方 靈， 韋 航， 黃 彪， 司瑞茹， 史夢竹， 阮雅娟， 傅建煒*

(1.福建省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標準與檢測技術(shù)研究所，福建福州 350003;2.福建省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全重點實驗室，福建福州 350003;3.寧德市產(chǎn)品質(zhì)量檢驗所，福建寧德 352100)

水產(chǎn)品因其富含蛋白質(zhì)，廣受人們喜愛，在人們的飲食結(jié)構(gòu)中占有重要地位[1]。有研究發(fā)現(xiàn)，擬除蟲菊酯等農(nóng)藥用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中，可以預防和控制寄生蟲病和微生物病等疾病，以提高生產(chǎn)效率[2,3]。農(nóng)藥殘留通過食物鏈最終富集在人體中，長期攝入含有農(nóng)藥殘留的食物，可對人類神經(jīng)、免疫、心血管等系統(tǒng)產(chǎn)生毒性作用[4]。此外，農(nóng)藥殘留對環(huán)境也產(chǎn)生越來越大影響。隨著貿(mào)易全球化及水產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展，許多國家和組織越來越注重水產(chǎn)品質(zhì)量安全。為了保障食品安全，各國政府對水產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留加大了監(jiān)督力度，對其限量要求也越來越嚴格。因此，開發(fā)一種快速、準確地篩查水產(chǎn)品中多農(nóng)藥殘留的檢測方法十分必要。

目前，農(nóng)藥殘留的分析方法主要有氣相色譜、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜、液相色譜、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜等方法[5 - 7]。氣相色譜法、液相色譜法、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法存在分析農(nóng)藥種類有限、分析時間較長的缺點。超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法因其具有高選擇性、高靈敏度等優(yōu)點，在同時定性定量檢測方面具有顯著優(yōu)勢，成為多農(nóng)藥殘留檢測分析的一個重要技術(shù)手段。水產(chǎn)品中含有大量的蛋白質(zhì)、脂肪等化合物，這些物質(zhì)不僅會造成儀器污染，而且可能會干擾目標農(nóng)藥的檢測。因此建立一種高效的前處理方法十分關鍵。常見的提取方法有固相萃取法[8]、液-液萃取法[9]、分散固相萃取法[10 - 12]等，但固相萃取法、液-液萃取法等方法存在耗時長、前處理操作復雜等缺點。分散固相萃取具有快速便捷、成本低廉、萃取效率高等特點，廣泛應用于樣品前處理。本研究篩選和優(yōu)化了提取溶液及凈化方法，建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定水產(chǎn)品中70種農(nóng)藥殘留的分析方法，該方法可以為水產(chǎn)品中多農(nóng)藥殘留風險評估及風險預警提供技術(shù)支撐。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Shimadzu LC-MS8050超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(日本，島津公司)；T18均質(zhì)機(德國，IKA公司)；TurboVap氮吹儀(瑞典，Biotage公司)；KQ-500DE超聲儀(昆山市超聲儀器有限公司)；Anke TDL-5-A離心機(上海安亭科學儀器廠)；Milli-Q超純水器(美國，Millipore公司)。

農(nóng)藥標準品(天津阿爾塔科技有限公司)。甲醇、乙腈(色譜純，德國Merck公司)；甲酸(色譜純，上海麥克林公司)；NH4Ac(色譜純，美國Fish Chemical公司)；無水MgSO4(分析純，西隴科學股份有限公司)；NaCl(分析純，國藥集團股份有限公司)；N-丙基乙二胺(PSA)、C18(天津博納艾杰爾科技公司)。實驗用水為超純水。

1.2 標準溶液配制

準確吸取各標準品，用甲醇混勻并定容，配制成10 μg/mL的混合標準儲備溶液，于-20 ℃下密閉保存。準確移取一定量的混合標準儲備溶液，配制成質(zhì)量濃度為0.2、0.5、1.0、5.0、10、20、50、100 ng/mL的系列空白基質(zhì)標準溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3 樣品前處理

按照國家標準(GB/T 30891-2014)《水產(chǎn)品抽樣規(guī)范》制樣，取可食用部分均質(zhì)后，于-20 ℃下密閉保存。準確稱取2.00 g(精確至0.01 g)樣品至15 mL聚丙烯離心管中，加入5 mL超純水，均質(zhì)1 min后，依次加入10 mL 1%甲酸乙腈溶液、2 g NaCl，漩渦振蕩10 min后，以5 000 r/min離心10 min，移取上清液至另一離心管中，按上述方法重復提取一次，合并上清液，待凈化。

取5 mL上清液，加入150 mg PSA、150 mg C18及150 mg無水MgSO4，渦旋混勻，以5 000 r/min離心5 min，取上清液，于40 ℃下氮吹近干，用初始流動相溶解并定容至1 mL，過0.22 μm PTFE濾膜后，待UPLC-MS/MS分析。

