茶新有 李嘉哲 楊建坤 殷緣 張榮沭

(東北林業(yè)大學，哈爾濱，150040)

熱激轉錄因子(Hsfs)是熱脅迫下可以激活熱基因表達的一類轉錄調節(jié)基因，是高等植物轉錄水平上熱脅迫響應基因的中心調控因子，在植物熱脅迫信號轉導和耐熱性的生產過程中起著重要的作用[1]。Hsf結構一般包括4個部分：N端DNA結合域(DNA bindingdomain，DBD)、寡聚化結構域(OD或HR-A/B)、核定位信號(NLS)和核輸出信號(NES)。此外，少數(shù)Hsf還有1個最不保守的從C端激活域(CTD)。DBD結合于靶基因上游啟動子區(qū)域的保守熱激元件(GAAnnTTC)并募集其他轉錄因子形成寡聚體激活靶基因的表達[2]。在植物體內HSF最早是在番茄(Solanumlycopersicum)中克隆到[3]。隨著全基因組的測序和研究的進一步完善，在水稻(OryzasativaL.)和擬南芥(Arabidopsisthaliana)等模式植物中克隆到了相應的轉錄因子基因。近些年來，植物Hsfs功能的研究主要集中在其響應逆境脅迫上，發(fā)現(xiàn)Hsfs基因在植物中不僅通過自身表達來抵抗逆境脅迫，而且能通過結合其互作蛋白或調控下游基因的表達來參與植物對逆境脅迫的抵抗，如參與調控冷、熱、重金屬、高鹽等脅迫相關基因的表達來提高植物的抗逆性[4-5]。Hsf通過與基因啟動子區(qū)域內保守的熱激元件(HSE)序列的相互作用來調節(jié)基因表達，以實現(xiàn)植物對非生物脅迫的應激響應。

楊樹(Populus)是木本植物研究的模式種[6-7]。山新楊(Populusdavidiana×P.albavar.Pyramidalis)是以山楊為母本、新疆楊為父本雜交得到的優(yōu)良樹種。山新楊具有樹冠狹窄，樹干通直，葉形優(yōu)美，生長快、抗逆性較強等特點，是我國北方首選的最耐寒的園林綠化和防護用的樹種。由于品質優(yōu)良，很受人們重視。迄今為止，山新楊熱激轉綠因的生物信息學分析、組織表達模式和生物脅迫應答的相關研究未見報道。本研究團隊已建立良好的山新楊遺傳轉化體系[8-9]?；跇嫿ǖ纳叫聴钆c植物益生菌棘孢木霉和致病菌鏈格孢菌互作的轉錄組數(shù)據(jù)庫，獲得一條特異表達基因Potri.014G141400.1的cDNA全長序列，該基因含有典型的HSF-DNA-binding功能域。在Genbank數(shù)據(jù)庫進行BLASTx比對，與已命名的銀白楊HSF基因一致性最高，將其命名為PdPapHSF-A4b。在這基礎上擬對該基因進行生物信息學分析。利用RT-qPCR(Real-time Quantitative polymerase chain reaction)技術揭示PdPapHSF-A4b在莖尖、葉、莖和根中的表達模式，以此基礎上進一步研究山新楊根部進行鹽、堿和高滲透壓脅迫、接種5種植物土傳病害病原菌或植物激素誘導48 h后，PdPapHSF-A4b的不同組織表達變化，為進一步揭示該基因的調控功能和進行山新楊基因工程育種獲得高抗山新楊新品種提供依據(jù)，具有重要的研究意義。

1 材料與方法

供試植物為山新楊組培苗，由本實驗室保存。繼代培養(yǎng)基：WPM(木本植物培養(yǎng)基)+NAA 0.1 mg/L+6-BA 0.5 mg/L；生根培養(yǎng)基為：WPM+IBA 0.4 mg/L。在人工氣候箱培養(yǎng)和完成各種處理。

