姚珂心 王瑞博 劉靜 白雪 齊睿 劉勝男 李永華 張開(kāi)明

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，鄭州，450002)

許多觀賞園藝作物的葉片會(huì)在逆境下形成從綠至紅、紫等各種顏色(著名的“秋季紅葉”景觀[1])，這主要?dú)w功于植物體內(nèi)一種黃酮類(lèi)物質(zhì)——花色素苷。植物在遭受多種環(huán)境脅迫(包括低溫、高光、旱澇、營(yíng)養(yǎng)缺乏等)時(shí)，應(yīng)激合成花色素苷?；ㄉ剀粘顺噬?，其在植物體內(nèi)的另一個(gè)顯著功能是強(qiáng)抗氧化能力；已有研究表明，植物體內(nèi)合成花色素苷后，不僅觀賞價(jià)值大大增加，對(duì)低溫、高光等多種逆境的抗性也顯著增強(qiáng)[2]。花色素苷的生物合成是多種花色素苷合成基因共同表達(dá)的結(jié)果，其合成途徑上的結(jié)構(gòu)基因分為——早期生物合成基因(PAL、C4H、4CL、CHS、CHI、F3H、F3′H等)，它們編碼相應(yīng)的花色素苷合成酶催化生成肉桂酸、4-香豆酸、4-香豆酰CoA、4,2′,4′,6′-四羥查爾酮、黃烷酮、二氫黃酮醇、二氫槲皮素等；晚期生物合成基因(DFR、LAR、ANS、ANR、UFGT等)，其對(duì)應(yīng)的酶類(lèi)催化生成無(wú)色花色素和各類(lèi)花色素苷(如矢車(chē)菊類(lèi)花色素苷、天竺葵類(lèi)花色素苷、飛燕草類(lèi)花色素苷)[3]。GST為花色素苷轉(zhuǎn)運(yùn)基因，可與花青素結(jié)合形成谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶-類(lèi)黃酮復(fù)合體，促進(jìn)類(lèi)黃酮物質(zhì)的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)或囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)[4]。

四季秋海棠(Begoniasemperflorens)是秋海棠科(Begoniaceae)秋海棠屬(Begonia)的觀賞花卉，為多年生常綠草本，因葉形獨(dú)特、葉色翠綠、四季開(kāi)花不斷，而廣泛用于花壇、花鏡、盆花、吊盆等，在園林綠化和裝飾中有著獨(dú)特的應(yīng)用價(jià)值。四季秋海棠葉片在低溫、高光等環(huán)境脅迫時(shí)，葉片也會(huì)變紅，變紅后的葉片含有大量的花色素苷，對(duì)四季秋海棠觀賞價(jià)值有重要影響。為此，本研究以四季秋海棠為研究對(duì)象，選擇狀態(tài)良好、長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗，進(jìn)行低溫脅迫處理；通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)測(cè)定花色素苷合成相關(guān)結(jié)構(gòu)基因和轉(zhuǎn)運(yùn)基因低溫時(shí)的表達(dá)量；采用高效液相色譜分析法和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS-MS)相結(jié)合的方法，分析低溫處理對(duì)四季秋海棠葉片花色素苷組分的影響；探索低溫時(shí)四季秋海棠葉片花色素苷合成結(jié)構(gòu)基因表達(dá)量與花色素苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)之間的關(guān)系。旨在為選育高抗性和高觀賞性的四季秋海棠提供參考。

1 材料和方法

將四季秋海棠綠葉紅花“超級(jí)奧林匹克”的種子播種于基質(zhì)(V(泥炭土)∶V(蛭石)∶V(珍珠巖)=3∶1∶1)中后，放置于培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)(條件：白天25 ℃、10 h，夜晚15 ℃、14 h，光照300 μmol·m-2·s-1，相對(duì)濕度保持為85%左右)，待株高長(zhǎng)至10 cm左右時(shí)，選取狀態(tài)良好、長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗用于低溫脅迫處理。低溫處理?xiàng)l件，溫度為白天15 ℃、夜晚5 ℃，其他條件與培養(yǎng)時(shí)條件保持一致。分別在0、1、3、6、9、24、48、96、144、264 h采集葉片樣品(選擇第2～3片展開(kāi)的健康嫩葉)，用于后續(xù)試驗(yàn)。

