呂欣然，李敘波，孫 悅，佟鑫瑤，杜 宏，白鳳翎，張德福

(渤海大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧 錦州121013)

0 引言

由于抗菌藥物的不合理使用，導(dǎo)致多種微生物對(duì)常見藥物產(chǎn)生耐藥性問題，因此，耐藥菌成為人類在醫(yī)療、農(nóng)業(yè)、食品等領(lǐng)域中備受關(guān)注的問題．大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)，也稱為大腸桿菌，是一種常見的食源性致病菌[1]，普遍出現(xiàn)在肉制品、乳制品和蔬菜等食品和農(nóng)產(chǎn)品中．雞肉及其制品已成為我國(guó)民眾第二大肉類蛋白消費(fèi)來源，但其極易受大腸桿菌的污染，人類食用后可出現(xiàn)胃痛、發(fā)熱、腸道感染、腹瀉等癥狀[2]．研究表明，常使用頭孢拉定、鏈霉素、紅霉素等抗生素治療大腸桿菌引起的食源性疾病．但這些抗生素的頻繁使用易使大腸桿菌出現(xiàn)耐藥性，并且耐藥性可在細(xì)菌間快速傳播形成多重耐藥菌[3]．因此,急需研發(fā)出一種安全且能夠阻止多重耐藥菌生長(zhǎng)的抗菌劑．生物抗菌劑具備安全、高效、無毒、無害以及不易出現(xiàn)耐藥性等要素，逐漸成為傳統(tǒng)抗生素的替代品[4]．乳酸菌(Lactic Acid Bacteria，LAB)是一類新型生物抗菌劑，已被發(fā)現(xiàn)在乳制品、肉制品、水產(chǎn)品等食品分類中表現(xiàn)出良好的使用效果，其主要通過產(chǎn)生細(xì)菌素、有機(jī)酸等代謝物質(zhì)來對(duì)抗細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖[5]．Perales-Adn等[6]發(fā)現(xiàn)乳酸菌產(chǎn)生的圓形細(xì)菌素AS-48和羊毛硫抗生素乳鏈菌肽細(xì)菌素能夠抑制耐藥性金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的生長(zhǎng)繁殖，當(dāng)二者聯(lián)合使用時(shí)，最低抑菌濃度下降至0．04～0．05 μmol/L之間．Kumar等[7]研究發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌和嗜酸乳桿菌均可以抑制多重耐藥性腸聚合性大腸桿菌(Multidrug-Resistant EnteroaggregativeEscherichiacoli，MDR-EAEC)生長(zhǎng)，并且兩者協(xié)同作用更顯著，體內(nèi)感染小鼠發(fā)現(xiàn)兩株乳酸菌均能有效清除體內(nèi)MDR-EAEC．課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)XCT1-1產(chǎn)生的細(xì)菌素對(duì)耐阿奇霉素的大腸桿菌具有良好的抑制作用[8]，但其是否能在雞肉產(chǎn)品中保持良好的作用還有待研究．

本文在前期研究基礎(chǔ)上，通過測(cè)定細(xì)菌菌落總數(shù)、pH、TVB-N、持水力等指標(biāo)評(píng)價(jià)菌株XCT1-1細(xì)菌素粗提物對(duì)雞肉中耐藥性大腸桿菌的抑制作用及品質(zhì)的影響，以期為開發(fā)控制肉制品中耐藥性致病菌的乳酸菌生物抗菌劑提供理論基礎(chǔ)．

1 材料與方法

1．1 材料與儀器

1．1．1 樣品與菌株

新鮮雞胸脯肉：購(gòu)于遼寧省錦州市金凌市場(chǎng)．

供試菌：植物乳桿菌XCT1-1，目標(biāo)菌：耐阿奇霉素E．coli0001，兩者均存于本校微生物學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室．

1．1．2 培養(yǎng)基與試劑

LB肉湯、MRS肉湯、MRS瓊脂培養(yǎng)基、平板計(jì)數(shù)培養(yǎng)基(PCA)、麥康凱培養(yǎng)基、北京奧博星生物技術(shù)有限公司；阿奇霉素，上海阿拉丁生化科技股份有限公司．

