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      閩北烏龍茶寡肽的活性研究

      2022-07-26 01:00:16劉慧王小娟王弛謝勇趙峰
      茶葉學(xué)報(bào) 2022年2期
      關(guān)鍵詞:寡肽粗提物烏龍茶

      劉慧,王小娟,王弛,謝勇,趙峰*

      (1. 福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,福建 福州 350122;2. 閩江師范高等??茖W(xué)校,福建 福州 350109;3. 福建省中藥資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福建 福州 350122)

      茶葉歷史悠久,可追溯至三千年以前,我國(guó)諸多本草典籍[1,2]中均可見關(guān)于“茶可治病”的記載。目前,眾多學(xué)者對(duì)于茶葉的研究多聚焦于茶葉的功效成分及其作用機(jī)理,尤其是茶多酚、氨基酸、茶多糖等功效成分[3,4],諸如茶葉寡肽活性研究報(bào)道尚處于起步階段。寡肽,是一種由2~10個(gè)氨基酸分子通過酰胺鍵連接而成的小分子量蛋白質(zhì)[5],近年來相關(guān)報(bào)道顯示其具有獨(dú)特的呈味作用和生物活性,茶葉中寡肽的活性表達(dá)值得進(jìn)一步探究。烏龍茶是中國(guó)六大茶類之一,茶性適中,傳統(tǒng)上認(rèn)為其可“潤(rùn)膚益肺、生津潤(rùn)喉、清除余熱”[6]。現(xiàn)代藥理學(xué)證實(shí),烏龍茶富含茶多酚、茶氨基酸等多種生物學(xué)活性成分,具有降血脂、抗突變、抑制肥胖、抗癌等[7-12]作用。相較于茶氨基酸,寡肽吸收速率快[13],且具有降血糖、降血脂、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗過敏等[14-22]活性。因此,本研究以閩北烏龍茶為原料制得寡肽粗提物,進(jìn)一步采用膜分離方式制得500~1500 Da分子量段寡肽,并初步探究了其相關(guān)生物學(xué)活性的表達(dá),以期為活性寡肽序列篩選和茶葉活性表達(dá)機(jī)制研究指明方向。

      1 材料與方法

      1.1 試驗(yàn)材料

      閩北烏龍茶,購(gòu)自耀東方茶葉有限公司,產(chǎn)地為武夷山。

      1.2 試劑與儀器設(shè)備

      主要試劑:正戊烷,丙酮,二氯甲烷,乙酸甲酯,乙酸乙酯,乙酸丁酯,α-葡萄糖苷酶,對(duì)硝基苯-α-D-吡喃葡糖苷(pNP-G),pH 6.8的0.1 M磷酸緩沖液,pH 6.3的0.1 M磷酸緩沖液,牛黃膽酸鈉,甘氨膽酸鈉,膽酸鈉,胰酶,2-氮雜(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS),過硫酸鉀,DPPH(1,1-二苯基-2-苦肼基),無水乙醇,鹽酸,濃硫酸均為分析純(上海麥克林生化科技有限公司)。

      主要儀器設(shè)備:分液漏斗和400Y粉碎機(jī)(永康市鉑歐五金制品有限公司);KQ-500E超聲清洗機(jī)(昆山市超聲儀器公司);JM-B5003電子天平(諸暨市超澤衡器設(shè)備有限公司);FlowMem0021-HP三聯(lián)高壓平板膜分離設(shè)備(廈門福美科技有限公司);HH-6S恒溫水浴鍋(上海拓赫機(jī)電科技有限公司);Infinite M200 Pro酶標(biāo)儀和PHS-3E pH計(jì)(上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司);ZXDP-B2050恒溫培養(yǎng)箱(上海智誠(chéng)分析儀器制造有限公司);ZWY-240恒溫震蕩培養(yǎng)箱(上海智誠(chéng)分析儀器制造有限公司)。

      1.3 試驗(yàn)方法

      1.3.1 烏龍茶寡肽制備及殘留檢測(cè)