供試微生物：核盤菌NECC20005(SclerotiniasclerotiorumNECC20005)、立枯絲核菌NECC20006(RhizoctoniasolaniNECC20006)、尖孢鐮刀菌NECC20007(FusariumoxysporumNECC20007)、金黃殼囊孢菌C29(CytosporachrysospermaC29)、鏈格孢菌NECCFP002(AlternariaalternateNECCFP002)。

1.1 PdPapHSF-A4b基因的PCR擴增及測序

基于本實驗室構建的山新楊與棘孢木霉菌和鏈格孢菌互作的轉錄組數(shù)據(jù)庫(北京，百邁客公司)[10]，采用Gang et al.[11]的方法進行有參轉錄組差異基因表達分析。經篩選獲得特異表達基因Potri.004G109200.1的cDNA全長序列。依據(jù)此序列信息，利用Primer Premier 6.0軟件設計克隆該基因的全長引物(表1)，采用CTAB裂解法提取山新楊葉片總RNA。并用反轉錄試劑盒(PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser,TaKaRa)合成cDNA。以cDNA為模板，TaKaRa Primer STAR?Max DNA Polymerase為反應試劑，使用表1中“HSF_A4bF”和“HSF_A4bR”引物進行RT-PCR擴增，條件為：98 ℃預變性3 min，98 ℃ 10 s，60 ℃ 8 s，72 ℃ 5 s，共35個循環(huán)；72 ℃延伸2 min。將擴增片段進行純化并按照說明書將其連接到pMD18-T載體上，送交哈爾濱市擎科嘉美生物科技有限公司進行測序。

表1 PCR引物序列

1.2 PdPapHSF-A4b基因的生物信息學分析

利用NCBI數(shù)據(jù)庫的ORFFinder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)分析PdPapHSF-A4b的開放讀框長度；利用NCBI的BLASTx程序(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)比對獲得PdPapHSF-A4b同源蛋白序列；運用PsortII prediction(http://psort.hgc.jp/form2.html)進行亞細胞定位預測；利用TMHMM Server v.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)預測PdPapHSF-A4b蛋白跨膜結構域；利用ExPASy網站中ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)分析PdPapHSF-A4b的氨基酸組分及理化性質；利用Prot Scale(http://web.expasy.org/protscale/)進行PdPapHSF-A4b蛋白疏水性分析；利用MEME軟件(https://meme-suite.org/meme/)對PdPapHSF-A4b同源序列進行結構域預測；利用NCBI的Conserve Domains(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)預測蛋白保守區(qū)；應用SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)在線預測PdPapHSF-A4b蛋白的三級結構，并用Mega6.0軟件采用鄰接法(Neighbor-Joining，NJ)構建進化樹(Bootstrap=1000)。

1.3 PdPapHSF-A4b基因在組織中的差異表達量

將40 d的山新楊組培苗接到生根液體培養(yǎng)基的玻璃試管中培養(yǎng)15 d，培養(yǎng)條件為23 ℃，相對濕度75%，16 h光照/8 h黑暗。

分別取組培生根苗莖尖(頂芽未展開葉及莖(S))、幼莖即帶第1和第2完全展開葉片的兩個節(jié)間(J1)、木質化的莖即莖中部的兩個節(jié)間(J2)、發(fā)育中的莖即莖最下面兩個節(jié)間(J3)、嫩葉即J1上的兩片葉(L1)、成熟葉即莖中部的兩個節(jié)間為S2、S2上的兩片葉(L2)、相對老的葉片即J3的兩片葉(L3)、根(R)等8個部位的樣品，進行磨樣并提取總RNA，分析PdPapHSF-A4b基因在不同組織中的差異表達量。

1.4 PdPapHSF-A4b基因在非生物、生物脅迫及激素誘導下組織表達量

無菌條件下將6周齡山新楊組培苗(不定根長度在10～20 cm)分別置于含有NaCl(200 mmol/L)、Na2CO3溶液(pH=10)和含有聚乙二醇6000(PEG6000)30%的液體WPM培養(yǎng)基中，進行鹽、堿和高滲透壓3種非生物脅迫試驗。處理48 h后，分別收集莖尖(S)、成熟葉(L2)和根部(R)樣品。