1．1．3 儀器與設(shè)備

SW-CJ-1D型超凈工作臺(tái)，蘇州博萊爾凈化設(shè)備；KS50R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，鹽城市凱特實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；SPX-150生化培養(yǎng)箱，金壇經(jīng)濟(jì)開發(fā)區(qū)吉特實(shí)驗(yàn)儀器廠；上海菁華723PC可見分光光度計(jì)，上海菁華科技儀器有限公司；美國(guó)OHAUS奧豪斯pH檢測(cè)儀AB33，深圳市怡華新電子有限公司；SARTORIUS賽多利斯普及型精密天平GL2201-1SCN，季爾國(guó)際貿(mào)易(上海)有限公司；MixMax渦旋儀，合肥艾本森科學(xué)儀器有限公司；全自動(dòng)立式高壓蒸汽滅菌器，山東博科滅菌技術(shù)有限公司；YRE-10-50L旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，羽中儀器；DZF-6020A型真空干燥箱，力辰科技；上海沛歐SKD-1000全自動(dòng)凱氏定氮儀，上海沛歐．

1．2 方法

1．2．1 植物乳桿菌XCT1-1細(xì)菌素粗提物的制備

將于-80 ℃冰箱保藏的植物乳桿菌XCT1-1以2%的接種量在10 mL MRS肉湯中活化傳代2次，接下來以同樣的接種量接種于1 000 mL MRS肉湯中，37 ℃下培養(yǎng)12 h后得到乳酸菌發(fā)酵液，4 ℃下 10 000 r/min離心15 min，用0．45 μm無菌濾菌器過濾得菌株XCT1-1無細(xì)胞上清液(Cell Free Supernatants，CFS)．將CFS(100 mL)置于分液漏斗中，分5次加入100 mL乙酸乙酯，混勻后靜置5 min，待分層后收集有機(jī)相，將其置于50 ℃下真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)消除有機(jī)溶劑，收集瓶中余液，在55 ℃，100 r/min的真空條件下，將液體進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，以其顏色澄清為終點(diǎn)，而后將處理好的澄清液體統(tǒng)一保存．接下來選擇真空度0．420、溫度為-40 ℃，進(jìn)行為期48 h的真空冷凍干燥，以澄清液體變成粉末顆粒狀為準(zhǔn)，最后處理好的樣品統(tǒng)一收集在超低溫冰箱，留存?zhèn)溆茫?/p>

1．2．2 耐阿奇霉素大腸桿菌菌懸液的制備

將于-80 ℃冰箱保存的菌株0001按液體培養(yǎng)基體積的2%進(jìn)行接種，即利用移液槍吸收200 μL菌液，打入10 mL LB肉湯中，在30 ℃培養(yǎng)箱中放置12 h，活化至3代后，利用滅菌后的生理鹽水進(jìn)行梯度稀釋操作，直至最終濃度為1．0 × 104CFU/mL，置于4 ℃冰箱備用．

1．2．3 雞肉接種試驗(yàn)

根據(jù)之前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知：針對(duì)耐藥性E．coli0001，植物乳桿菌XCT1-1細(xì)菌素粗提物的最小抑菌濃度(MIC)為6 mg/mL[8]．選擇雞肉為研究對(duì)象[9]，利用75%乙醇噴灑雞肉表面，使用無菌刀具將雞肉切成10.0 g/塊的雞肉塊備用，在無菌條件下將雞肉采用浸泡法處理，浸泡30 min，撈出瀝干30 min，細(xì)菌素粗提物處理的濃度為0．75 MIC，耐藥性E．coli的接種濃度1．0 × 104CFU/mL，阿奇霉素的接種濃度15 μg/mL．具體處理方式見表1：