      粗制:參考SALGER M[23]方法并改進(jìn),稱取100.0 g粉碎茶葉,分5次加入共計(jì)1500 mL正戊烷(300 mL/次,浸提15 min/次),以脫除脂溶性成分;過濾后,再加分5次加入共計(jì)1500 mL丙酮∶水(V/V=7∶3)(300 mL/次,室溫條件下超聲提取,10 min/次),過濾,合并濾液;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮,去除丙酮,剩余水相轉(zhuǎn)移至分液漏斗;依次以二氯甲烷、乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸正丁酯進(jìn)行液液萃取,每種溶劑萃取5次,每次200 mL;萃取后的水相再次旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后,凍干,得粗提物。

      分段:取適量所得粗提物加2.0 L水溶解,使用三聯(lián)高壓平板膜,依次經(jīng)過1500 Da和500 Da超濾膜,保留500~1500 Da區(qū)間段,濃縮并凍干(凍干條件:-40℃預(yù)凍12 h,4 h升溫至40℃,40℃干燥12 h),得“烏龍茶寡肽”,-80℃保存。

      茶多酚、咖啡堿、氨基酸和總糖殘留量:稱取10 mg粗提物,以水溶解定容至100 mL,分別按照GB/T 8313-2018《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測(cè)方法》、GB/T 8312-2013《茶 咖啡堿測(cè)定》、GB/T 8314-2013《茶 游離氨基酸總量的測(cè)定》和DNS[24]比色法檢測(cè)。

      1.3.2 烏龍茶寡肽生物活性評(píng)價(jià)

      (1)降血糖:α-葡萄糖苷酶抑制活性

      參照 Hailong Zhang[25]和 Qianfei Huang[25,26]的方法。分別取50 μL α-葡萄糖苷酶溶液(1.0 U·mL-1)與50 μL不同濃度的寡肽粗提物水溶液(62.5、125、250、500、1000 μg·mL-1)在 96 孔板中震蕩使混勻,37℃下放置10 min后,加50 μL底物(5.0 mM pNP-G)溶液,繼續(xù)置于37℃下反應(yīng)20 min,立即加100 μL 0.1 M Na2CO3使酶失活,終止反應(yīng),405 nm下測(cè)定吸光值。具體操作方式見表1。

      表1 α-葡萄糖苷酶抑制反應(yīng)試劑添加量Table 1 Addition amount of α-glucosidase inhibition reagent (單位:μL)

      每次試驗(yàn)三組平行,以樣品濃度的自然對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo),抑制率為縱坐標(biāo),建立線性方程,計(jì)算半數(shù)抑制濃度(IC50)。

      公式如下:

      α-葡萄糖苷酶抑制率(%)=[1-(實(shí)驗(yàn)組-空白組)/(酶對(duì)照組-空白對(duì)照組)]×100%

      (2)降血脂:膽酸鹽法

      參照李井雷[27]等人的方法。膽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線:取不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液(膽酸鈉25.0、37.5、50.0、62.5、75.0 μg·mL-1,甘氨膽酸鈉 25.0、37.5、50.0、62.5、75.0 μg·mL-1,?;悄懰徕c25.0、37.5、50.0、62.5、75.0 μg·mL-1)2 mL于具塞試管中,加入6 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)60%的H2SO4,于70℃水浴20 min,后冰浴5 min,在387 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以膽酸鹽含量為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo)繪得膽酸鹽含量標(biāo)準(zhǔn)曲線。

      實(shí)驗(yàn)組:取3mL 1 mg·mL-1寡肽溶液,加入1 mL 0.01 M鹽酸,3 mL胃蛋白酶溶液,37℃恒溫振蕩1 h后,用0.1M NaOH調(diào)pH至6.3,加入4 mL胰蛋白酶,37℃恒溫振蕩1 h后,再依次加入4 mL 0.3 mmol·L-1膽酸鈉、?;悄懰徕c、甘氨膽酸鈉溶液,37℃恒溫振蕩1 h,4000 r·min-1離心20 min,取上清液2 mL,加入6 mL 60% H2SO4于70℃水浴中反應(yīng)20 min后,取出冰浴5 min,387 nm處檢測(cè)吸光度。

