王楠 張瑞 潘陽陽 何翃宏 王靖雷 崔燕 余四九

（甘肅農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院/甘肅省牛羊胚胎工程技術(shù)研究中心，蘭州 730070）

牦牛（Bos grunniens）分布在以中國青藏高原為中心的“3 000-6 000”米的高海拔地區(qū)，素有“高原之舟”“世界屋脊”的美稱［1］，能夠在強輻射、酷寒、空氣稀疏的惡劣生態(tài)環(huán)境中活動自在，繁殖后代，又可為當?shù)啬撩裉峁┤?、奶、毛和役力等生產(chǎn)和生活所需品，是當?shù)夭豢苫蛉钡闹匾蠓N?？墒顷笈Ｏ啾绕皆７N，繁殖力低下，性成熟晚，成為了影響高寒地區(qū)牧民經(jīng)濟收入的重要因素［2］。

TGF-β超家族是一類生物活性很高，臨床應(yīng)用前景很好，對細胞增殖和分化有多種調(diào)節(jié)作用的多肽生長因子［3］。其主要包括TGF-Bs、骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic proteins，BMP）、活化素、生長和分化因子、AMH和抑制素。這類生長因子已被表明在細胞生長、增殖分化、黏附、遷移及Th17反應(yīng)的極化、ROS的產(chǎn)生和凋亡中發(fā)揮重要作用［4-8］。TGF-β存在4種亞型，為TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3及TGF-β5，存在哺乳動物體內(nèi)僅有TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3三種變異體，這3種結(jié)構(gòu)相似的變異體高度保守，在生物反應(yīng)中作用相似［9］。TGF-β1作為生長因子家族的原型成員，其活性最強，對其的研究最深。TGF-β1最早發(fā)現(xiàn)與1978年，是首次發(fā)現(xiàn)的一種多肽細胞因子［10-11］。機體多種組織和細胞均可產(chǎn)生TGF-β1，其在不同的條件下發(fā)揮不同的生物學效應(yīng)。目前已發(fā)現(xiàn)TGF-β1參與的生物學作用主要有細胞的增殖、分化、遷移、黏附、凋亡、細胞外基質(zhì)的形成、胚胎的生長發(fā)育、創(chuàng)傷后的修復(fù)、骨重建等重要過程［12］。其中TGF-β1對哺乳動物生殖發(fā)育過程至關(guān)重要，通常具有調(diào)控胚胎生長發(fā)育和細胞穩(wěn)態(tài)的重要功能。有研究表明，TGF-β1作為哺乳動物胚胎發(fā)育過程中最關(guān)鍵的形態(tài)發(fā)生物質(zhì)，參與胚胎肢端發(fā)芽、脊椎骨形成、面骨形成和心臟瓣膜生成等重要步驟［13］。近年來，隨著對該因子的深入研究，人們又發(fā)現(xiàn)TGF-β1在卵巢中也發(fā)揮著不可小覷的作用，可參與排卵發(fā)生、細胞外基質(zhì)調(diào)控的自分泌旁分泌、調(diào)節(jié)卵母細胞卵泡發(fā)育、與顆粒細胞之間的信號傳遞等［14］。研究表明，正常情況下，TGF-β1主要位于竇卵泡的卵泡膜細胞（granular cell TC）、初級卵泡的卵母細胞、顆粒細胞（ovarian granulosacell，GC）及卵巢間質(zhì)中，在卵泡發(fā)育末期，TGF-β1可以通過誘導TC及GC的增殖分化，細胞凋亡，進而參與卵泡閉鎖過程，并可維持卵巢黃體，刺激孕酮產(chǎn)生［15］。而TGF-β1作為卵巢中重要的自分泌／旁分泌因子，可通過激活SMAD通路促進顆粒細胞透明質(zhì)酸的合成，進而參與COC細胞外基質(zhì)形成的調(diào)控［16-17］。據(jù)報道，敲除小鼠體內(nèi)TGF-β1 I型受體，阻斷TGF-β1信號通路，會導致小鼠輸卵管及子宮發(fā)育異常，致小鼠不孕［18］。但其在牦牛生殖發(fā)育中的研究，鮮見報道。因此，本實驗成功克隆牦牛TGF-β1基因，并進行生物學信息分析，探討牦牛TGF-β1基因與其他牛種之間的差異性。利用qRT-PCR、IHC、WB等方法檢測正常生理條件下TGF-β1在雌性牦牛發(fā)情期和妊娠期卵巢、輸卵管和子宮的表達，為進一步研究TGF-β1參與牦牛生殖發(fā)育的分子機制提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，對改善牦牛的繁殖力，增加牧民收入具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