表1 菌株與雞肉的不同處理方式

對(duì)樣品進(jìn)行密封包裝后，存于4 ℃冰箱，進(jìn)行為期10 d的冷藏，每隔2 d取樣對(duì)細(xì)菌菌落總數(shù)、pH值、TVB-N值及持水性四個(gè)指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定．

1．2．4 細(xì)菌菌落總數(shù)

按照GB 4789．2—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》操作，準(zhǔn)確稱取處理后的雞肉5．0 g于蒸煮袋中，分別加入無菌0．85%氯化鈉45 mL，用拍打均質(zhì)機(jī)拍打2 min，采用10倍逐級(jí)稀釋，選擇3個(gè)適宜濃度，利用PCA培養(yǎng)基進(jìn)行菌落總數(shù)計(jì)數(shù)，在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 h，而后對(duì)菌落總數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)．

1．2．5 pH的測(cè)定

按照GB 5009．237—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品pH值的測(cè)定》進(jìn)行檢測(cè)．準(zhǔn)確稱取1．2．3中處理方法的雞肉5．0 g，分別加入無菌水45 mL，均質(zhì)，在室溫條件下靜置20 min后，用濾網(wǎng)過濾除去濾渣，利用pH計(jì)記錄其濾液．

1．2．6 揮發(fā)性鹽基氮(TVB-N)的測(cè)定

參照Li等[10]的方法并略作修改．準(zhǔn)確稱取1．2．3中處理的雞肉10．0 g于蒸餾管中，添加1．0 g輕質(zhì)MgO，連接到全自動(dòng)定氮儀，TVB-N以mg N/100 g表示．

1．2．7 雞肉持水力(Water Holding Capacity，WHC)的測(cè)定

參照Castellini等[11]的方法并略作修改．取雞肉樣品5．0 g，記為W0．利用濾紙包住稱得的雞肉，而后整體放入50 mL離心管內(nèi)，在溫度4 ℃，轉(zhuǎn)速為2 500 r/min的條件下離心，時(shí)間為10 min，記錄完成離心的雞肉樣品的重量W1．將雞肉剁碎，放在恒溫箱中晾干，溫度調(diào)整為60 ℃，記錄烘干后的重量W2，按下列公式求得雞肉的持水力．

式中：W0為雞肉樣品的重量；W1離心后的肉樣重量；W2為雞肉絞碎后烘干的重量．

1．3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式，每組實(shí)驗(yàn)做3次平行實(shí)驗(yàn)．利用SPSS 19．0分析數(shù)據(jù)，采用Origin 8．0作圖．

2 結(jié)果與分析

2．1 細(xì)菌菌落總數(shù)

菌落計(jì)數(shù)可反映食品被細(xì)菌污染的程度[12]，是評(píng)價(jià)食品安全的重要指標(biāo)．GB 16869—2005《鮮、凍禽產(chǎn)品》規(guī)定凍禽產(chǎn)品的細(xì)菌菌落總數(shù)超過5．0 log CFU/g為不合格品．

圖1(a)和圖1(b)分別表示細(xì)菌素粗提物單獨(dú)和與阿奇霉素共同處理雞肉樣品貯藏期間細(xì)菌菌落總數(shù)變化．隨著存放時(shí)間的延長(zhǎng)，處理組和對(duì)照組的細(xì)菌菌落總數(shù)均有所增加．如圖1(a)所示，對(duì)照組在第4 d均超過國(guó)家規(guī)定限量標(biāo)準(zhǔn)；在第6 d，只有處理組A-T1的細(xì)菌菌落總數(shù)未超過5．0 log CFU/g；8 d后所有組樣品均超過國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)；在第10 d時(shí)，將處理組A-T1與陰性對(duì)照組A-NC進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌菌落總數(shù)下降了1．76 log CFU/g；處理組A-T2與陽性對(duì)照組A-PC相比，細(xì)菌菌落總數(shù)則下降了1．71 log CFU/g．說明植物乳桿菌XCT1-1粗提物可抑制雞肉中細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖，從而有效延長(zhǎng)雞肉貨架期2 d．