無菌條件下將活化后的5種植物土傳致病真菌接種到PDA培養(yǎng)基中，在26 ℃條件下培養(yǎng)10 d獲得大量分生孢子或菌絲體。細致刮取立枯絲核菌PDA培養(yǎng)基(1 cm×4 cm×3塊)上的菌絲溶于WPM液體培養(yǎng)基中制備菌絲體懸浮液。其他4種真菌用血球計數(shù)器計算分生孢子懸浮液體積，備用。再將6周齡組培苗的根部分別接種尖孢鐮刀菌、核盤菌、金黃殼囊孢菌和鏈格孢菌分生孢子，使其終體積為1×105CFU/mL，或接種已配制的立枯絲核菌的菌絲體。接種48 h后，分別收集莖尖(S)、成熟葉(L2)和根部(R)樣品。

無菌條件下將6周齡山新楊組培苗分別置于含有100 μmol/L ABA(脫落酸)、JA(茉莉酸)或SA(水楊酸)的液體WPM培養(yǎng)基中，處理48 h后，分別收集莖尖(S)、成熟葉(L2)和根部(R)樣品。

上述樣品以同齡非處理山新楊組培苗為對照，分別分析PdPapHSF-A4b基因在3種非生物脅迫、5種生物脅迫和3種激素誘導下的組織差異表達量。每個試驗組設3株苗，每處理3次重復。

1.5 RT-qPCR分析

收集的山新楊各個樣品采用CTAB法提取總RNA，使用反轉錄試劑盒(PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser，TaKaRa)參照說明書合成cDNA。以cDNA為模板，利用北京全式金生物公司(TransGen Biotech)的TransStart Top Green qPCR SuperMix酶和羅氏公司的熒光定量RT-qPCR儀器(LightCycler 96；Roche)進行熒光定量RT-qPCR反應。3個內參基因及其GenBank登錄號分別為：PdPapACT2(MN196665)、PdPapEF1-α(MN196666)和PdPapTub(MN196667)?；虻囊镄蛄幸姳?。實時定量qPCR的反應體系為：20 μL(2×Taq Master Mix 10 μL；10 μmol/L雙向引物各0.8 μL；模板2 μL；DEPC處理水6.4 μL)。為了確保試驗結果的重現(xiàn)性，對3個生物學重復的樣品進行了3個技術重復。反應程序為95 ℃ 10 min，94 ℃ 5 s，59 ℃ 15 s進行45個循環(huán)，72 ℃ 10 s。熔解曲線按照95 ℃ 10 s，65 ℃ 60 s，97 ℃ 1 s進行。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用2-ΔCt方法[12]對無誘導條件下山新楊PdPapHSF-A4b基因在不同組織部位的組成型表達和不同誘導條件下不同組織部位的表達進行計算，Ct代表每個反應管內的熒光信號達到設定域值時所經歷的循環(huán)數(shù)，該方法計算所得的結果為PdPapHSF-A4b基因相對于3個內參基因的平均表達水平的相對表達量。使用Microsoft Office Excel 2010軟件包和SPSS25統(tǒng)計軟件包對測量數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計、作圖和分析。對同一時間點的試驗組之間的差異顯著性進行ANOVA分析，在P<0.05下比較差異性。

2 結果與分析

2.1 PdPapHSF-A4b基因序列分析

山新楊PdPapHSF-A4b基因測序結果獲得1 359 bp的片段(圖1a)。其ORF的起始密碼子在第1個氨基酸處，終止密碼子位于第452個氨基酸處，編碼451個氨基酸。HSF-A4b結構保守域(smart00415)含有31個氨基酸(編碼序列在12～104 bp處)，含有典型的HSF-DNA-binding域(圖1b)。