TranZol、E.coli DH5α感受肽細胞均購自（全式金，北京），SYBR?Premix Ex TapTMEraserTM、Taq PCR Master Mix and pMDTM19-T Vector Cloning Kit均購自（TaKaRa，大連）、通用型DNA純化回收試劑盒（北京，天根），SP試劑盒、IPTG、4×蛋白上樣緩沖液均購自（Solarbio公司，北京）、TGF beta1 Antibody（AF1027）（Affinity公司，美國）、GAPDH（武漢三鷹）、Goat anti-rabbit IgG-HRP antibody（博奧森，北京），普通PCR儀（艾本德公司，德國）、實時熒光定量PCR儀（LightCycler? 96 SW 1，loch1公司，瑞士）、恒溫培養(yǎng)箱（松下，日本）、顯微鏡（DP71，Olympus，日本）。

1.2 方法

1.2.1 樣品的采集 試驗所用的樣品于2020年9月采集青海省西寧市馬佳肴屠宰場，選取健康且年齡（3-6歲）的發(fā)情期和妊娠期的雌性牦牛各4頭，頸動脈致死后，分別取不同時期（卵泡期、黃體期、妊娠期）的不同部位（卵巢、輸卵管、子宮），用生理鹽水沖洗后浸泡于4%的多聚甲醛固定（修剪組織塊大小為1 cm3）用于后期免疫組化的實驗，其他剩余組織錫箔紙包裹放于液氮罐，-80℃保存，用于后期分子實驗。

1.2.2 牦牛TGF-β1基因克隆

1.2.2.1 引物的設(shè)計 參照GenBank公布的普通牛（Bos taurus）TGF-β1基因和牦牛內(nèi)參基因甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH），利 用NCBI Primer-BLAST設(shè)計牦牛的TGF-β1基因上下游引物用于基因序列的克隆，引物D-TGFβ1、TGF-β1用于實時熒光定量檢測。內(nèi)參引物為GAPDH，所用引物均在上海生工合成，具體引物信息見表1。

表1 引物序列及長度Table 1 Primer sequences and length

1.2.2.2 總RNA、蛋白提取及目的基因的擴增 從-80℃超低溫冰箱中取出發(fā)情期和妊娠期不同部位的雌性牦牛組織，參照TransZol試劑盒說明書提取總RNA，利用分光光度計測定RNA濃度和OD260/OD280值，將RNA濃度調(diào)成一致，參照兩步法反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書（Go ScriptTM Reverse Transcription Syatem，Promega）合 成cDNA，-20℃保存?zhèn)溆?。參照RIPA組織蛋白提取試劑盒說明書，提取組織總蛋白，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.3 牦牛TGF-β1基因的克隆 以牦牛cDNA為模板，TGF-β1為引物，擴增牦牛TGF-β1基因全序列。PCR總反應(yīng)體系為20 μL：Taq PCR Master Mix 10 μL，ddH2O 8 μL，模板1 μL，上下游引物各0.5 μL。瓊脂凝膠電泳驗證。PCR反應(yīng)條件為預(yù)變性（95℃ 4 min）；變性（95℃ 30 s）；退火（60℃ 30 s）；延伸（72℃ 15 s）；循環(huán)40次；72℃保存5 min；最后保存于4℃，瓊脂凝膠電泳驗證擴增結(jié)果。用膠回收試劑盒回收純化目的條帶。將純化的膠回收產(chǎn)物與pMDTM19-T Vector進行連接，將連接產(chǎn)物（10 μL）轉(zhuǎn)化至100 μL JM109感受態(tài)細胞后，于含有X-Gal、IPTG、AMP的LB固體培養(yǎng)基中37℃過夜培養(yǎng)，挑取單顆菌進行菌落PCR驗證，將驗證正確的陽性克隆菌落擴大培養(yǎng)，所得菌液送至上海生工進行測序。

