付巧 林啟蘭 薛強 熊海容 王亞偉，2

（1. 中南民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，武漢 430074；2. 武漢輕工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，武漢 430048）

普魯蘭酶（pullulanase，EC 3.2.1.41）是一種重要的生物催化劑和脫支酶，能高效裂解普魯蘭多糖、支鏈淀粉和其它支鏈多糖的α-1，6-糖苷鍵［1］。在糖化過程中，普魯蘭酶與糖化酶或β-淀粉酶復(fù)配使用來生產(chǎn)麥芽糖糖漿［2-3］，除了提高產(chǎn)糖率，還縮短了反應(yīng)時間。在工業(yè)淀粉發(fā)酵生產(chǎn)酒精、氨基酸、核苷酸以及抗生素的過程中，應(yīng)用普魯蘭酶可提高淀粉水解的效率［4-5］。

為了滿足工業(yè)生產(chǎn)的需求，研究人員對普魯蘭酶的3D結(jié)構(gòu)進行解析，進而改變酶的結(jié)構(gòu)以期獲得酶學(xué)性質(zhì)的改良。在Protein Data Bank（PDB）數(shù)據(jù)庫中可以檢索到多個已解析的不同來源普魯蘭酶晶體結(jié)構(gòu)。根據(jù)Thermotoga petrophila普魯蘭酶［6］、Bacillus subtilis普魯蘭酶［7］、Bacillus naganoensis普魯蘭酶［8］和Bacillus acidopullulyticus普魯蘭酶［9］的3D晶體結(jié)構(gòu)對比發(fā)現(xiàn)，普魯蘭酶的保守功能區(qū)域具有較高的相似性，在N端結(jié)構(gòu)中普遍存在著一種僅能與底物糖鏈分子結(jié)合卻不具有催化功能的結(jié)構(gòu)域，即碳水化合物結(jié)合模塊（carbohydrate binding modules，CBMs），其中CBM41是普魯蘭酶分子中存在最廣泛的CBM結(jié)構(gòu)域家族［10-11］。近年來隨著對普魯蘭酶研究的深入，科學(xué)家們?nèi)〉昧艘恍┏晒?，發(fā)現(xiàn)N端結(jié)構(gòu)對其酶學(xué)性質(zhì)、酶的表達和動力學(xué)參數(shù)等顯示出不同程度的影響。例如Duan等［12］構(gòu)建了Bacillus deramificans普魯蘭酶的N端截短突變體，截斷CBM41和X25后，酶的比活力提高到野生型的1.1倍，底物親和力下降。Jiao等［13］通過刪除Bacillus megaterium普魯蘭酶CBM41a-CBM41b-X結(jié)構(gòu)域，將突變體的比活力提高8.7倍，且具有更好的熱穩(wěn)定性。Chen等［14］截短B. acidopullulyticus普魯蘭酶N端的結(jié)構(gòu)域CBM41-X25-X45，得到的突變體酶活力提高了2.9倍，熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性也有所提高。對普魯蘭酶CBM41的改造雖然獲得了一些性質(zhì)得到改良的突變體，但對CBM41的關(guān)鍵作用位點及其催化功能的影響機制還有待進一步研究。

課題組前期以枯草芽孢桿菌168（Bacillus subtilis 168）的全基因組為模板，擴增出普魯蘭酶PulB基因序列，與已報道的普魯蘭酶（PDB：2E8Y）序列相似性高達99.72%，其中除第365位的氨基酸由K變?yōu)镸，第553位的氨基酸由V變?yōu)锳外，其余序列均一致。根據(jù)2E8Y模擬普魯蘭酶3D結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)在CBM41結(jié)構(gòu)域的N端出現(xiàn)1-6個氨基酸形成的無規(guī)則片段，此區(qū)域柔性較大，易受溫度和pH的影響，通過刪去CBM41結(jié)構(gòu)域N端前2、4、6個氨基酸，構(gòu)建不同形式的N端截短突變體，以期獲得性質(zhì)更加優(yōu)良的菌株，對比截短突變體與野生型普魯蘭酶（WT）酶學(xué)特性上的差異，為簡化Bacillus subtilis 168普魯蘭酶編碼基因，解析CBM41結(jié)構(gòu)域與功能的關(guān)系等方面的研究工作提供方法和思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與質(zhì)粒 枯草芽孢桿菌168菌株由本實驗室保藏。表達載體pET-22b（+）和大腸桿菌Escherichia coli BL21（DE3）均獲贈于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所。