采用改良的十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法[5]從混合四季秋海棠葉片樣本中提取總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara)反轉(zhuǎn)錄得到cDNA第一條鏈。

用引物設(shè)計(jì)軟件(Primer 3)在線設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)的基因特異性引物(見(jiàn)表1)，送華大公司合成。

表1 四季秋海棠葉片花色素苷合成基因和內(nèi)參基因的qRT-PCR擴(kuò)增引物序列

實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試劑盒(TB Green?Premix Ex TaqTMII(Tli RNaseH Plus)RR820A)購(gòu)自Takara公司，具體操作按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。反應(yīng)體系：10 μL甲苯胺藍(lán)綠色預(yù)混液(TB Green Premix Ex Taq Ⅱ(Tli RNaseH Plus)，2X)；1 μL正向引物(10 μmol/L)，1 μL反向引物(10 μmol/L)；0.4 μL 6-羧基-X-羅丹明參比染料(ROX Reference Dye Ⅱ(50X))；1 μL cDNA；6.6 μL雙蒸水(ddH2O)；總體系20 μL。擴(kuò)增程序：50 ℃反應(yīng)2 min；95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火34 s，40個(gè)循環(huán)。內(nèi)參基因選用Bs18S(基因登陸號(hào)No.KJ959633)。

四季秋海棠葉片花色素苷組分鑒定的樣品制備：將經(jīng)過(guò)液氮處理的葉片放入2 mL離心管中，在研磨儀中，在45 Hz條件下用4 min將葉片研磨至粉末狀；在離心管中放入0.1 g粉末，取1 mL鹽酸體積分?jǐn)?shù)為10%的鹽酸甲醇溶液進(jìn)行溶解，黑暗4 ℃條件下過(guò)夜提取，黑暗期間渦旋3次；第二天在9 360 r/min條件下離心10 min，取上清液后用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾后放入進(jìn)樣瓶中，-20 ℃條件下保存。

色譜分析柱：C18色譜柱(250×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相A為體積分?jǐn)?shù)為5%的甲酸水溶液，流動(dòng)相B為甲醇溶液；柱溫35 ℃；流速為0.8 mL/min；進(jìn)樣量為20 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)為520 nm；洗脫梯度見(jiàn)表2。

表2 高效液相色譜檢測(cè)流動(dòng)相洗脫梯度

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫處理對(duì)四季秋海棠葉片表型的影響

由圖1可見(jiàn)：低溫處理初期，葉片還處于綠色狀態(tài)，未發(fā)生明顯變化；在處理24 h時(shí)，發(fā)現(xiàn)有一兩片葉子開(kāi)始泛黃；處理48 h時(shí)，大部分葉子有變黃的趨勢(shì)；處理96 h時(shí)，已有1/4左右的葉片發(fā)紅，葉片有變紅的趨勢(shì)；處理144 h時(shí)，有1/2左右的葉片變紅；直到處理264 h時(shí)，葉片幾乎全變紅。

圖1 四季秋海棠葉片低溫處理時(shí)的表型

2.2 低溫處理對(duì)四季秋海棠葉片花色素苷結(jié)構(gòu)基因及相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)基因BsGST表達(dá)量的影響