1.2.2.4 生物信息學分析 NCBI-ORF在線軟件（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）進行開放閱讀 框 分 析，NCBI-BLAST（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）對比分析牦牛TGF-β1基因相似性，利用軟件MEGA7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，利用ExPASy-Protparam（https://web.expasy.org/protparam/）在線軟件分析牦牛TGF-β1基因編碼蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)，利用在線軟件TMHMM ServerV.2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）預(yù)測牦牛TGF-β1基因編碼蛋白跨膜區(qū)域，利用IBCP在線軟件（http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_gor4.html）預(yù)測其蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)，利用軟件SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org）預(yù)測其蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)，利用在線軟件Protscale（https://web.expasy.org/protscale/）分析其蛋白親疏水性，利用在線軟件Netphos（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/） 預(yù)測其磷酸化位點。

1.2.3 qRT-PCR檢測TGF-β1基因的表達 利用qRT-PCR檢測牦牛TGF-β1基因在牦牛發(fā)情期和妊娠期主要生殖器官的表達情況，以牦牛cDNA為模板，D-TGF-β1為引物進行擴增反應(yīng)體系為20 μL：cDNA為2 μL，上下游引物為0.8 μL，無菌去離子水6.4 μL，SYBR?Premix Ex TapTMEraserTM10 μL，3 Step Amplification：（95℃，5 s）、（60℃，30 s）、（72℃，12 s）、40個循環(huán)（n=4）。根據(jù)cq值以2-ΔΔCt計算［19］TGF-β1基因在發(fā)情期和妊娠期卵巢，輸卵管和子宮中的相對表達量。

1.2.4 Western blot檢測TGF-β1蛋白的表達

1.2.4.1 蛋白樣品的制備 將牦牛發(fā)情期和妊娠期卵巢、輸卵管和子宮的蛋白樣品與4X蛋白上樣緩沖液按照3∶1比例配置蛋白工作液，金屬浴變性（100℃，10 min），冰上靜置10 min后，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4.2 Western blot SDS PAGE凝膠電泳，分別配置12%分離膠和5%的濃縮膠進行電泳，電泳結(jié)束后按照目的蛋白大小切膠將其轉(zhuǎn)至PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后5%脫脂奶粉封閉，TGF beta1 Antibody（1∶1 500稀釋）4℃孵育過夜，PBST清洗一抗，10 min/次，共1 h，Goat Anti-Rabbit IgG/HRP antibody室溫孵育1 h，PBST清洗，10 min/次，共1 h。使用GEAI600化學發(fā)光儀成像系統(tǒng)掃描目的條帶，利用成像結(jié)果計算灰度值分析TGF-β1蛋白相對表達量（目的灰度數(shù)值/內(nèi)參灰度數(shù)值）。

