‘赤霞珠’與‘西拉’雜交群體內(nèi)種子單寧的遺傳趨勢(shì)分析

劉敖一，孫琪，董志剛，劉鎮(zhèn)海，段長(zhǎng)青，潘秋紅

（1. 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部葡萄酒加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100083；2. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)果樹研究所/山西省葡萄與葡萄酒工程技術(shù)研究中心，山西太谷 030031）

葡萄酒的質(zhì)量很大程度上取決于葡萄果實(shí)的質(zhì)量，葡萄果實(shí)的風(fēng)味物質(zhì)指紋與品種、氣候、土壤和栽培等因素密切相關(guān)[1]。縮合單寧（Condensed tannins）又稱原花色素（Proanthocyanidins），由黃烷-3-醇單體聚合而成，是構(gòu)成紅葡萄酒口感和風(fēng)味的特征成分之一，在葡萄酒中具有沉淀蛋白、提高結(jié)構(gòu)感、穩(wěn)定色素、抗氧化、抗自由基和抗菌等作用[2]。黃烷-3-醇類物質(zhì)的抗氧化能力受到其結(jié)構(gòu)的影響。類黃酮的C6-C3-C6骨架結(jié)構(gòu)分別對(duì)應(yīng)A-C-B環(huán)，其中B環(huán)發(fā)揮著重要作用，C環(huán)起次要作用，而A環(huán)的抗氧化能力最弱，并且不同羥基所在位置不同，清除自由基的能力也會(huì)不同[3]，隨酚羥基數(shù)目增多，結(jié)合蛋白的能力逐漸增加。因此，開展優(yōu)良釀酒葡萄新品種的選育，篩選出含高質(zhì)量黃烷-3-醇類物質(zhì)的釀酒葡萄品種具有重要的實(shí)際意義。

一般認(rèn)為，單寧的溶解度隨聚合度的增大而降低。丙酮水溶液是目前使用最普遍的提取溶劑，根據(jù)單寧在丙酮中的溶解度，可將它們分成可溶性單寧和非可溶性單寧[4]。非可溶性單寧代表了聚合度較高的單寧，根據(jù)目前的研究可知，從梨中提取的mDP值為28的高聚合度單寧仍能被浸漬至模擬酒體中[5]，并且高聚合度的單寧容易與唾液蛋白結(jié)合增加口腔的摩擦而提供澀感[6]；可溶性單寧代表了聚合度較低的單寧（mDP＜8），容易進(jìn)入酒體中[7]，主要提供了苦味。葡萄酒的澀感強(qiáng)度和苦味與單寧含量呈強(qiáng)正相關(guān)[8-9]，在低聚合度情況下，隨單寧的聚合度增加葡萄酒的澀感強(qiáng)度增大，而酒中苦味的最大強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間下降[10]。因此，研究葡萄中可溶性單寧和非可溶性單寧，有助于指導(dǎo)葡萄和葡萄酒的生產(chǎn)以及品質(zhì)的控制。

單寧主要存在于葡萄的果皮、種子和果梗中，其中種子中的單寧含量最高。盡管在葡萄酒釀造過程中，種子單寧的浸出率只有6%，而果皮中單寧的浸出率為大約30%，但種子中的單寧仍是葡萄酒中單寧的主要來源，是貢獻(xiàn)葡萄酒感官品質(zhì)、陳釀潛力和抗氧化性的重要指標(biāo)之一[11]。已有研究初步表明，釀酒葡萄單寧為多基因控制的遺傳性狀[11]，并且種子單寧的遺傳符合數(shù)量遺傳特征[12]。在釀酒葡萄雜交F1代中，不同部位的單寧有不同的遺傳趨向，其中果皮單寧趨向于低親遺傳，而果肉單寧趨向于高親遺傳[13]。但以往關(guān)于單寧含量測(cè)定，主要采用Folin-Ciocalteu法，其結(jié)果并不能反映可溶性單寧和非可溶性單寧的含量。本文以歐亞種釀酒葡萄品種‘赤霞珠’和‘西拉’及其雜交F1代的種子為試材，分析可溶性單寧和非可溶性單寧在群體內(nèi)的含量分布，探究其遺傳趨勢(shì)，為以改善種子單寧為目標(biāo)的葡萄育種提供依據(jù)，同時(shí)篩選目標(biāo)優(yōu)株，為單寧縮合機(jī)理的理論研究提供材料。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