為了研究低溫處理過(guò)程中，花色素苷相關(guān)結(jié)構(gòu)基因在不同處理時(shí)長(zhǎng)的表達(dá)量的變化，對(duì)各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的樣品進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試驗(yàn)(見(jiàn)表3、表4)。在未低溫處理(處理時(shí)間為0)時(shí)，各個(gè)基因的表達(dá)量幾乎都在1左右。經(jīng)過(guò)低溫處理后，各基因表達(dá)水平都發(fā)生了顯著變化，且在處理后期表達(dá)量都明顯上調(diào)?；ㄉ剀蘸铣缮嫌位駼sC4H、Bs4CL、BsCHI、BsF3H表達(dá)量都在9 h顯著表達(dá)，而且在264 h基因表達(dá)量都出現(xiàn)最大值，其中BsCHI基因的最大表達(dá)量約是未低溫處理(處理時(shí)間為0)時(shí)的38倍。BsPAL基因在6 h時(shí)已顯著表達(dá)，而B(niǎo)sCHS基因在48 h時(shí)才顯著表達(dá)，兩者也分別在264 h時(shí)達(dá)到最大表達(dá)量?；ㄉ剀蘸铣上掠位駼sLAR、BsANR、BsANS都在6 h時(shí)表達(dá)量顯著增加，在264 h時(shí)表達(dá)量達(dá)到最大值，其中BsANS基因的最大表達(dá)量是未低溫處理(處理時(shí)間為0)的63倍左右。BsDFR基因從處理開(kāi)始表達(dá)量一直呈上升趨勢(shì)，直至處理結(jié)束時(shí)表達(dá)量達(dá)到最大。BsF3′H基因在9、48、264 h時(shí)的表達(dá)水平都非常顯著，其中在48 h時(shí)的表達(dá)量最大，約是未低溫處理(處理時(shí)間為0)的20倍。BsUFGT基因在時(shí)表達(dá)3 h量出現(xiàn)顯著變化，在48 h時(shí)表達(dá)量出現(xiàn)最大值，其余時(shí)間表達(dá)量都無(wú)顯著變化。

表3 低溫處理持續(xù)過(guò)程中葉片花色素苷合成上游結(jié)構(gòu)基因相對(duì)表達(dá)量

由表4可見(jiàn)：BsGST基因在3 h時(shí)開(kāi)始出現(xiàn)表達(dá)，在24 h后表達(dá)量顯著增加，在48 h時(shí)表達(dá)量達(dá)到未低溫處理(處理時(shí)間為0))時(shí)的22倍左右，之后又顯著下降，在96 h后表達(dá)量持續(xù)增加；在264 h時(shí)達(dá)到最大值，約為未低溫處理(處理時(shí)間為0)的56倍。

2.3 低溫處理對(duì)四季秋海棠葉片花色素苷組分的影響

2.3.1低溫處理264 h后四季秋海棠葉片花色素苷組分構(gòu)成

用高效液相色譜將低溫處理264 h的四季秋海棠葉片花色素苷分離后，先后共出現(xiàn)4個(gè)有效峰(見(jiàn)圖2)。發(fā)現(xiàn)混合標(biāo)準(zhǔn)品中矢車(chē)菊素-3-O-半乳糖苷出峰時(shí)間為10.71 min、矢車(chē)菊素-3-O-葡萄糖苷出峰時(shí)間為10.83 min，分別與樣品的1號(hào)峰(出峰時(shí)間為10.72 min)和2號(hào)峰(出峰時(shí)間為10.84 min)出峰時(shí)間相對(duì)應(yīng)；由此推斷，四季秋海棠葉片1號(hào)峰和2號(hào)峰物質(zhì)，分別為矢車(chē)菊素-3-O半乳糖苷、矢車(chē)菊素-3-O-葡萄糖苷。

表4 低溫處理持續(xù)過(guò)程中葉片花色素苷合成下游結(jié)構(gòu)基因和轉(zhuǎn)運(yùn)基因(BsGST)相對(duì)表達(dá)量

A為低溫處理264h后四季秋海棠葉片樣品；B為矢車(chē)菊素-3-O-半乳糖苷、矢車(chē)菊素-3-O-葡萄糖苷混合標(biāo)準(zhǔn)品。

由圖3可見(jiàn)：10.61～10.95 min峰，子離子碎片質(zhì)荷比(m/z)為286.6，與矢車(chē)菊素苷元相對(duì)應(yīng)；由母離子質(zhì)荷比448.7可知，丟失的碎片離子質(zhì)荷比(m/z)為162，與葡萄糖基或半乳糖基相吻合；推測(cè)，此峰為矢車(chē)菊素-3-O-葡萄糖苷或矢車(chē)菊素-3-O-半乳糖苷，結(jié)合前面高效液相色譜試驗(yàn)結(jié)果，再次印證1號(hào)峰為矢車(chē)菊素-3-O-半乳糖苷、2號(hào)峰為矢車(chē)菊素-3-O-葡萄糖苷。同樣的分析方法，10.12～10.38 min峰與天竺葵素苷元相符合，進(jìn)而推測(cè)3號(hào)峰為為天竺葵素-3-O-葡萄糖苷；12.22～12.47 min峰與飛燕草素苷元相符合，進(jìn)一步判斷4號(hào)峰為飛燕草素-3-O-半乳糖苷。