1.1.2 工具酶及試劑 限制性內(nèi)切酶Nco I（1160A）、Xho I（1094A）、連 接 酶T4 DNA Ligase（2011A）、DNA分子量標(biāo)記和蛋白質(zhì)分子量標(biāo)記均購于寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司，SDS-PAGE凝膠快速配制試劑盒（P0012AC）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，質(zhì)粒小量試劑盒和DNA凝膠回收試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司，底物支鏈淀粉（KV370014）購自上海源葉生物科技有限公司，牛肉膏（LP0029B）、酵母浸粉（LP0021）和蛋白胨（LP0042）購于賽默飛世爾科技（Thermo Fisher Scientific）公司，其余試劑均是國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 序列分析和結(jié)構(gòu)模擬 使用SignalP5.0 （http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）分析預(yù)測已收錄于NCBI數(shù)據(jù)庫中Bacillus subtilis 168來源的普魯蘭酶（GenBank Accession No. NP_390871.2）蛋白質(zhì)序列的信號肽，推斷該酶的胞內(nèi)/外釋放特征。使用PyMOL軟件（http://pymol.org/）模擬研究中所獲得重組普魯蘭酶PulB的立體結(jié)構(gòu)。

1.2.2 普魯蘭酶截短突變體的設(shè)計和構(gòu)建 以枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis 168基因組中普魯蘭酶基因（GenBank：QJR47579.1）為參考，采用引物如表1，通過PCR技術(shù)擴增目的基因PulB、PulBΔN2、PulBΔN4和PulBΔN6，使用限制性內(nèi)切酶Nco I和Xho I對目的基因與載體pET-22b（+）進行雙酶切，酶切產(chǎn)物通過T4 DNA Ligase連接后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21中［15］，挑取陽性單克隆送交武漢擎科生物技術(shù)有限公司測序驗證，將測序正確的重組菌株培養(yǎng)保藏，分別標(biāo)記為BL21-pET-22b（+）-PulB、BL21-pET-22b（+）-PulBΔN2、BL21-pET-22b（+）-PulBΔN4和BL21-pET-22b（+）-PulBΔN6。

表1 野生型及其截短突變體擴增用引物Table 1 Primers for amplification of wild-type and truncated mutants

1.2.3 截短突變體的誘導(dǎo)表達和純化 將轉(zhuǎn)化成功的陽性重組菌株接種到LB培養(yǎng)基中，37℃、220 r/min條件下振蕩培養(yǎng)，當(dāng)菌液的OD600達到0.6-0.8時，加入終濃度為0.1 mg/mL的IPTG，30℃、220 r/min誘導(dǎo)16-20 h。將發(fā)酵液在4℃、5 000 r/min下離心5 min，離心得到的上清液作為胞外組分，收集離心后菌體并在高壓細胞破碎儀下破碎，4℃，8 000 r/min下離心10 min，得到的上清液作為胞內(nèi)可溶組分。重組蛋白帶有組氨酸標(biāo)簽，使用鎳柱親和層析法純化蛋白并進行SDS-PAGE電泳分析，檢測目的蛋白的表達情況［16］。