(a)核酸和對應氨基酸序列；(b)預測的保守域。

PdPapHSF-A4b編碼蛋白的分子式為C2261H3480N647O717S19，分子質量為51 808 u，理論等電點為5.44，脂肪系數(shù)61.06，不穩(wěn)定系數(shù)61.63(不穩(wěn)定系數(shù)>40為不穩(wěn)定蛋白)，預測為不穩(wěn)定蛋白。不具有跨膜結構，亞細胞定位預測分析表明其在細胞核、細胞質中的分布情況分別占65.2%，21.7%。由此可以初步推測PdPapHSF-A4b在核內發(fā)揮作用。

2.2 PdPapHSF-A4b蛋白結構特性分析

在Genbank數(shù)據(jù)庫中利用BLASTx進行序列搜索，獲得8條(來源于4個楊樹品種、1個柳樹品種)與PdPapHSF-A4b一致性最高的同源基因編碼氨基酸序列(總分值>792；序列覆蓋率>75%；E值=0；統(tǒng)一性>84.73%)。MEME在線分析結果顯示：這8條蛋白序列均具有位置靠近C端高度保守的3個基序(圖2a)其中第2個基序與第3個基序距離很近。

對PdPapHSF-A4b基因編碼蛋白的二級結構預測結果表明，基因編碼的蛋白質由α-螺旋、延伸鏈、β-轉角和無規(guī)則卷曲構成，其中α-螺旋占比39.82%；延伸鏈占比5.09%；β-轉角占比2.88%，無規(guī)則卷曲占比52.21%。其中，無規(guī)則卷曲結構占比最高。對PdPapHSF-A4b蛋白的三級結構預測結果可見(圖2c)，共比對上50個模板，在模型GMQE值最大為0.13的條件下，該蛋白與模型5d5u.1.B的一致性較高，為51.52%；覆蓋值為0.22，范圍在第10～105個氨基酸處，此模型為人類Hsf1與HSE DNA的晶體結構蛋白。

進化樹分析結果顯示(圖2d)：可分為兩大組。第I組包括PdPapHSF、銀白楊(Populusalba)XP_034905225、小葉楊(Populussimonii)AKV56389.1、胡楊(Populuseuphratica)XP_011033721.1、毛果楊(Populustrichocarpa)XP_002321069.1、毛果楊(Populustrichocarpa)PNT04784.1；第Ⅱ組包括小墊柳(Salixbrachista)KAB5527533.1、銀白楊XP_034905226.1和毛果楊XP_024441462.1。其中，銀白楊(XP_034905225)HSF基因與山新楊HSF基因親緣關系最近。

(a)PdPapHSF-A4b蛋白結構域及高度保守基序；(b)三級結構模板；(c)三級結構預測；(d)系統(tǒng)進化樹。

2.3 山新楊PdPapHSF-A4b在莖尖、莖、葉和根組織中的表達

基因表達量分析發(fā)現(xiàn)，山新楊PdPapHSF-A4b在莖尖、莖、葉和根中均有表達(表2)。其在成熟葉中的表達量最高，分別是嫩葉的1.36倍和相對老的葉片的3.17倍(P<0.05)；在莖組織的表達量由大到小為木質化的莖、發(fā)育中的莖、幼莖，木質化的莖分別是發(fā)育中莖的1.33和幼莖的4倍。根中的組織表達量是莖尖的2.5倍。

表2 山新楊PdPapHSF-A4b在不同組織中的表達量

2.4 脅迫處理對PdPapHSF-A4b的組織表達變化

在莖尖部位，鹽脅迫和高滲透壓脅迫使PdPapHSF-A4b顯著上調為對照的2.16和1.83倍(P<0.05)，而堿脅迫下顯著下調表達(P<0.05)。在成熟葉中，PdPapHSF-A4b的表達量僅在堿脅迫下顯著上調表達(P<0.05)，而在鹽脅迫和高滲透壓脅迫下顯著下調為對照的5.29和3.10倍(P<0.05)；在根組織中，3種脅迫條件下PdPapHSF-A4b表達量均為上調，分別為對照的18.25、12.00、3.75倍(表3)。