(a)為質(zhì)譜多反應(yīng)檢測(cè)(MRM)，出峰時(shí)間為10.12～10.38 min，母離子質(zhì)荷比為432.5；(b)為質(zhì)譜多反應(yīng)檢測(cè)，出峰時(shí)間為10.61～10.95 min，母離子質(zhì)荷比為448.7；(c)為質(zhì)譜多反應(yīng)檢測(cè)，出峰時(shí)間為12.22～12.47 min，母離子質(zhì)荷比為465.2。

2.3.2低溫處理對(duì)四季秋海棠葉片花色素苷組分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

采用分析對(duì)比得到的最佳色譜條件對(duì)低溫處理0、3、6、9、24、48、96、144、264 h時(shí)間點(diǎn)的提取樣品，進(jìn)行高效液相色譜檢測(cè)。將液相色譜面積代入標(biāo)準(zhǔn)方程中，得到不同時(shí)間花色素苷各組分在提取液中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(見(jiàn)表5)。

表5 不同低溫處理時(shí)四季秋海棠葉片花色素苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)

應(yīng)用高效液相色譜對(duì)不同低溫處理時(shí)的四季秋海棠葉片花色素苷組分質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明，隨著低溫處理時(shí)間的延長(zhǎng)，花色素苷總質(zhì)量分?jǐn)?shù)明顯增加，其中低溫處理24 h時(shí)出現(xiàn)顯著增加，低溫處理264 h時(shí)花色素苷總質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到最大值，這與四季秋海棠葉片表型變化結(jié)果相一致。在花色素苷各組分中，矢車(chē)菊素-3-O-半乳糖苷、矢車(chē)菊素-3-O-葡萄糖苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加較明顯，而其他組分無(wú)顯著變化。在低溫處理的初期，矢車(chē)菊素-3-O-半乳糖苷、矢車(chē)菊素-3-O-葡萄糖苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別是總花色素苷的40%左右。矢車(chē)菊素-3-O-半乳糖苷在低溫處理96 h時(shí)質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著增加，超過(guò)了總花色素苷的50%；而矢車(chē)菊素-3-O-葡萄糖苷在低溫處理144 h時(shí)，質(zhì)量分?jǐn)?shù)才顯著增加。低溫處理結(jié)束時(shí)，與矢車(chē)菊素-3-O-葡萄糖苷相比，矢車(chē)菊素-3-O-半乳糖苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著增加，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為低溫處理前的16倍，占總花色素苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)的70%以上。在低溫處理全過(guò)程中，矢車(chē)菊素-3-O-半乳糖苷的增加速率和最終質(zhì)量分?jǐn)?shù)(12.23 mg·kg-1)，都高于矢車(chē)菊素-3-O-葡萄糖苷。由此可知，低溫脅迫主要促進(jìn)矢車(chē)菊素-3-O-半乳糖苷的大量合成，因此推測(cè)，低溫脅迫時(shí)矢車(chē)菊素-3-O-半乳糖苷是導(dǎo)致四季秋海棠葉片變紅的主要物質(zhì)。