1.2.5 免疫組化法對TGF-β1蛋白表達進行定位 選取固定于4%多聚甲醛溶液中的卵巢、輸卵管和子宮組織塊自來水沖洗24 h，上行酒精脫水，酒苯透明浸蠟，進行石蠟包埋，切成4 μm的組織切片，烘片機上烘片6 h，下行酒精脫蠟，抗原修復(fù)（檸檬酸鹽緩沖液-微波熱修復(fù)法），阻斷（滴加3%H2O2溶液37℃作用10 min），封閉（擦干組織后滴加SPA試劑盒A液作用15 min），一抗反應(yīng)（（Rabbit Anti-TGF-β1 antibody）1∶150稀釋后4℃孵育過夜），添加對照組（PBS代替一抗），二抗反應(yīng)（滴加二抗SPA試劑盒B液37℃濕盒孵育15min），三抗反應(yīng)（滴加三抗SPA試劑盒C液37℃濕盒孵育15 min），DAB顯色，蘇木精復(fù)染后鹽酸酒精分化、自來水返藍脫水、透明、樹脂封片，待晾干至于顯微鏡（DP71，Olympus，日本）進行拍照。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析 采用ImageJ軟件根據(jù)灰度值分析蛋白表達量（目的灰度數(shù)值/內(nèi)參灰度數(shù)值）。運用SPSS21.0對TGF-β1基因和蛋白的相對表達量差異顯著性進行單因素方差（ANOVA）分析（均值兩兩比較），極顯著（P＜0.01），顯著（P＜0.05），結(jié)果以±SE（平均值±標準誤）表示，用GraphPad Prism8繪制數(shù)據(jù)圖。

2 結(jié)果

2.1 牦牛TGF-β1基因的擴增與克隆

以內(nèi)參引物GAPDH、引物D-TGF-β1檢測牦牛cDNA模板，結(jié)果顯示（圖1），條帶單一，在178 bp、153 bp處有清晰目的條帶，cDNA可用于后續(xù)實驗。以TGF-β1為引物，擴增牦牛TGF-β1全CDS區(qū)，結(jié)果顯示（圖2），在1 173 bp處出現(xiàn)單一條帶，與預(yù)期大小一致，經(jīng)克隆測序結(jié)果比對后，其與參考序列高度一致，將其提交至GenBank，登陸號為MZ004937。

圖1 D-TGF-β1、GAPDH基因 PCR擴增電泳Fig. 1 D-TGF-β1 and GAPDH PCR amplification electrophoresis

圖2 TGF-β1 PCR擴增電泳Fig. 2 TGF-β1 PCR amplification electrophoresis

2.2 生物信息學分析

2.2.1 TGF-β1基因開放閱讀框分析及系統(tǒng)進化樹構(gòu)建 牦牛TGF-β1基因開放閱讀框分析結(jié)果顯示，牦牛TGF-β1基因全長1 173 bp，編碼390個氨基酸。NCBI-BLAST比對核苷酸相似性結(jié)果顯示，牦牛TGF-β1基因與瘤?！疗胀ㄅ＃˙os indicus×Bos taurus）相似性最高為99%以上，與山羊（Capra hircus）、綿羊（Ovis aries）相似性為98%，與家貓（Felis catus）、犬（Canine）相似性最低為91%左右，與瘤牛×普通牛相比，其核苷酸序列在第1 168位出現(xiàn)差異，所編碼氨基酸由丙氨酸突變?yōu)楦拾彼幔▓D3）。構(gòu)建系統(tǒng)進化樹結(jié)果顯示（圖4），牦牛TGF-β1基因與普通牛的親緣關(guān)系最近，與瘤?！疗胀ㄅ４沃?，與犬、大熊貓的親緣性最遠。

圖3 不同物種間TGF-β1基因序列比對Fig. 3 Sequence alignment of TGF-β1 gene among different species

圖4 TGF-β1基因的系統(tǒng)進化樹Fig.4 Phylogenetic tree of TGF-β1gene

2.2.2 牦牛TGF-β1基因編碼蛋白的理化性質(zhì)分析 牦牛TGF-β1基因編碼蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)分析結(jié)果顯示，TGF-β1蛋白分子量大小44.4 kD，理論等電點（pI）8.97，原子總數(shù)6 256，不穩(wěn)定指數(shù)（Ⅱ）52.97，為不穩(wěn)定蛋白。共編碼氨基酸390個，其中含量最高的氨基酸是亮氨酸（Leu）13.3%，含量最低的氨基酸是色氨酸（Trp）1.8%，帶負電荷的氨基酸（Asp+Glu）40個，占氨基酸總數(shù)的7.6%；帶正電荷的氨基酸（Arg+Lys）50個，占氨基酸總數(shù)的12.8%。