1.2.4 截短突變體的酶活性分析 采用3，5-二硝基水楊酸方法（簡稱DNS方法）［17］對普魯蘭酶酶活力進行鑒定，以0.5%支鏈淀粉為底物。在相應(yīng)的溫度、pH下，取0.9 mL的底物放入到試管中，預(yù)熱5 min后，加入0.1 mL酶液與其反應(yīng)30 min，迅速加入1.5 mL的DNS試劑終止酶解反應(yīng)，并于沸水浴中煮沸5 min進行顯色反應(yīng)，將上述反應(yīng)液置于冰水中冷卻后測定OD540吸光度。一個酶活力單位定義為在pH 6.0和40℃條件下，每分鐘催化產(chǎn)生1 μmol葡萄糖所需的酶量。其計算公式如下：普魯蘭酶酶活（U/mL）=W×N×1 000/（180.16×30×0.1）。其中W（mg）為酶解產(chǎn)生的葡萄糖量，N為稀釋倍數(shù)，1 000為單位mmol轉(zhuǎn)換為μmol的系數(shù)，180.16 （g/mol）為葡萄糖分子量，30（min）為反應(yīng)時間， 0.1（mL）為適當(dāng)稀釋后酶液體積。

1.2.5 截短突變體的酶學(xué)性質(zhì)分析

1.2.5.1 最適pH及pH穩(wěn)定性測定 配制不同pH的緩沖液：50 mmol/L檸檬酸-磷酸氫二鈉（pH 4.0-8.0）和50 mmol/L Tris-HCl（pH 7.0-9.0）。在最適溫度下，分別測定不同pH下的酶活力，酶活力最高點為最適反應(yīng)pH，以最大酶活力值為100%計算其他pH下的相對酶活力。在室溫條件下，將粗酶液分別置于pH 4.0-9.0緩沖液中處理1 h后，以未處理的樣品作為對照，于最適溫度下測定其剩余酶活力。

1.2.5.2 最適反應(yīng)溫度及熱穩(wěn)定性測定 在pH 6.0反應(yīng)條件下，分別測定不同溫度梯度（30-60℃）下的酶活力，酶活力最高點為最適反應(yīng)溫度，以普魯蘭酶的最大酶活值為100%，計算不同溫度下的相對酶活力。將粗酶液分別置于30-60℃條件下處理1 h，處理后的酶液加入到底物中，于最適溫度下反應(yīng)30 min，以未處理的樣品作為對照，分別測定其剩余酶活力。

1.2.5.3 表觀解鏈溫度值測量 Tm值的測定采用差示掃描熒光定量法（differential scanning fluorometry，DSF）［18］，將20 μL純 化 后 的 蛋 白 質(zhì) 與5 μL的100×SYPRO Orange染料混合離心，實時熒光定量PCR系統(tǒng)中以1℃/min的速度從20℃到80℃加熱樣品來測定Tm值。

2 結(jié)果

2.1 截短突變體的構(gòu)建

如圖1，依據(jù)普魯蘭酶PulB的立體結(jié)構(gòu)設(shè)計3種突變體，分別是依次刪除CBM41結(jié)構(gòu)域N端的甲硫氨酸和纈氨酸的突變體PulBΔN2（M1），刪去甲硫氨酸、纈氨酸、絲氨酸、異亮氨酸的突變體PulBΔN4（M2）以及刪去甲硫氨酸、纈氨酸、絲氨酸、異亮氨酸和兩個精氨酸的突變體PulBΔN6（M3）。

圖1 枯草芽孢桿菌168來源普魯蘭酶結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Structure of pullulanase from B. subtilis 168

對構(gòu)建的截短突變體菌株進行菌落PCR鑒定，如圖2所示，在2 000 bp條帶附近有一條約為2.1 kb的特異性條帶，與目的條帶大小相當(dāng)，同時將獲得的重組突變體質(zhì)粒送武漢擎科生物技術(shù)有限公司測序驗證，測序結(jié)果表明突變位點和設(shè)計位點完全一致，N端截短突變體構(gòu)建成功。