表3 非生物脅迫下PdPapHSF-A4b在莖尖、葉和根中的表達量

山新楊組培苗根部接種5種植物土傳致病真菌48 h后，PdPapHSF-A4b的表達量與對照相比均顯著上調(P<0.05)，分別是對照的1.82、38.00、1.48、11.04和3.26倍(表4)。

在莖尖組織中，PdPapHSF-A4b的表達量與對照相比顯著上調(P<0.05)，分別是對照的7.80、2.10、2.05和3.10倍。僅有接種金黃殼囊孢菌48 h時，PdPapHSF-A4b的表達量與對照相比均顯著下調，是對照的2.63倍(表4)。

在成熟葉中，PdPapHSF-A4b的表達量與對照相比均顯著下調(P<0.05)，分別是對照的1.06、3.75、3.10和2.12倍。

在3種植物激素誘導48 h后，山新楊PdPapHSF-A4b基因的組織表達量發(fā)生不同的變化。只有葉部位的PdPapHSF-A4b基因表達量下調至對照的0.5倍，而頂尖和根中PdPapHSF-A4b基因表達量均顯著上調至對照的1.04和1.69倍。

受JA誘導48 h，只有根部位的PdPapHSF-A4b基因表達量上調至對照的4.58倍，而莖尖和葉部位中PdPapHSF-A4b基因表達量均顯著下調至對照的1.11和3.72倍(P<0.05)。而受ABA誘導48 h，莖尖、葉和根中的PdPapHSF-A4b基因受ABA誘導均顯著上調表達，分別是對照的4.48、3.41和9.96倍(P<0.05)(表5)。

表5 激素處理下PdPapHSF-A4b在莖尖、葉和根中的差異表達

3 討論與結論

植物熱激轉錄因子(Hsf)作為網絡調控中一類重要的調節(jié)因子，能夠響應多種生物和非生物脅迫，并賦予植物多種脅迫抗性[13]。目前，對植物Hsfs基因的抗逆功能研究主要集中在擬南芥、水稻、番茄、玉米(Zeamays)等草本植物上[14]，對木本植物的研究很少。木本植物在生長發(fā)育、生理及形態(tài)結構等諸多方面與草本植物不同，其抗逆機理與草本植物也會有所區(qū)別。因此，在山新楊中克隆PdPapHSF-A4b新基因并研究其組織表達特異性和在多種逆境脅迫下的調控規(guī)律具有創(chuàng)新性。

采用PCR技術克隆到山新楊PdPapHSF-A4b基因序列，此序列含有1 359個核酸?；蚓幋a451個氨基酸，在N端含有1個最保守的DNA結構域(DBD)，由3個螺旋結構(H1，H2，H3)和4個反相平行的β折疊(β1、β2、β3、β4)[15]。DBD結構是植物HSF的DNA結合活性必需的區(qū)域結構，能夠特異識別并結合到DNA中的順式作用元件[16]。生物信息學分析認為PdPapHSF-A4b為非跨膜親水性蛋白，預測主要位于細胞核中。同源基因進化樹分析表明該基因與銀白楊(XP_034905225)親緣關系最近。

以山新楊6周齡組培苗為材料，采用qRT-PCR研究PdPapHSF-A4b的空間表達特性分析，發(fā)現(xiàn)其在莖尖、葉、莖和根中均有表達，并且PdPapHSF-A4b的表達模式從幼嫩到老化的組織表達量逐漸升高，在成熟葉中的表達量最高，為幼嫩莖的10.28倍。說明PdPapHSF-A4b隨山新楊發(fā)育梯度而表達提升，其生物功能可能僅在成熟葉組織中特異性發(fā)揮。植物在生長發(fā)育過程中會遇到各種非生物脅迫，例如干旱、高鹽堿、極端溫度等。此時，植物常常通過調節(jié)自身基因的表達來響應非生物逆境的脅迫[15-20]。本研究發(fā)現(xiàn)山新楊dPapHSF-A4b受到鹽、堿和高滲透壓脅迫，在根組織中的轉錄水平均受誘導而上調，說明dPapHSF-A4b可能是楊樹響應和抵御脅迫過程中一個重要的蛋白，并且具有正向調控抗鹽、堿和高滲透壓脅迫的能力。有研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥中HSFA1與HSFA2也能增強植株苗期對鹽脅迫的抵抗能力[21]。植物在受到非生物脅迫下，激活的Hsfs能夠識別并結合熱激元件HSE(GAAnnTTC)，激活下游HSP基因，從而提高植物的抗逆性[22]。綜合比較發(fā)現(xiàn)，PdPapHSF-A4b的表達在3種非生物脅迫下均有改變，特別是鹽脅迫下，該基因表達變化明顯，表明其可能參與了鹽脅迫應答。