2.2.3 牦牛TGF-β1基因編碼蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)預(yù)測 二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果表明（圖5-A），該蛋白由3種折疊方式構(gòu)成：α-螺旋90個氨基酸占23.07%；延伸鏈為97個氨基酸，占24.87%；無規(guī)則卷曲為203個氨基酸，占52.05%。牦牛TGF-β1蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果（圖5-B）與二級結(jié)構(gòu)相符。

2.2.4 牦牛TGF-β1基因編碼蛋白親疏水性、跨膜結(jié)構(gòu)域和磷酸化位點分析 牦牛TGF-β1蛋白親疏水性分析結(jié)果（圖5-C）表明，疏水性最強為第15位亮氨酸（Leu），分值最高為2.678，親水性最強為第176位天冬酰胺（Asn），分值最低為-2.522，親水性平均系數(shù)（GRAVY）-0.382，為親水性蛋白。TGF-β1蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果（圖5-D）表明，TGF-β1蛋白含跨膜區(qū)域，為跨膜蛋白。磷酸化位點分析結(jié)果（圖5-E）顯示，有27個絲氨酸（Ser），6個蘇氨酸（Thr），4個酪氨酸（Tyr閾值大于0.5），可能成為蛋白質(zhì)激酶磷酸化位點。

圖5 牦牛TGF-β1蛋白生物信息學分析結(jié)果Fig. 5 Results of yak TGF-β1 protein via bioinformatics analysis

2.3 牦牛TGF-β1基因表達檢測結(jié)果

采用qRT-PCR檢測牦牛發(fā)情期和妊娠期卵巢、輸卵管和子宮中TGF-β1基因的表達量結(jié)果（圖6）顯示，TGF-β1基因在牦牛發(fā)情期和妊娠期卵巢、輸卵管和子宮中均有表達。其中，在卵巢和輸卵管中妊娠期表達量均顯著高于卵泡期和黃體期（P＜0.05），黃體期次之，卵泡期表達量最低；在子宮中，妊娠期表達量最高，卵泡期次之，黃體期表達量最低（P＜0.05）。

圖6 TGF-β1 mRNA在不同組織中的相對表達量Fig. 6 Relative expressions of TGF-β1 mRNA in different tissues

2.4 牦牛TGF-β1蛋白表達檢測結(jié)果

Western blot結(jié)果（圖7）顯示，TGF-β1蛋白普遍表達于牦牛發(fā)情期和妊娠期卵巢、輸卵管和子宮中。結(jié)果（圖8）顯示，卵泡期卵巢表達量顯著高于妊娠期和黃體期（P＜0.05），黃體期次之，妊娠期表達量最低；妊娠期輸卵管TGF-β1蛋白表達量顯著高于黃體期、卵泡期。妊娠期子宮中TGF-β1蛋白表達量顯著高于黃體期和卵泡期，卵泡期次之，黃體期最低。

圖7 TGF-β1和GAPDH蛋白在不同組織中的檢測結(jié)果Fig. 7 Detection results of TGF-β1 and GAPDH protein in different tissues

圖8 TGF-β1蛋白在不同組織中的相對表達量Fig. 8 Relative expressions of TGF-β1 protein in different tissues

2.5 牦牛TGF-β1蛋白定位結(jié)果

免疫組化結(jié)果（圖9）顯示（棕褐色為TGF-β1蛋白陽性表達，與之對應(yīng)的為陰性表達）。TGF-β1蛋白在牦牛發(fā)情期和妊娠期卵巢，輸卵管和子宮中均有陽性表達，在發(fā)情期和妊娠期的同一組織中蛋白表達部位無明顯差異。在卵巢中主要表達于卵巢生殖上皮（GE）、卵泡膜細胞（TF）、卵泡顆粒層（SG）（圖9-A1、圖9-A2）和黃體細胞（CL）（圖9-B1）；在輸卵管中主要表達于漿液腺（sg）和黏膜上皮細胞（EM）（圖9-C1、圖9-C2）；在子宮中主要表達部位為子宮腺（UG）和子宮內(nèi)膜細胞（EP）（圖 9-D1、圖9）。