      空白組:3 mL PBS代替樣品溶液,重復(fù)以上步驟。

      各組做三個(gè)平行,通過膽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線求得膽酸鹽剩余含量。

      公式如下:

      膽酸鹽結(jié)合率(%)=[(膽酸鹽加入量-膽酸鹽剩余量)/膽酸鹽加入量]×100%

      (3)抗氧化:DPPH法

      參照鄭景茹[28]等人的檢測(cè)方法。DPPH自由基清除能力測(cè)定:配制1 mg·mL-1寡肽溶液,稀釋成62.5、125、250、500、1000 μg·mL-1的樣品溶液;室溫下,向96孔板的每個(gè)孔中依次加入100 μL寡肽溶液、100 μL乙醇、及100 μL DPPH溶液(237 μg·mL-1),充分混勻,避光30 min,于515 nm處測(cè)吸光度(A);100 μL超純水代替樣液,作為空白對(duì)照(A空),每組做三個(gè)平行,谷胱甘肽標(biāo)準(zhǔn)品作為陽(yáng)性對(duì)照。

      DPPH自由基清除率(%)=[(A空-A)/A空]×100%

      1.4 數(shù)據(jù)處理

      采用office excel和IBM SPSS Statistics 22.0對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析,利用回歸分析,建立樣品濃度的自然對(duì)數(shù)值——抑制率的回歸曲線,計(jì)算IC50;使用最小顯著性差異分析法(LSD)和Games-Howell法對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析,比較實(shí)驗(yàn)結(jié)果的顯著性差異。

      2 結(jié)果與分析

      2.1 烏龍茶寡肽得率和純度

      以烏龍茶為原料,經(jīng)過脫脂、提取、液液萃取過程,得到烏龍茶寡肽粗提物1.74 g,即得率為1.74%;粗提物經(jīng)超濾過程,截取得到500~1500 Da肽段0.272 g,得率為0.27%。

      茶葉中已知的主要功能性成分包括茶多酚、咖啡因、多糖類、氨基酸等,通過對(duì)茶葉寡肽粗提物中的成分進(jìn)行理化檢測(cè),其中總糖殘余量<1.0%,茶多酚殘余量<0.1%,未檢測(cè)出咖啡因、氨基酸。結(jié)合相關(guān)報(bào)道[23],截取得到的500~1500 Da分子量段物質(zhì)主要為烏龍茶寡肽。

      2.2 烏龍茶寡肽生物活性

      2.2.1 烏龍茶寡肽降血糖效果

      烏龍茶寡肽的降血糖效果如圖1所示,該寡肽在其測(cè)試濃度范圍內(nèi)均對(duì)α-葡萄糖苷酶有抑制作用,并且抑制率與寡肽濃度呈正相關(guān)的量效關(guān)系,各濃度之間均存在顯著性差異。經(jīng)擬合計(jì)算,寡肽對(duì)α-葡萄糖苷酶的IC50為0.093 mg·mL-1。

      圖1 烏龍茶寡肽對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制效果Fig. 1 Inhibition effect of oolong tea oligopeptides on α-glucosidase

      2.2.2 烏龍茶寡肽降血脂效果

      以膽酸鈉、牛磺膽酸鈉、甘氨膽酸鈉三種膽酸鹽作為標(biāo)準(zhǔn)品,研究烏龍茶寡肽的降血脂效果。結(jié)果表明,膽酸鈉、?;悄懰徕c和甘氨膽酸鈉標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合方程分別為:y=0.0265x+0.0113,R2=0.994;y= 0.0203x+ 0.0063,R2= 0.993;y=0.0226x-0.0079,R2=0.9958,均符合試驗(yàn)要求(圖2)。1 mg寡肽可以結(jié)合(24.26±1.15)%膽酸鈉、(24.10±1.15)%?;悄懰徕c和(23.66±1.12)%甘氨膽酸鈉(圖3)。

      圖2 膽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 2 Standard curve of cholate