(a)細(xì)菌素粗提物單獨(dú)處理

(b)細(xì)菌素粗提物與阿奇霉素共同處理

根據(jù)圖1(b)得出，在第4 d時(shí)，耐藥性大腸桿菌單獨(dú)處理的陰性對(duì)照組和與阿奇霉素共同處理的陽性對(duì)照組中的細(xì)菌菌落總數(shù)均超過國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，而兩組處理組均未超過4．0 log CFU/g，即在國(guó)家規(guī)定限量標(biāo)準(zhǔn)以下；第6 d時(shí)，處理組B-H1超過國(guó)家規(guī)定數(shù)量，處理組B-H2的結(jié)果則是4．7 log CFU/g，小于 5 log CFU/g；貯藏后期第10 d時(shí)，對(duì)照組B-NC組與B-PC組無顯著性差異(P> 0．05)，處理組B-H1和B-H2細(xì)菌菌落總數(shù)具有顯著性差異(P< 0．05)．與對(duì)照組B-NC相比，處理組B-H1和B-H2細(xì)菌菌落總數(shù)分別下降了1．45 log CFU/g和2．25 log CFU/g(P< 0．05)．由此表明植物乳桿菌XCT1-1細(xì)菌素粗提物與阿奇霉素協(xié)同作用對(duì)于對(duì)抗雞肉中細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖有較好的效果，可使感染耐藥性E．coli雞肉的貨架期延期4 d．

通過分析細(xì)菌菌落總數(shù)這一指標(biāo)可知，細(xì)菌素粗提物單獨(dú)使用或與阿奇霉素協(xié)同作用都對(duì)雞肉有良好的抑菌效果，可有效延長(zhǎng)雞肉貨架期2～4 d，并且二者共同作用時(shí)對(duì)雞肉的保鮮效果更好．王鵬等[13]選取新鮮豬肉作為研究對(duì)象，分別用濃縮的戊糖乳桿菌菌懸液及其發(fā)酵上清液對(duì)鮮豬肉進(jìn)行處理，結(jié)果表明，經(jīng)上清液處理的豬肉中的細(xì)菌菌落總數(shù)始終比對(duì)照組低，證明戊糖乳桿菌的上清液有良好的抑菌保鮮作用，此結(jié)果與本文研究結(jié)果相似．

2．2 pH

pH常被作為評(píng)價(jià)肉類新鮮度的指標(biāo)之一[14]．根據(jù)GB 2707—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 鮮(凍)畜、禽產(chǎn)品》，將雞肉分為3個(gè)等級(jí)(一級(jí)鮮度為pH 5．8～6．3；二級(jí)鮮度為pH 6．3～6．7，第三個(gè)等級(jí)腐敗變質(zhì)肉為pH > 6．7)．

圖2表示不同處理組雞肉樣品在4 ℃貯藏條件下pH變化情況．由圖可知，pH整體變化呈“V”型．由圖2(a)可知，第2 d時(shí)，4組樣品的pH下降到最低值，這可能是初始鮮肉冷卻排酸過程不充分造成[15-16]；第4 d時(shí)，對(duì)照組A-NC、A-PC已變質(zhì)，處理組A-T1和A-T2屬于次鮮肉；第8 d時(shí)，所用樣品pH均超過6．7，屬于腐敗變質(zhì)肉；在貯藏后期10 d時(shí)，處理組A-T1相比于陰性對(duì)照組pH降低了 6．19%；而處理組A-T2與陽性對(duì)照組比較后，下降了5．90%．結(jié)果表明細(xì)菌素粗提物可減緩雞肉貯藏過程中pH的上升．