1.4 色譜與質(zhì)譜條件

1.4.1 液相色譜條件Waters Acquity UPLC TSS T3色譜柱(100 mm×2.1 mm×1.8 μm)；流動相：A為0.1%甲酸-5 mmol/L NH4Ac溶液；B為甲醇。梯度洗脫程序：0～1.0 min，90%A；1.0～4.0 min，90%～50%A；4.0～12.0 min，50%～25%A；12.0～14.0 min，25%～5%A；14.0～18.0 min，5%A；18.0～18.1 min，5%～90%A；18.1～23.0 min，90%A。流速：0.30 mL/min；柱溫：40 ℃；進樣量：2.0 μL。

1.4.2 質(zhì)譜條件電噴霧離子源(ESI源)；多反應監(jiān)測模式(MRM)掃描；霧化氣流量：3 L/min；加熱氣流量：10 L/min；干燥氣流量：10 L/min；接口溫度：400 ℃；脫溶劑溫度：650 ℃；脫溶劑管(DL)溫度：250 ℃。其他質(zhì)譜參數(shù)詳見表1。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜和質(zhì)譜條件優(yōu)化

本研究中大部分農(nóng)藥是極性物質(zhì)，為改善峰形及達到更理想分離效果，分別考察了Acquity UPLC TSS T3色譜柱(100 mm×2.1 mm×1.8 μm)和Acquity UPLC BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm×1.7 μm)兩種色譜柱對70種農(nóng)藥的分離效果。結(jié)果顯示，Acquity UPLC TSS T3色譜柱分離效果更佳，多數(shù)目標物的峰形相對尖銳對稱，可能是由于TSS T3色譜柱是硅膠基質(zhì)色譜柱，對極性分子具有較好的保留。因此，本研究選取Acquity UPLC TSS T3柱作為此次研究的色譜柱。

不同目標物在不同離子模式下響應不同，根據(jù)70種農(nóng)藥的化學電離性質(zhì)，本研究選擇正、負離子模式同時監(jiān)測，以提高檢測效率。在流動相中加入一定量的甲酸、NH4Ac可以提高離子化效率，起到改善峰形、提高靈敏度的效果。本研究流動相選用0.1%甲酸-5 mmol/L NH4Ac溶液與甲醇，能夠提高多數(shù)目標物的信號響應強度，分離效果良好。通過質(zhì)譜掃描分析，選擇響應強度較高的前體離子、產(chǎn)物離子，對各目標物分析所選用的脫溶劑溫度、碰撞能量等參數(shù)進行優(yōu)化，確定了定量離子對與定性離子對之間的離子比率，并設定合適駐留時間。各農(nóng)藥的前體離子、產(chǎn)物離子、碰撞能量等信息見表1。圖1為最優(yōu)條件下空白鰻魚樣品加標后(5 μg/kg)總離子流色譜圖。

表1 70種農(nóng)藥質(zhì)譜信息參數(shù)

(續(xù)表1)

圖1 空白鰻魚樣品加標后(5 μg/kg)的總離子流色譜圖Fig.1 Total ion current chromatogram of blank eel spiked with 5 μg/kg of analytes

2.2 前處理方法優(yōu)化

2.2.1 提取溶劑的優(yōu)化對于多殘留篩查，建立一個簡便、可靠的提取方法十分關鍵。乙腈、酸化乙腈溶液等是農(nóng)藥殘留分析中比較常用提取溶劑。本研究比較了乙腈、0.5%甲酸-乙腈溶液、1%甲酸-乙腈溶液、2%甲酸-乙腈溶液4種提取溶劑對70種目標物的提取效率。在空白樣品中添加適量農(nóng)藥混合標準溶液，在相同條件下處理，進行添加回收試驗。結(jié)果顯示，隨著甲酸含量增大，目標物的回收率逐漸增大，以1%甲酸-乙腈溶液作為提取溶劑時，大部分農(nóng)藥平均回收率較高，當繼續(xù)增大甲酸含量，目標物的回收率趨于平穩(wěn)?？赡苁怯捎谝译鎸Χ鄶?shù)農(nóng)藥具有較好的溶解度且乙腈能夠使蛋白沉淀，減少一些弱極性物質(zhì)干擾，加入一定量甲酸后，有利于一些酸性農(nóng)藥提取。綜合考慮，本研究采用1%甲酸-乙腈溶液為提取溶劑。

