= 0.000 009 722A-0.054 72，R=0.999 9，表明羥基喜樹堿在0.204～51.0 μg/mL范圍內與峰面積呈線性關系。

表2 羥基喜樹堿的標準曲線Table 2 Standard curve of hydroxycamptothecin

取3個不同批次031031、031105和031109脂質體供試品，根據主峰峰面積，以外標法計算出羥基喜樹堿的質量分別為1.98、1.96 和1.97 mg，質量分數分別為98.9%、98.0%、98.5%，由此得到本方法的最低檢測限為0.04 ng。

2.1.3 羥基喜樹堿脂質體的包封率及載藥量測定

采用凝膠柱法測定羥基喜樹堿脂質體的包封率和載藥量，結果見表3。由表3可知：3批羥基喜樹堿脂質體包封率為93%～95%，包封率較高，重現性好，滿足藥典對脂質體藥物的包載要求。計算載藥量為0.75%左右。

表3 羥基喜樹堿脂質體包封率及載藥量測定結果Table 3 Encapsulation efficiency and drug loading of hydroxycamptothecin liposomes

2.2 羥基喜樹堿脂質體對Beagle犬體質量和攝食量的影響

考察羥基喜樹堿脂質體經靜脈滴注給藥(0.3、0.6和1.2 mg/kg)對Beagle犬體質量及攝食量的影響，結果見表4。給藥期間，籠旁觀察結果：在1.2 mg/kg羥基喜樹堿脂質體及同劑量的羥基喜樹堿注射液給藥后動物陸續(xù)出現食欲不佳、糞便稀溏和活動抑制現象，部分動物出現嘔吐和便血。在0.6 mg/kg劑量下部分動物出現類似反應，但癥狀較輕。由表4可知：給藥期后兩周，與對照組相比，1.2 mg/kg羥基喜樹堿脂質體及羥基喜樹堿注射液引起動物的體質量和攝食量顯著降低(P<0.01)。以上變化與羥基喜樹堿脂質體給藥治療相關，但停藥后可自行恢復。

表4 羥基喜樹堿脂質體對Beagle犬體質量的影響(Mean±SD)Table 4 Effects of hydroxycamptothecin liposomes on the body weight of Beagle dogs (Mean±SD) mg

2.3 羥基喜樹堿脂質體對Beagle犬血液學和血生化各項指標的影響

考察羥基喜樹堿脂質體注射液經靜脈滴注給藥(0.3、0.6和1.2 mg/kg)對Beagle犬靜脈血液相關指標的影響，結果分別見表5～6。由表5～6可知：與陰性對照組相比，1.2 mg/kg羥基喜樹堿脂質體引起動物單核細胞(MONO)和網織紅細胞(RETC)顯著降低(P<0.01)，0.6 mg/kg脂質體劑量組動物單核細胞(MONO)、網織紅細胞(RETIC)百分數、白細胞(WBC)、嗜酸粒細胞(EOS)、未染色大粒細胞(LUC)百分數、淋巴細胞(LYMPH)、嗜堿粒細胞(BASO)等指標明顯降低(P<0.05，P<0.01)；血液生化水平方面，1.2 mg/kg羥基喜樹堿脂質體引起犬尿素氮(BUN)顯著升高(P<0.05)。2周恢復期結束時，以上異常指標均恢復正常。

表5 羥基喜樹堿脂質體對Beagle犬血液學的影響(Mean±SD)Table 5 Effects of hydroxycamptothecin liposome on hematology of Beagle dogs(Mean ±SD)

表6 羥基喜樹堿脂質體對Beagle犬血清生化BUN指標的影響(Mean ±SD)Table 6 Effects of hydroxycamptothecin liposomes on serum biochemical parameter of BUN in Beagle dogs (Mean ±SD) mmol·L-1

2.4 羥基喜樹堿對體溫、心電、尿液和糞便指標的影響

考察羥基喜樹堿脂質體經靜脈滴注給藥(0.3、0.6和1.2 mg/kg)對Beagle犬體溫、心電、尿液和糞便的影響(數據未顯示)。結果發(fā)現：與給藥前相比，1.2 mg/kg羥基喜樹堿脂質體高劑量組和羥基喜樹堿注射液組少量動物肉眼可見糞便帶血，但2周恢復期結束時已恢復正常。除此之外，各個給藥組動物的尿液、體溫和心電圖參數未見明顯異常。

2.5 羥基喜樹堿對臟器系數的影響

羥基喜樹堿脂質體經靜脈滴注給藥Beagle犬0.3、0.6和1.2 mg/kg，每日1次，連續(xù)給藥2 d，停藥2 d，連續(xù)滴注4周，在28 d給藥結束及2周恢復期結束時采集Beagle犬肝、肺、腎和腦進行稱質量并計算臟器系數，結果見表7。由表7可知：與陰性對照組相比，1.2 mg/kg和0.6 mg/kg羥基喜樹堿脂質體組動物肝臟器系數降低及腦臟器系數增加(P<0.01)；1.2 mg/kg 脂質體劑量組引起腎臟器系數增加(P<0.05)。1.2 mg/kg注射液組動物肺、腦臟器系數增加(P<0.05，P<0.01)。以上變化在停藥兩周后逐漸恢復至正常水平。

表7 羥基喜樹堿脂質體對Beagle犬主要臟器系數的影響(Mean±SD)Table 7 Effects of hydroxycamptothecin liposomes on main organ coefficient of Beagle dogs(Mean ±SD) %