圖9 TGF-β1蛋白在在不同組織中的分布Fig. 9 Distribution of TGF-β1 proteins in different tissues

3 討論

本實驗成功克隆出了牦牛TGF-β1基因（GenBank登錄號：MZ004937），并發(fā)現(xiàn)TGF-β1在雌性牦牛發(fā)情期和妊娠期的卵巢，輸卵管和子宮中均有表達。研究結(jié)果顯示，牦牛TGF-β1基因ORF全長為1 173 bp。編碼390個氨基酸，人和小鼠編碼氨基酸數(shù)也為390個。TGF-β1蛋白存在37個磷酸化位點，含跨膜區(qū)域，為跨膜蛋白。據(jù)報道，TGF-β通過與跨膜I型（TβRI）2和II型（TβRII）受體結(jié)合來啟動下游信號通路并發(fā)揮其功能［20］?？赡芘c其含跨膜區(qū)相關(guān)。有學者發(fā)現(xiàn)，成熟型TGF-β1基因在進化中高度保守，且人、猴、豬和雞TGF-β1的成熟單體有完全相同的氨基酸序列［21］。本實驗結(jié)果顯示，牦牛TGFβ1基因核苷酸序列與普通牛一致性較高，僅在第1 168位出現(xiàn)差異，所編碼氨基酸由丙氨酸突變?yōu)楦拾彼?，且系統(tǒng)進化樹結(jié)果顯示，牦牛TGFβ1基因與犏牛、普通牛和野牦牛的親緣關(guān)系較近，進一步說明其高度保守型。

在雌性哺乳動物中，原始卵泡池的形成對維持繁殖力至關(guān)重要。有研究闡明了TGF-β1參與原始卵泡發(fā)育過程［22］。有研究表明，TGF-β1在調(diào)控卵巢體細胞間的卵母細胞與顆粒細胞間縫隙連接中扮演了重要的角色［23］。在卵泡發(fā)育、閉鎖、成熟、排卵及黃體的形成等生理過程中都發(fā)揮了重要的作用，這些作用與卵巢功能密切相關(guān)。TGF-β1作為多細胞來源的細胞因子［24］，有文獻報道［25-28］稱TGF-β1具有多條信號通路，在翻譯過程中受多個轉(zhuǎn)錄因子（IL-26、HMGBI、NF-κB、15-LOX-1、CBX7）調(diào)控。因此蛋白和基因在相對表達水平上存在差異。文獻報道［29］TGF-β1參與胚泡著床過程，TGF-β1可促使卵泡顆粒細胞分化但阻滯其增殖，與體內(nèi)FSH濃度呈負相關(guān)［30］，本研究發(fā)現(xiàn)TGF-β1蛋白在卵泡期卵巢中的相對表達量顯著高于黃體期和妊娠期。TGF-β1蛋白在卵泡期卵巢中的高表達及黃體期的下降，可能與其參與卵泡發(fā)育及成熟，受體內(nèi)FSH濃度影響有關(guān)。卵泡連續(xù)的發(fā)育需要卵母細胞，黃體細胞以及顆粒細胞之間的雙向交流［31］，而TGF-β1可以自分泌或旁分泌的方式通過Smad蛋白家族廣泛地表達于不同時期卵泡的卵泡膜細胞、卵母細胞及顆粒細胞中［32-33］。本研究結(jié)果顯示，TGF-β1蛋白在卵巢中主要分布于顆粒細胞、卵巢生殖上皮、卵泡膜細胞和黃體細胞，與前人研究一致。進一步證明其在卵泡發(fā)育成熟過程中發(fā)揮了重要作用。