根據(jù)圖2(b)，在第2 d時(shí)，所有樣品的pH均屬于一級(jí)鮮度；樣品保存第4 d，對(duì)照組B-NC、B-PC發(fā)生變質(zhì)，處理組B-H1處于二級(jí)鮮度范圍，而處理組B-T2的pH仍在5．8～6．3，屬于一級(jí)鮮度；第6 d時(shí)，處理組B-H2未超過6．7，而另外3組樣品則腐敗變質(zhì)；第8 d時(shí)，所有樣品均成為變質(zhì)肉．貯藏后期第 10 d，和陰性對(duì)照組B-NC進(jìn)行相比，處理組B-H1與處理組B-H2的pH分別降低了6．04%、10．06%(P< 0．05)，兩組對(duì)照組B-PC與B-NC的pH無顯著性差異．結(jié)果表明細(xì)菌素粗提物與阿奇霉素共同處理可減緩雞肉pH的上升．

(a)細(xì)菌素粗提物單獨(dú)處理

(b)細(xì)菌素粗提物與阿奇霉素共同處理

通過樣品pH變化情況發(fā)現(xiàn)，樣品pH變化結(jié)果與細(xì)菌落總數(shù)變化情況具有一致性，說明細(xì)菌素粗提物單獨(dú)使用或與阿奇霉素共同使用可通過抑制微生物的生長(zhǎng)，來延緩雞肉pH的變化．崔天琦等[17]研究發(fā)現(xiàn)，在加入L．plantarumJY-22細(xì)菌素粗提物可以造成鰱魚丸在儲(chǔ)藏的時(shí)間內(nèi)減緩pH值的下降速率，而本文與其研究結(jié)果相似．

2．3 TVB-N

揮發(fā)性鹽基氮(Total Volatile Basic Nitrogen，TVB-N)作為評(píng)判動(dòng)物性食品新鮮程度的重要指標(biāo)而出現(xiàn)[18]．肉及肉制品中TVB-N的標(biāo)準(zhǔn)：一級(jí)鮮肉≤15 mg/100 g；二級(jí)鮮肉≤20 mg/100 g；變質(zhì)肉 > 20 mg/100 g[19]．圖3表示不同處理組的樣品貯藏期間TVB-N變化情況，當(dāng)貯藏時(shí)間的增加，處理組和對(duì)照組樣品的TVB-N值均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)．圖3(a)中，初始時(shí)樣品TVB-N值均小于10 mg/100 g，為一級(jí)鮮度；第4 d時(shí)，對(duì)照組A-PC高于20 mg/100 g，屬于變質(zhì)肉；而對(duì)照組A-NC，處理組A-T1和A-T2均低于 15 mg/100 g，為一級(jí)鮮度；第8 d時(shí)，對(duì)照組均為變質(zhì)肉，處理組A-T1，A-T2則處于二級(jí)鮮度狀態(tài)；貯藏后期10 d時(shí)，處理組A-T1與陰性對(duì)照組相比降低了32．00%，處理組A-T2與陽性對(duì)照組相比降低了 30．13%．結(jié)果表明，細(xì)菌素粗提物可有效減緩雞肉貯藏過程中TVB-N值的增加．

圖3(b)中，第4 d時(shí)陰性和陽性對(duì)照組TVB-N值大于20 mg/100 g，處理組B-H1和B-H2的TVB-N值分別為13．58 mg/100 g、12．11 mg/100 g，均為一級(jí)鮮度；第8 d時(shí)，對(duì)照組A-NC，A-PC均為變質(zhì)肉，而處理組B-H1、處理組B-H2則處于二級(jí)鮮度狀態(tài)；貯藏末期第10 d，處理組B-H1和B-H2與陽性對(duì)照組相比TVB-N值分別降低了31．40%、39．38%(P< 0．05)，陰性對(duì)照組與陽性對(duì)照組無顯著性差異．因此細(xì)菌素粗提物與阿奇霉素的共同作用能有效減緩雞肉TVB-N值的上升．