鏈格孢菌、尖孢鐮刀菌、核盤菌、立枯絲核菌和金黃殼囊孢菌為常見的5種土傳植物病害致病菌，在同一環(huán)境條件下，有可能引起植物不同程度發(fā)生莖腐、莖基腐、根腐、花腐病、菌核病、褐斑病、葉枯病等多種病害癥狀，并且寄主較廣。本研究發(fā)現(xiàn)，山新楊根際接種不同致病真菌后，不同組織部位中PdPapHSF-A4b的響應不同。在莖尖部位，尖孢鐮刀菌、立枯絲核菌和細鏈格孢菌使其顯著上調表達，在成熟葉中，只有根部接種立枯絲核菌時，其顯著上調表達，說明植物根系侵染病原菌48 h，莖尖和成熟葉中細胞壁的降解相對較少?？赡芨扛腥镜募怄哏牭毒鷮顦涿绲娜~片會產生影響，PdPapHSF-A4b表達量上調可能與降解葉中細胞壁被分解而產生的寡聚糖相關[23]。在根中，接種鏈格孢菌、尖孢鐮刀菌、核盤菌、立枯絲核菌和金黃殼囊孢菌，PdPapHSF-A4b的表達量均顯著上調，其中，接種尖孢鐮刀菌顯著上調最高。由于尖孢鐮刀菌是營半活體病原，其他致病菌是完全營腐生病原，而PdPapHSF-A4b被具有營活體營養(yǎng)的病原直接接觸誘導表達提升最劇烈，故推測PdPapHSF-A4b可能是直接響應這類病原的一個重要基因。

植物遭受逆境脅迫后，體內的激素會發(fā)生一系列的變化來適應環(huán)境。水楊酸、茉莉酸和脫落酸是重要的植物激素，在植物響應非生物脅迫(如干旱，低溫等)中起著重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)PdPapHSF-A4b受脫落酸誘導各組織的表達量均顯著上調；受茉莉酸和脫落酸誘導葉部位的表達量均下調，根部的表達量均上調。有研究表明，小麥(Triticumaestivum)、水稻和擬南芥中的Hsfs受脫落酸的誘導顯著上調表達[24-26]，這些基因參與了脫落酸信號途徑介導的抗逆反應。因此，研究探索PdPapHSF-A4b對脫落酸、水楊酸和茉莉酸等激素調控對非生物脅迫的響應，為闡述山新楊響應非生物脅迫的分子機理提供初步的依據(jù)。

綜合上述，本研究表明了山新楊PdPapHSF-A4b對基因組織表達模式隨楊樹發(fā)育梯度而表達提升，其生物功能可能僅在成熟葉組織中特異性發(fā)揮。PdPapHSF-A4b是特異性地響應鹽、堿和高滲透壓脅迫的重要蛋白。PdPapHSF-A4b能對根部5種致病真菌侵染產生不同程度的應答，尤其是對尖孢鐮刀菌侵染表達高度上調，說明PdPapHSF-A4b可能是直接響應具有營活體營養(yǎng)的病原的一個重要基因，并且可能在對內生真菌的識別和響應中也扮演重要角色。因此，推測PdPapHSF-A4b參與了植物激素水楊酸、茉莉酸和脫落酸誘導的信號途徑。本研究結果將為進一步揭示PdPapHSF-A4b基因的功能和通過分子植物育種構建高抗速生楊樹品種提供依據(jù)。