3 結(jié)論與討論

本研究結(jié)果表明，低溫花色素苷合成途徑中，早期合成基因BsPAL、BsCHS、BsCHI、BsF3H、BsF3′H，幾乎都是在低溫處理6、9 h出現(xiàn)顯著表達(dá)；后期合成基因BsDFR、BsANS、BsUFGT和轉(zhuǎn)運(yùn)基因BsGST，則都是在低溫處理48、96 h才顯著表達(dá)；且基本上在低溫處理結(jié)束時(shí)，表達(dá)量達(dá)最大值。此外，花色素苷主要成分矢車(chē)菊素-3-O-半乳糖苷、矢車(chē)菊素-3-O-葡萄糖苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，分別在低溫處理96、144 h時(shí)開(kāi)始顯著積累，在低溫處理264 h時(shí)質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高。這與低溫處理的四季秋海棠葉片，在24 h時(shí)有葉子開(kāi)始泛黃、96 h時(shí)已有葉片發(fā)紅、264 h時(shí)葉片幾乎全變紅的結(jié)果相對(duì)應(yīng)。

低溫處理時(shí)，四季秋海棠葉片花色素苷合成結(jié)構(gòu)基因、轉(zhuǎn)運(yùn)基因相對(duì)表達(dá)量顯著升高，進(jìn)而使花色素苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)明顯增加，其中花色素苷組分矢車(chē)菊素-3-O-半乳糖苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)、質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加速率最高，最終導(dǎo)致四季秋海棠葉片逐漸變紅。本研究結(jié)果表明，四季秋海棠葉片花色素苷的組成成分包括：矢車(chē)菊素-3-O-半乳糖苷、矢車(chē)菊素-3-O-葡萄糖苷、天竺葵素-3-O-葡萄糖苷、飛燕草素-3-O-半乳糖苷；其中矢車(chē)菊素-3-O-半乳糖苷是導(dǎo)致四季秋海棠葉片變紅的主要成分。

本研究表明，秋季低溫增強(qiáng)了四季秋海棠花色素苷合成途徑的相關(guān)酶和運(yùn)輸花色素苷的谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶(GSTs)，最終導(dǎo)致在葉片和莖部積累了大量的花色素苷。已有研究表明，低溫時(shí)，花色素苷的合成與碳水化合物的積累和活性氧(ROS)的產(chǎn)生有關(guān)。低溫通過(guò)限制碳源利用和減少庫(kù)的容量，而對(duì)碳水化合物的代謝有較大的影響[6]。例如：低溫時(shí)，四季秋海棠的葉脈和莖的韌皮部顯著積累大量的胼胝質(zhì)，而胼胝質(zhì)的積累能夠阻斷碳水化合物的運(yùn)輸，使消耗降低，隨之葉片和莖部的碳水化合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著增加，最終促進(jìn)花色素苷的合成[1]。所以，一般都認(rèn)為碳水化合物的積累是低溫誘導(dǎo)花色素苷發(fā)生的原因。已有研究表明，多種環(huán)境脅迫均會(huì)使植物產(chǎn)生活性氧，而活性氧也被證明與多種逆境下的花色素苷合成相關(guān)[7]，由BsRbohD基因產(chǎn)生的活性氧參與了低溫誘導(dǎo)四季秋海棠葉片花色素苷的合成[8]。而過(guò)氧化氫(H2O2)作為活性氧的一種，也是低溫誘導(dǎo)花色素苷合成過(guò)程的一個(gè)重要信號(hào)分子[9]，適度環(huán)境脅迫產(chǎn)生的過(guò)氧化氫也能夠誘導(dǎo)花色素苷的合成[10]。在擬南芥(Arabidopsisthaliana)中，過(guò)氧化氫通過(guò)上調(diào)花色素苷的晚期合成基因(TT3、TT18)和轉(zhuǎn)錄因子(PAP1、TT8、MYB113、MYB114)的表達(dá)，促進(jìn)花色素苷的積累[11]。

影響花色素苷合成的除了結(jié)構(gòu)基因外，還有調(diào)控基因，主要包括MYB、bHLH、WD40三大類(lèi)，它們通過(guò)調(diào)控結(jié)構(gòu)基因，進(jìn)而影響花色素苷的合成。在低溫時(shí)，MdbHLH3因磷酸化而增加與結(jié)構(gòu)基因啟動(dòng)子的結(jié)合，促進(jìn)了花色素苷的合成[12]。在擬南芥中，R2R3-MYB與bHLH、WD40構(gòu)成MYB-bHLH-WD40(MBW)轉(zhuǎn)錄復(fù)合物，激活花色素苷晚期合成基因(DFR、ANS、UFGT)的表達(dá)，進(jìn)而使植物體內(nèi)花色素苷積累[13]。本研究表明，低溫處理后，使得前期四季秋海棠葉片花色素苷結(jié)構(gòu)基因上調(diào)表達(dá)，從而導(dǎo)致后期花色素苷的大量積累，最終導(dǎo)致其葉片變紅，這其中也一定有相關(guān)調(diào)控基因的參與，還需接下來(lái)深入研究。