釀酒葡萄‘赤霞珠’和‘西拉’雜交群體的親本和F1代的種子采自山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所，該群體于2013年雜交，2018年大量結(jié)果。本研究所用的子代均是通過多重測(cè)序方法檢驗(yàn)，證實(shí)為真實(shí)雜交子代，于2019年8—9月，從90株結(jié)果的雜交子代中，逐株采集可溶性固形物含量21%左右的果實(shí)，每株采集40～50粒，共90份?？扇苄怨绦挝锊捎脭?shù)字手持糖量計(jì)（PAL-1，Atago，Japan）測(cè)定。采集后立即用液氮速凍，低溫速運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室，置于﹣80 ℃超低溫冰箱中備用。葡萄果實(shí)破碎后取種子，在液氮下研磨成粉末，用于可溶性和非可溶性單寧的提取和測(cè)定。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 可溶性單寧的提取與測(cè)定

基本上參照Yu等[14]進(jìn)行，稍作修改。

取100 mg種子樣品粉末于2 mL離心管中，向樣品中加入1 mL單寧提取緩沖液（70 %丙酮，0.1 %乙酸，Vol），在冰水中超聲30 min，4 ℃下12000 r·min-1離心10 min，取上清，沉淀按照上述步驟再提取兩次，合并3次上清液，即為可溶性單寧的粗提液。沉淀用于非可溶性單寧的測(cè)定。

將上清液與等體積氯仿混合充分，4 ℃下4054 r·min-1離心5 min，棄下層有機(jī)相，重復(fù)3次；接著，在上層溶液中加入等體積正己烷，渦旋混合，4 ℃下9730 r·min-1離心5 min，保留下層溶液，重復(fù)3次。對(duì)所得下層溶液氮吹，直至液面基本不變，液氮速凍，置于﹣20 ℃下冷凍干燥后，用600 μL 50%色譜級(jí)50%（Vol）甲醇/水溶液復(fù)溶，即得到可溶性單寧提取液。每個(gè)樣品提取3份，分別用于以下測(cè)定。

取2 μL各樣品可溶性單寧提取液以及各2 μL的0、0.75、1、1.5、3 mg·mL-1(-)-表兒茶素標(biāo)準(zhǔn)溶液于96板各孔中，隨后向各孔中加入100 μL 4-二甲基氨基肉桂醛（4-dimethyl-amino-cinnamaldehyde，DMACA）反應(yīng)液（0.2%DMACA（w/v）溶于1∶1甲醇/3N鹽酸）。將96孔板放入Spectramax190酶標(biāo)儀（美國(guó)Molecular Devices）中，室溫下輕輕震蕩5 min后，在640 nm下測(cè)量各孔的吸光值。種子可溶性單寧含量用(-)-表兒茶素濃度對(duì)吸光值制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量，單位為mg·g-1。

1.2.2 非可溶性單寧的提取與測(cè)定

將上述提取單寧時(shí)得到的沉淀凍干，向干燥粉末中加入500 μL丁醇/濃鹽酸（95∶5，Vol）溶液，渦旋震蕩使沉淀重懸，置于冰水混合物超聲處理30 min，4 ℃下12000 r·min-1離心10 min，取上清液，即得到非可溶性單寧提取液。

將非可溶性單寧提取液以及終濃度分別為0、0.05、0.1、0.15、0.2、0.4 mg·mL-1單寧二聚體PB1 [(-)-表兒茶素-(4β→8)-(+)-兒茶素] 標(biāo)準(zhǔn)品的丁醇鹽酸溶液，分別加入到離心管中，共同在95 ℃下孵育1 h。冷卻到室溫后，用丁醇濃鹽酸將樣品稀釋5倍，取各樣品100 μL依次加入到96孔板中，在550 nm下測(cè)量各個(gè)樣品孔的吸光值，非可溶性單寧的含量用PB1的濃度對(duì)相應(yīng)吸光值繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行半定量，單位為mg·g-1。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)分析主要采用EXCEL、SPSS 20軟件分析，繪圖軟件為Origin 2018。在遺傳趨勢(shì)分析中廣義遺傳力（the broad sense heritability，H2）、變異系數(shù)（variation coefficient，CV）、超中優(yōu)勢(shì)率（ratio of middle advantage rate，H）、超高親率（ratio of higher than high parent, HH）及超低親率（ratio of lower than low parent, LL）結(jié)果計(jì)算方法[15-17]如下所列：