圖2 截短突變體菌落PCR鑒定圖Fig.2 PCR identification of truncated mutants colonies

2.2 截短突變體的表達、純化及動力學(xué)參數(shù)測定

將帶有截短突變體基因的重組表達載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21中，加入IPTG誘導(dǎo)表達，發(fā)酵上清液中檢測不到酶活。SignalP5.0預(yù)測普魯蘭酶信號肽結(jié)果顯示該酶不含有信號肽，且普魯蘭酶的分子量約為80 kD，分子量太大也可能使其難以在胞外表達。超聲破碎菌體并進行鎳柱純化，使用SDS-PAGE凝膠電泳檢測表達情況，結(jié)果如圖3所示，野生型及截短突變體的胞內(nèi)可溶組分中均出現(xiàn)1條分子量約80 kD的條帶，此條帶大小與目標(biāo)蛋白的大小相當(dāng)，說明普魯蘭酶PulB及其截短突變體在大腸桿菌中的表達為可溶性的蛋白形式。

圖3 野生型普魯蘭酶及其截短突變體純化后SDS-PAGEFig.3 SDS-PAGE analysis of the purified wild-type pullulanase and the truncated mutants

通過測定純化后重組蛋白酶活及蛋白濃度，計算得到比酶活，WT、M1、M2和M3比酶活分別為2.30、2.72、3.69和5.62 U/mg。以支鏈淀粉為底物分別對重組蛋白Km和Vmax值進行測定，WT、M1、M2和M3的Km值分別為23.89、29.01、17.29和19.08 mg/mL；Vmax值分別為4.06、2.35、3.92和 7.24 U/mg。

2.3 最適pH及酸堿穩(wěn)定性

3個截短突變體最適pH均為6.0（圖4-A），與野生型一致。野生型和不同突變體的酸堿穩(wěn)定性有一定差異（圖4-B），相比于WT，M1提高了pH穩(wěn)定性，在磷酸緩沖液pH 5.0-8.0處理1 h后，M1剩余酶活力皆可達到50%以上，而WT剩余酶活力只剩不足43%；M2和M3在磷酸緩沖液pH 4.0-8.0處理1 h后，剩余酶活力普遍低于WT。

圖4 野生型及其截短突變體的最適pH及pH穩(wěn)定性Fig.4 Optimal pH and pH stability of wild-type pullulanase and the truncated mutants

2.4 最適溫度及溫度穩(wěn)定性

如圖5所示，截短突變體對最適溫度影響較小，野生型和截短突變體最適溫度曲線變化趨勢大致相同，最適溫度都在40-45℃。熱穩(wěn)定性結(jié)果顯示野生型及突變體普魯蘭酶在30-50℃下穩(wěn)定性很好，但是當(dāng)處理溫度大于50℃剩余酶活力迅速下降，如在55℃下處理1 h后WT、M1、M2和M3剩余酶活力分別為45.29%、63.19%、51.75%和47.33%，各突變體比野生型殘余酶活有所提高，尤其是M1比WT殘余酶活提高了17.90%。

圖5 野生型及其截短突變體的最適溫度及熱穩(wěn)定性Fig.5 Optimal temperature and thermostability of wildtype pullulanase and the truncated mutants

2.5 表觀解鏈溫度值測量

使用DSF法測定野生型和突變體普魯蘭酶表觀解鏈溫度Tm值，圖中的峰值所對應(yīng)的溫度即為蛋白質(zhì)的Tm值，提高熱穩(wěn)定性的突變，其峰形右移；而降低熱穩(wěn)定性的突變，其峰形左移。如圖6所示，與野生型WT進行比較，突變體M2峰形幾乎沒有變化，突變體M1和M3峰形右移。WT、M1、M2和M3的Tm值分別為48.57℃、50.03℃、48.43℃和49.50℃。

圖6 野生型及其截短突變體Tm值測定Fig.6 Tm determination of wild-type pullulanase and the truncated mutants

歸納上述結(jié)果如表2，相比于WT，突變體的比活力均有不同程度的提高，M1、M2和M3的比活力分別為WT的1.18、1.60和2.44倍；M2和M3的Km值分別降低0.72和0.80 mg/mL，M3的Vmax增加3.18 U/mg；M1和M3的Tm值比WT增加了1.57℃和0.93℃。