2.2.2 凈化方法的優(yōu)化PSA、C18等常作為凈化劑，正己烷可以去除脂肪等物質(zhì)，PSA是弱陰離子交換吸附劑，可以去除樣品基質(zhì)中的脂肪酸等物質(zhì)，C18主要用于去除樣品基質(zhì)中脂類等弱極性干擾物等，無水MgSO4能有效吸收水分。本研究分別考察了正己烷、PSA、C18及冷凍方法等對鰻魚樣品提取液的凈化效果。方法(1)：150 mg PSA+150 mg C18+150 mg MgSO4。方法(2)：150 mg PSA+150 mg MgSO4。方法(3)：150 mg C18+150 mg MgSO4。方法(4)：取5 mL提取液，加入6 mL正己烷。方法(5)：提取液于-20 ℃下冷凍6 h。不同凈化方法對目標農(nóng)藥的添加回收影響見圖2。結(jié)果表明，與其他凈化方法相比，使用方法(1)，大部分目標組分回收率較高，在該凈化方式下能夠獲得良好的凈化效果，能夠滿足分析測試的要求。

2.3 方法的定量限

根據(jù)每種農(nóng)藥響應值，配制系列空白基質(zhì)匹配標準工作溶液，在上述色譜及質(zhì)譜條件下分析，外標法定量。以10倍信噪比(S/N≥10)得到方法的定量限(LOQ)，定量限結(jié)果見表2，定量限在0.5～5 μg/kg范圍內(nèi)。在0.2～100 ng/mL線性范圍內(nèi)呈良好的線性關系，線性方程相關系數(shù)(r2)均大于0.99。

表2 水產(chǎn)品中70種農(nóng)藥添加回收率、LOQ、RSD及基質(zhì)效應(n=6)

(續(xù)表2)

2.4 方法的回收率及精密度

以空白鰻魚、對蝦為檢測對象，在空白基質(zhì)中分別添加低、中、高3個加標水平標準溶液，進行添加回收試驗。每個水平重復測定6次，進行精密度試驗。按照本研究建立的前處理方法處理后進行UPLC-MS/MS測定，計算回收率及相對標準偏差(RSD)。結(jié)果表明，在加標水平為1～20 μg/kg時，平均回收率范圍為70.2%～119.6%，RSD在3.6%～9.8%之間。70種農(nóng)藥加標為10 μg/kg時在不同基質(zhì)中回收率及精密度見表2。表明該方法準確度及精密度能滿足水產(chǎn)品中70種農(nóng)藥殘留篩查分析的要求。

2.5 基質(zhì)效應

基質(zhì)效應(Matrix Effect，ME)一般是共提取物對目標物的影響[13]。本研究通過考察空白基質(zhì)中標準溶液響應強度(A)與純?nèi)軇┲袠藴嗜芤喉憫獜姸?B)，比較二者的比值大小，反映該方法的基質(zhì)效應，即ME=A/B×100%。一般情況下，基質(zhì)效應分為五類[14]，ME小于50%為強基質(zhì)抑制效應，ME在50%～90%為中等基質(zhì)抑制效應，ME在90%～110%之間等同于無基質(zhì)效應，ME在110%～150%之間為中等基質(zhì)增強效應，ME大于150%為強基質(zhì)增強效應。本研究考察了鰻魚、對蝦兩種基質(zhì)對目標物的影響(表2)，在鰻魚和對蝦基質(zhì)中，分別有32項農(nóng)藥、16項農(nóng)藥產(chǎn)生中等基質(zhì)抑制效應，11項農(nóng)藥、6項農(nóng)藥的基質(zhì)效應為中等基質(zhì)增強效應，其余農(nóng)藥在二者基質(zhì)中沒有基質(zhì)效應。為降低基質(zhì)效應影響，本研究采用空白基質(zhì)匹配外標法定量，對基質(zhì)效應進行校正，以提高定量結(jié)果的準確性。

2.6 實際樣品分析

采用所建立的方法對市場上對蝦進行農(nóng)藥殘留篩查分析，共采集樣品10份。結(jié)果顯示，其中2份對蝦樣品檢出二嗪磷，含量分別為1.2 μg/kg、2.1 μg/kg，其余樣品未檢出農(nóng)藥或結(jié)果低于定量限。

3 結(jié)論

本研究建立了一種水產(chǎn)品中多農(nóng)藥殘留篩查分析方法，采用分散固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定水產(chǎn)品中殺蟲劑、殺菌劑、除草劑等70種農(nóng)藥殘留。樣品經(jīng)1%甲酸-乙腈溶液提取，利用PSA、C18以及無水MgSO4分散固相萃取，在多反應監(jiān)測模式下進行定性定量分析，各農(nóng)藥定量限在0.5～5 μg/kg之間。該方法靈敏度高、準確度高、高通量，能夠滿足水產(chǎn)品中多農(nóng)藥殘留篩查分析的檢測要求，為水產(chǎn)品中多農(nóng)藥殘留風險評估提供技術(shù)支撐。