式中：S為標(biāo)準(zhǔn)差，M為后代性狀平均值

式中：M為后代性狀平均值，P—為親中值

式中：VP為表現(xiàn)型方差，VE為環(huán)境方差

式中：VE為環(huán)境方差，VP1為母本的表型方差，VP2為父本的表型方差。

式中：nhp為子代群體中表型值超過高親的個(gè)數(shù)；nlp為子代群體中表型值超過高親的個(gè)數(shù)，n為群體個(gè)數(shù)。

式中：Ta為遺傳傳遞力，M為后代性狀平均值，P—為親中值

2 結(jié)果與分析

2.1 親本及其子代種子可溶性和非可溶性單寧含量分布

親本及雜交子代的種子可溶性及非可溶性單寧含量如圖1。兩親本中，‘赤霞珠’總單寧含量為69.99 mg·g-1，其中可溶性單寧的含量為65.47 mg·g-1， 非可溶性單寧含量為4.52 mg·g-1；‘西拉’總單寧含量為57.37 mg·g-1，包括53.52 mg·g-1的可溶性單寧和3.85 mg·g-1非可溶性單寧。雜交子代總單寧的含量范圍在41.15～80.63 mg·g-1，變化較大且近似連續(xù)變化，符合數(shù)量遺傳的特征。因此，在子代總單寧含量接近的情況下，可溶性單寧與非可溶性單寧的比例存在較大差異。

圖1 ‘赤霞珠’與‘西拉’雜交群體種子可溶性與非可溶性單寧含量Figure 1 Contents of soluble and insoluble tannins in the seeds of hybrid population of 'Cabernet Sauvignon' and 'Syrah'

如圖2（A～D）頻數(shù)分布圖所示，對(duì)雜交群體的可溶性單寧、非可溶性單寧、總單寧含量及非可溶性單寧在總單寧中的占比進(jìn)行了分析，進(jìn)一步探究子代中單寧的組成，其中非可溶性單寧在總單寧中的占比可以反映單寧向不可溶性單寧轉(zhuǎn)變的趨勢(shì)。

由圖2可知，F(xiàn)1代果實(shí)采收期時(shí)，種子可溶性單寧含量主要在40.00～58.00 mg·g-1，占所有F1代種子的65.56%；非可溶性單寧含量分布在3.00～8.00 mg·g-1，占所有F1代種子的73.33%；單寧總含量主要集中在45.00～60.00 mg·g-1，占所有種子的61.11%；非可溶性單寧含量占總單寧的百分比主要分布在6.00%～14.00%，占所有F1代種子的73.33%?！嘞贾椤c‘西拉’雜交群體種子單寧含量相關(guān)的性狀基本符合正態(tài)分布，說明雜交群體內(nèi)可溶性和非可溶性單寧含量性狀符合數(shù)量遺傳的特征。

圖2 ‘赤霞珠’與‘西拉’雜交群體種子各狀態(tài)單寧及其非可溶性單寧占比分布圖Figure 2 Frequency distribution of contents of soluble Tannins (A), insoluble Tannins (B) and total Tannins (C) as well as percentage of insoluble Tannins in total Tannins (D) in the seeds of hybrid population of 'Cabernet Sauvignon' and 'Syrah'

2.2 可溶性和非可溶性單寧的遺傳趨勢(shì)分析

根據(jù)‘赤霞珠’和‘西拉’親本及其F1代的非可溶性單寧、可溶性單寧、總單寧含量、非可溶單寧占總單寧百分比，進(jìn)行遺傳特征分析，結(jié)果如表1所示。

表1 ‘赤霞珠’與‘西拉’雜交群體F1代種子單寧的遺傳指標(biāo)Table 1 Genetic parameters of seed tannins in the seeds of F1 hybrid population of 'Cabernet Sauvignon' and 'Syrah'