已有研究表明，秋海棠花中的花色素主要為矢車(chē)菊素[14]，秋海棠科植物葉片花色素苷中50%以上屬于矢車(chē)菊素類(lèi)花色素苷[15]。本研究表明，正常條件時(shí)，四季秋海棠葉片中的矢車(chē)菊素類(lèi)花色素苷占花色素苷的85%左右。因此推測(cè)，低溫時(shí)，四季秋海棠葉片大量合成矢車(chē)菊素類(lèi)花色素苷，可能是因?yàn)榍锖Ｌ目浦参镆子谛纬墒杠?chē)菊素。已有研究表明，自然界中的三類(lèi)花色素苷(花葵素苷、花青素苷、翠雀素苷)分別為磚紅色、紅色、藍(lán)色。矢車(chē)菊素與糖苷結(jié)合后屬花青素苷，顏色上主要對(duì)應(yīng)紅色，其根據(jù)結(jié)合糖苷的不同可分為矢車(chē)菊素-3-O-半乳糖苷、矢車(chē)菊素-3-O-葡萄糖苷等。其中矢車(chē)菊素-3-O-半乳糖苷已被證實(shí)在很多物種主要花色素苷中占比較高，例如：紅皮梨主要花色素苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高的是矢車(chē)菊素-3-O-半乳糖苷[16]。王甜元等[17]研究表明，套袋蘋(píng)果梨(PyrusbretschneideriRehd.‘Pingguoli’)解袋后，矢車(chē)菊素-3-O-半乳糖苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高約占總質(zhì)量分?jǐn)?shù)的90%，而矢車(chē)菊素-3-O-葡萄糖苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)較少。肖長(zhǎng)城等[18]研究表明，紅梨果皮中花色素苷的主要成分為矢車(chē)菊素-3-O-半乳糖苷、矢車(chē)菊素-3-O-葡萄糖苷，其中矢車(chē)菊素-3-O-半乳糖苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，約占總花色素苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)的66.37%。李永洲等[19]則研究表明，紅瓤核桃葉片在生長(zhǎng)初期最重要的兩種花青苷，是飛燕草-3-O-半乳糖苷、矢車(chē)菊素-3-O-半乳糖苷。

本研究中，四季秋海棠低溫脅迫后，矢車(chē)菊素-3-O-半乳糖苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)、質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加速率，都高于矢車(chē)菊素-3-O-葡萄糖苷，這與平衡狀態(tài)下呋喃糖構(gòu)型和吡喃糖構(gòu)型比例以及蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加有關(guān)。已有研究表明，半乳糖苷和葡萄糖苷為差向異構(gòu)體[20]，兩者在水溶液的平衡組成上存在明顯差異，葡萄糖苷中幾乎沒(méi)有呋喃構(gòu)型，而半乳糖苷中約有7%的呋喃構(gòu)型。呋喃構(gòu)型中含有較大的集團(tuán)—CH(OH)CH2OH為五元環(huán)，比吡喃構(gòu)型環(huán)張力大，構(gòu)型能量相對(duì)較高，因此含有半乳糖苷的化合物比葡萄糖苷化合物具有更強(qiáng)的穩(wěn)定性[21]。此外，已有研究表明，低溫時(shí)，四季秋海棠葉片中碳水化合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)以蔗糖增加最為明顯[6]。而在蘋(píng)果著色期，與矢車(chē)菊素-3-O-葡萄糖苷相比，矢車(chē)菊素-3-O-半乳糖苷與蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)存在更加顯著的正相關(guān)性[22]。