輸卵管具有輸送精子、卵子及受精卵的功能，且是精子貯藏、精子獲能、頂體反應(yīng)和受精的場所［34］。有研究發(fā)現(xiàn)輸卵管細胞可以調(diào)節(jié)合成TGF-β1，TGF-β1在調(diào)節(jié)與早期胚胎發(fā)育相關(guān)的輸卵管生殖生理學功能中起重要作用［35］。本研究發(fā)現(xiàn)TGF-β1在妊娠期相對表達量最高。免疫組化結(jié)果顯示TGF-β1主要表達于牦牛的輸卵管黏膜上皮，輸卵管粘膜上皮細胞具有分泌功能，分泌的活性物質(zhì)為胚胎早期發(fā)育提供了營養(yǎng)物質(zhì)［36］。TGF-β1在妊娠期的高表達，可能提示其參與了早期胚胎發(fā)育并誘導輸卵管黏膜上皮細胞的快速增殖，為早期胚胎發(fā)育提供營養(yǎng)物質(zhì)維持妊娠環(huán)境。有證據(jù)表明TGF-β1在人類輸卵管、胎盤、子宮內(nèi)膜和胚胎組織中都有表達［37-39］，本研究發(fā)現(xiàn)TGF-β1定位于牦牛的輸卵管黏膜上皮，與學者研究一致。

子宮是胚胎附植的器官，為胎兒的發(fā)育提供穩(wěn)定的環(huán)境和必須的營養(yǎng)物質(zhì)。有研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1在調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜容受性中起關(guān)鍵作用，附植失敗的子宮內(nèi)膜中TGF-β1的表達量會顯著降低［40］。且有研究結(jié)果表明，TGF-β/Smad3信號傳導參與了胚胎植入過程，TGF-β1及其最特異性的信號轉(zhuǎn)導因子Smad3在植入窗口期間在子宮內(nèi)膜中表達［41］。本研究發(fā)現(xiàn)TGF-β1在妊娠期子宮的表達量最高，其在妊娠期的高表達，可能與其參與胚胎附植及胚胎發(fā)育過程有關(guān)。學者研究發(fā)現(xiàn)，子宮腺可分泌TGF-β1，TGF-β1參與胚胎附植和胚胎發(fā)育過程［29］，且TGF-β1還參與調(diào)節(jié)母體-胚胎免疫反應(yīng)［42-43］。本研究結(jié)果顯示TGF-β1在子宮中主要表達子宮內(nèi)膜和子宮腺，與學者研究結(jié)果一致。子宮腺分泌的子宮乳中含糖原等營養(yǎng)物質(zhì)，可供給著床前附植階段胚胎早期所需營養(yǎng)［44］。TGF-β1在子宮內(nèi)膜和子宮腺的表達，可能提示其參與分泌胚胎發(fā)育所需的營養(yǎng)物質(zhì)，并參與附植時胎兒及母體間的免疫反應(yīng)。

4 結(jié)論

本實驗成功克隆出了牦牛TGF-β1基因（GenBank登錄號：MZ004937），牦牛TGF-β1基因ORF全長為1 173 bp，編碼390個氨基酸，為跨膜的不穩(wěn)定蛋白。牦牛TGF-β1基因與普通牛的進化水平最近，與犬、大熊貓的最遠。TGF-β1在牦牛發(fā)情期和妊娠期的卵巢、輸卵管和子宮均有表達，表達有差異。TGF-β1蛋白在不同時期同一組織定位無明顯變化。結(jié)果提示TGF-β1在牦牛發(fā)情期和妊娠期的卵巢、輸卵管和子宮中具有重要的生物學作用，可能參與調(diào)節(jié)牦牛卵泡發(fā)育、成熟及排卵過程，且在早期胚胎發(fā)育、胚胎附植和維持妊娠過程中發(fā)揮重要作用。TGF-β1在發(fā)情期和妊娠期的卵巢、輸卵管和子宮中的表達，有助于進一步探討高原哺乳動物對高寒環(huán)境的適應(yīng)性提供理論依據(jù)。