(a)細(xì)菌素粗提物單獨(dú)處理

(b)細(xì)菌素粗提物與阿奇霉素共同處理

由樣品TVB-N值變化情況可知，在第8 d，測(cè)得對(duì)照組A-NC，A-PC的TVB-N值均超過20 mg/100 g，處理組的TVB-N值小于20 mg/100 g，屬于二級(jí)鮮肉，該變化與前文菌落總數(shù)變化趨勢(shì)基本一致．說明細(xì)菌素粗提物單獨(dú)使用或與阿奇霉素共同使用可通過抑制微生物的生長(zhǎng)，有效減緩雞肉TVB-N值上升．卜堅(jiān)珍等[20]利用乳酸鏈球菌素(0．12%)分別與山竹多酚(0．4%)和茶多酚(0．4%)復(fù)配抑菌液處理新鮮雞胸肉，貯藏末期(第9 d)處理組的雞胸肉TVB-N值小于20 mg/100 g，為二級(jí)鮮度；而對(duì)照組雞肉TVB-N值為27．82 mg/100 g，屬于變質(zhì)肉，本文與其研究結(jié)果相似．

2．4 肉的持水力

雞肉及雞肉制品的持水力是判定其品質(zhì)的重要指標(biāo)之一[21]．4 ℃條件下，不同方法處理的雞肉樣品連續(xù)貯藏10 d持水力變化如圖4所示，在第0 d，所有樣品的持水力處于60%～80%．處理組持水力始終顯著高于對(duì)照組，可能是由于細(xì)菌素本身具有較好的持水力[22]，導(dǎo)致其初始值高于對(duì)照組．

如圖4(a)所示，四組樣品中，雞肉樣品持水力隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸地降低，但是處理組持水力降低速率顯著低于對(duì)照組(P< 0．05)．貯藏末期10 d，與0 d相比，處理組AT1持水力值下降約40%，處理組AT2持水力值下降低約30%；而陰性對(duì)照組下降約50%，陽性對(duì)照組下降約45%，均明顯高于對(duì)照組的下降速率，表明植物乳桿菌XCT1-1粗提物能有效減緩雞肉持水力的下降．

圖4(b)中，陰性對(duì)照組與陽性對(duì)照組無顯著性差異(P> 0．05)，與陰性對(duì)照組相比，貯藏末期處理組B-H1和B-H2的持水力降低速率減緩了10．87%、28．87%(P< 0．05)．結(jié)果表明植物乳桿菌XCT1-1粗提物與阿奇霉素共同作用可有效減緩貯藏雞肉持水力的下降．

(a)細(xì)菌素粗提物單獨(dú)處理

(b)細(xì)菌素粗提物與阿奇霉素共同處理

根據(jù)樣品持水力變化情況分析：添加細(xì)菌素粗提物及其與阿奇霉素共同作用能有效減緩雞肉持水力下降，且二者共同作用效果更佳．邱爽等[22]發(fā)現(xiàn)細(xì)菌素bifidocinA可有效減緩雞肉持水力的下降速率，在貯藏期第28 d，添加細(xì)菌素bifidocin A的持水力均為70%，而對(duì)照組的持水力低于68%，此研究結(jié)果與本研究結(jié)果相似．

3 結(jié)論

本文通過測(cè)定雞肉中細(xì)菌菌落總數(shù)、pH、TVB-N、持水力等指標(biāo)，驗(yàn)證了植物乳桿菌XCT1-1細(xì)菌素粗提物和阿奇霉素對(duì)雞肉中耐藥性E．coli的抑制作用．結(jié)果表明，在4 ℃貯藏過程中，經(jīng)細(xì)菌素粗提物單獨(dú)處理或其與阿奇霉素共同處理感染耐阿奇霉素的E．coli雞肉，可有效抑制雞肉中E．coli以及其他細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖，有效減緩雞肉的pH值、TVB-N值、持水力值的上升，且植物乳桿菌XCT1-1細(xì)菌素粗提物和阿奇霉素共同處理組抑菌效果更好，可延長(zhǎng)細(xì)菌菌落總數(shù)超標(biāo)時(shí)長(zhǎng)至少4 d．植物乳桿菌XCT1-1粗提物可以作為生物抗菌劑用于雞肉及類似產(chǎn)品的冷藏保鮮中，具有良好的應(yīng)用前景．