2.6 對骨髓細胞的影響

羥基喜樹堿脂質體經靜脈滴注給予Beagle犬0.3、0.6和1.2 mg/kg，每日1次，連續(xù)給藥2 d，停藥2 d，連續(xù)滴注4周，在28 d給藥結束時，采集Beagle犬胸骨骨髓制作涂片，進行骨髓細胞分類計數，結果見表8。由表8可知：與陰性對照組相比，羥基喜樹堿脂質體各給藥組酸堿粒細胞比值明顯下降(P<0.05，P<0.01)，1.2 mg/kg組成熟粒細胞比值明顯降低(P<0.05)。2周恢復期結束，以上異常指標均恢復正常。由此可說明，該藥物對紅細胞和粒細胞有明顯且可逆的抑制作用。

表8 羥基喜樹堿脂質體對Beagle犬骨髓細胞的影響(Mean±SD)Table 8 Effects of hydroxycamptothecin liposomes on bone marrow cells of Beagle dogs(Mean±SD) %

2.7 大體病理及組織病理檢查結果

羥基喜樹堿脂質體經靜脈滴注給藥(0.3、0.6和1.2 mg/kg)，每日1次，連續(xù)給藥2 d，停藥2 d，連續(xù)滴注4周，在28 d給藥結束時，對犬剖檢后對所有組織進行肉眼觀察發(fā)現羥基喜樹堿脂質體0.6、1.2 mg/kg劑量組以及市售注射液對照組動物的十二指腸、回腸及直腸黏膜面見輕度充血及少量點狀出血。除此之外，未發(fā)現其他明顯異常改變。市售羥基喜樹堿注射液對照組給藥中期死亡1只動物，解剖可見十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結腸和脾臟有不同程度的出血，推測消化道出血可能是誘發(fā)動物死亡的主要原因。

利用組織病理檢查來考察羥基喜樹堿脂質體對睪丸、大腸、胸骨、給藥部位(皮膚)、垂體是否有損傷作用，結果分別見圖1～4。

由圖1可知：市售羥基喜樹堿注射液1.2 mg/kg高劑量組，少部分曲細精管初級、次級和精子細胞變性、壞死，核結構消失；羥基喜樹堿脂質體1.2 mg/kg高劑量組，大部分曲細精管生精細胞變性、壞死，核結構消失。

圖1 睪丸病理組織切片圖(HE×100)Fig.1 Histological changes of testis in Beagle dogs(HE×100)

由圖2 可知：市售羥基喜樹堿注射液1.2 mg/kg高劑量組，大腸上皮壞死，局部肉芽形成，殘存少量的黏膜腺；羥基喜樹堿脂質體1.2 mg/kg高劑量組，腸上皮變性，腸腺擴張。

圖2 大腸病理組織切片圖(HE×100)Fig.2 Histological changes of large intestine in Beagle dogs(HE×100)

由圖3可知：胸骨骨髓白細胞均減少，市售羥基喜樹堿注射液1.2 mg/kg高劑量組的骨髓白細胞明顯減少；羥基喜樹堿脂質體1.2 mg/kg高劑量組的骨髓白細胞明顯減少。

圖3 胸骨病理組織切片圖(HE×100)Fig.3 Histological changes of sternum in Beagle dogs(HE×100)

由圖4可知：市售羥基喜樹注射液堿1.2 mg/kg高劑量組，腺垂體細胞稀疏，嗜堿細胞和顯色細胞明顯減少；羥基喜樹堿脂質體1.2 mg/kg高劑量組，腺垂體細胞稀疏，嗜堿細胞和嫌色細胞明顯減少。由此可知，羥基喜樹堿脂質體對以上器官的毒性與市售羥基喜樹堿注射液的毒性表現及程度基本一致，羥基喜樹堿脂質體對睪丸的毒性作用強于羥基喜樹堿注射液，其他器官未見明顯的毒性作用。2周恢復期結束，所有動物各臟器異常均可恢復至正常水平。

圖4 腺垂體病理組織切片圖(HE×100)Fig.4 Histological changes of adenohypophysis in Beagle dogs(HE×100)

本研究通過對Beagle犬4周靜脈滴注羥基喜樹堿脂質體的長期毒性試驗，得出如下結論：注射用羥基喜樹堿脂質體有明顯的消化道毒性反應，主要表現為消化道出血、食欲不振、嘔吐或干嘔、流涎、攝食減少、體質量減輕、稀便腹瀉，同時可見明顯的活動減少和萎靡表現。血液學和骨髓檢查提示該藥物對紅細胞和粒細胞有明顯的抑制作用，說明對造血系統(tǒng)有影響。另外，血清生化學檢查顯示該藥物對腎臟有輕度影響。病理組織學檢查顯示其對給藥部位(皮膚)、垂體、大腸、胸骨、睪丸有一定損傷作用。但以上所有毒性表現均可逆，停藥兩周即可恢復或正在恢復，前期的毒代動力學研究發(fā)現，在0.3～1.2 mg/kg劑量下連續(xù)靜脈給予Beagle犬4周，羥基喜樹堿脂質體在犬血液中未見明顯蓄積現象，充分證實了該藥物的毒性反應大多可逆，停藥后恢復較快。

3 結論

利用脂質體遞送技術將羥基喜樹堿包裹成脂質體，毒性研究結果顯示：羥基喜樹堿脂質體不產生新的嚴重毒副反應，毒性靶器官主要為消化道和睪丸，但毒性可逆，停藥即可恢復；同等劑量的羥基喜樹堿脂質體和市售羥基喜樹堿注射液毒性表現及程度相當；羥基喜樹堿脂質體對犬的無毒性劑量大約為0.3 mg/kg，與市售羥基喜樹堿注射液相比具有更大的治療效果。這與羥基喜樹堿脂質體良好的生物相容性以及脂質體載體藥物在體內作為儲庫不斷緩慢釋放藥物、延長藥物半衰期具有密切關系，值得進行深入研究。