表2 普魯蘭酶及其截短突變體比酶活、動力學(xué)參數(shù)及Tm值比較Table 2 Comparison of specific activity，kinetic parameters and Tm of pullulanase and the truncated mutants

3 討論

CBM41是CBM家族中存在最廣泛的家族之一，它主要與降解糖原的催化結(jié)構(gòu)域連接，CBM41形成一個β-三明治結(jié)構(gòu)，其C-末端包埋在β-片層的內(nèi)部，而N-末端位于β-片層的側(cè)面，直接暴露在親水環(huán)境中，因此N-末端結(jié)構(gòu)對于酶的整體穩(wěn)定性起重要作用［19］。

本研究通過刪去CBM41結(jié)構(gòu)域N端氨基酸，獲得突變體M1、M2和M3。實驗結(jié)果表明，N端氨基酸截短在一定程度上增強酶的熱穩(wěn)定性以及底物親和力，與野生型相比M1和M3的Tm值分別提高1.57℃和0.93℃，M1和M2的Km降低。這一觀點與前人的研究結(jié)果一致，王馨葉［20］截短Bacillus naganoensis普魯蘭酶N端不同長度氨基酸，獲得截短突變體ΔN5和ΔN106的半衰期增長，Km值減小。Nisha等［21］通過截短Geobacillus thermoleovorans普魯蘭酶的N端氨基酸，構(gòu)建了N端1-257位氨基酸缺失的突變體，其酶活和熱穩(wěn)定性都有明顯提高。分析Bacillus subtilis168來源普魯蘭酶蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，CBM41結(jié)構(gòu)域的N端氨基酸沒有形成規(guī)則二級結(jié)構(gòu)同時在三級結(jié)構(gòu)中處于N端游離的末端。二級結(jié)構(gòu)中無規(guī)則片段柔性較大，易受溫度、pH的影響，更容易失活，葉延欣等［22］發(fā)現(xiàn)影響熱穩(wěn)定性的主要因素是α-螺旋含量和無規(guī)則片段含量，降低二級結(jié)構(gòu)中無規(guī)則片段的含量使螺旋的含量增加可以提高酶的熱穩(wěn)定性。CBM41結(jié)構(gòu)域與酶-底物結(jié)合相互作用密切相關(guān)，去除N端氨基酸所形成的無規(guī)則片段使其結(jié)構(gòu)更加緊湊，同時也使酶與底物結(jié)合的空間位阻變?。?3］，因此增強底物的親和力。

與M1相比M3的Km值增加，Tm降低0.53℃。M3多刪除的4個氨基酸中有兩個為精氨酸，精氨酸側(cè)鏈為長鏈，可更好的維持蛋白結(jié)構(gòu)，刪除精氨酸可能使蛋白分子更容易變性，從而降低底物親和力。普魯蘭酶N端第6位精氨酸與第84位天冬氨酸形成氫鍵，Li等［24］的研究表明氫鍵是穩(wěn)定蛋白二級結(jié)構(gòu)的重要作用力，對維持熱穩(wěn)定性有著重要意義，增加一個氫鍵，能使酶獲得0.6 Kcal/mol的能量來維持穩(wěn)定性。因此M3的Tm值低于M1可能是由于其氫鍵損失導(dǎo)致。

4 結(jié)論

CBM41結(jié)構(gòu)域N端截短6個氨基酸，普魯蘭酶最適反應(yīng)溫度和pH無變化，提升了酶活性和Tm。與野生型普魯蘭酶相比，3個截短突變體中M3性質(zhì)改良綜合優(yōu)勢較為明顯，比活力是WT的2.44倍，Tm提高0.93℃，Km降低0.80倍。M2的底物親和力最強，然而比活力和熱穩(wěn)定性低于M3；M1的Tm最高，然而酶活性最低。因此，經(jīng)截短改造的突變體酶學(xué)性質(zhì)有一定程度的改良，為解析普魯蘭酶結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系提供了相關(guān)實驗依據(jù)和分析方法。