由表1可知，‘赤霞珠’與‘西拉’雜交F1代種子的可溶性單寧和總單寧含量超低親比率分別為65.56%和64.44%，遺傳傳遞力分別為84.41%和88.36%，偏向低值遺傳。而種子的非可溶性單寧含量和非可溶性單寧占總單寧比例均高于親本平均值，并且超高親比率分別達(dá)到63.33%和81.11%，遺傳傳遞力分別達(dá)到144.54%和169.00%，偏向高值遺傳。子代可溶性單寧含量、非可溶性單寧含量和非可溶性單寧占比的變異系數(shù)分別為20.13%、38.97%和44.42%，說明在雜交群體中這3個(gè)性狀都有較大的選擇潛力。上述4個(gè)單寧指標(biāo)性狀的廣義遺傳力均很高，在84.94%～95.41%之間，說明釀酒葡萄雜交子代的種子單寧含量的變異中主要是遺傳效應(yīng)起作用，環(huán)境的影響很小。

2.3 子代中種子非可溶性單寧的極端最高及最低含量

從圖1中分別篩選出‘赤霞珠’與‘西拉’雜交F1代中種子非可溶性單寧含量最高的3個(gè)子代H1、H2和H3，最低的3個(gè)子代L1、L2和L3。非可溶性單寧含量范圍在2.94～2.63 mg·g-1，平均值為2.79 mg·g-1；非可溶性單寧含量最高的3個(gè)子代的含量范圍在13.03～11.13 mg·g-1，平均值為11.84 mg·g-1，是最低的4.24倍。利用單因素分析檢驗(yàn)，這6個(gè)株系之間總縮合單寧含量在0.05的水平上沒有顯著性差異。從非可溶性單寧的占比，可以清楚地看到，高低子代的占比相差5.00～4.00倍（圖3），表明非可溶性縮合單寧含量高的子代具有更強(qiáng)的縮合單寧聚合能力。

圖3 雜交子代中非可溶性單寧含量最高和最低的占比Figure 3 The highest and lowest percentages of insoluble tannin in the hybrid progeny

3 討論

在葡萄育種中，雜交育種是葡萄品種改良的常用方法，能有效提高葡萄品質(zhì)、抗性和產(chǎn)量等[18]。對(duì)于葡萄酒而言，單寧含量直接影響葡萄酒的口感，因此，控制釀酒原料中單寧含量對(duì)提升葡萄酒的品質(zhì)有重要意義[19]。單寧分為水解單寧和縮合單寧，水解單寧對(duì)葡萄酒澀感和苦感的影響遠(yuǎn)小于縮合單寧[2]。已有報(bào)道采用乙醇提取葡萄種子縮合單寧，F(xiàn)olin-Ciocalteu法測(cè)定總單寧含量，發(fā)現(xiàn)‘黑比諾’與‘馬瑟蘭’雜交F1代種子的單寧含量表現(xiàn)出超高親遺傳的特征，說明可以通過雜交手段篩選出單寧含量高的品種[22]。在本研究中，利用單寧在丙酮-水溶液中的溶解性，將高聚合度和低聚合度的單寧區(qū)分開，研究種子可溶性和非可溶性單寧的遺傳傾向，發(fā)現(xiàn)可溶性與非可溶性單寧都具有較高的遺傳力，可以穩(wěn)定遺傳，這與前人的研究結(jié)果相似[20]。但從本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，可溶性單寧偏向于低值遺傳，而非可溶性單寧傾向于高值遺傳，表明可以通過雜交育種手段使葡萄種子中可溶性單寧逐漸減少，而非可溶性單寧增加。

由于一定聚合度的單寧對(duì)葡萄酒有更多的正面作用，因此在育種中可以篩選出有較高單寧聚合能力強(qiáng)的個(gè)體。在本研究中通過檢測(cè)高聚合度單寧含量的個(gè)體差異，篩選出擁有更強(qiáng)的單寧聚合能力的個(gè)體。這些個(gè)體不僅可以為釀酒葡萄單寧聚合能力的相關(guān)研究提供實(shí)驗(yàn)材料，也可以在實(shí)際生產(chǎn)中推廣應(yīng)用。

本研究?jī)H對(duì)‘赤霞珠’與‘西拉’兩個(gè)釀酒葡萄品種雜交得到的F1代個(gè)體的種子縮合單寧的遺傳特征進(jìn)行了初步分析，具體的遺傳機(jī)制和規(guī)律尚待進(jìn)一步的研究探索。