      圖3 烏龍茶寡肽對(duì)膽酸鹽的結(jié)合能力Fig. 3 Cholate binding ability of oolong tea oligopeptides

      2.2.3 烏龍茶寡肽抗氧化效果

      如圖4所示,谷胱甘肽和烏龍茶寡肽在其測(cè)試濃度范圍內(nèi)均可清除DPPH自由基。隨著寡肽濃度的增加,對(duì)DPPH自由基的清除率也相應(yīng)增加,至寡肽濃度劑量為0.7 mg·mL-1時(shí),DPPH自由基清除率最高。經(jīng)擬合計(jì)算,谷胱甘肽對(duì)DPPH自由基的IC50為0.099 mg·mL-1,烏龍茶寡肽對(duì)DPPH自由基的IC50為0.033 mg·mL-1,說明在同等濃度條件下,烏龍茶寡肽的抗氧化能力優(yōu)于谷胱甘肽。

      圖4 谷胱甘肽和烏龍茶寡肽對(duì)DPPH自由基清除能力Fig. 4 DPPH scavenging ability of glutathione and oolong tea oligopeptides

      3 討論與結(jié)論

      近年來,寡肽作為一種新型活性物質(zhì)被大眾熟知,主要采用酶解提取技術(shù)制得,工藝簡(jiǎn)單[14,29],即選擇合適的酶水解大分子蛋白質(zhì)得到寡肽。本研究借鑒可可豆肽的制備方法,利用寡肽的化學(xué)性質(zhì),采用丙酮水溶液直接提取茶葉中天然存在的寡肽,為茶葉中天然存在的寡肽的開發(fā)研究提供一定的理論基礎(chǔ)。茶葉富含茶多酚、茶多糖、茶色素、生物堿、氨基酸等多種生物活性成分,藥理作用表現(xiàn)在抗氧化、體重控制、防治心血管疾病、抗糖尿病等方面,本研究采用膜分離方式制得新型活性物質(zhì)——烏龍茶寡肽,并初步探索其生物學(xué)活性。

      糖尿病是由于胰島素缺失產(chǎn)生的代謝性疾病,并且仍是當(dāng)今研究中的重點(diǎn)。α-葡萄糖苷酶又稱為α-葡萄糖苷水解酶,可以促進(jìn)體內(nèi)葡萄糖的釋放,從而導(dǎo)致血糖含量升高,抑制α-葡萄糖苷酶活性表達(dá)可有效防止血糖升高,從而調(diào)節(jié)血糖水平。試驗(yàn)表明,烏龍茶寡肽可以抑制α-葡萄糖苷酶活性,并且隨著寡肽濃度的升高,且呈現(xiàn)濃度依賴效應(yīng),可以實(shí)現(xiàn)降血糖的效果,后續(xù)研究可進(jìn)一步從寡肽作用機(jī)制及具體活性結(jié)構(gòu)入手,開發(fā)相關(guān)的茶葉寡肽活性產(chǎn)品。

      另一方面,血脂水平與各類心血管疾病密切聯(lián)系。高血脂多發(fā)生在老年人群體,容易引發(fā)動(dòng)脈硬化,冠心病等癥狀。藥物通過結(jié)合膽酸鹽,阻止膽汁酸的重吸收,降低體內(nèi)膽汁酸含量,從而促進(jìn)膽固醇轉(zhuǎn)化為膽汁酸,進(jìn)而降低膽固醇水平。有研究表明[28],茶葉可以與膽酸鹽結(jié)合,達(dá)到降血脂的目的。本研究發(fā)現(xiàn),烏龍茶寡肽對(duì)膽酸鈉、甘氨膽酸鈉、牛黃膽酸鈉的結(jié)合能力為24%左右,作用效果較低,可能與反應(yīng)時(shí)間以及寡肽濃度存在一定的量化關(guān)系,后續(xù)需進(jìn)一步探討。

      目前關(guān)于茶葉抗氧化的體外實(shí)驗(yàn),主要有清除DPPH自由基、羥自由基、超氧陰離子,以及鐵離子還原能力等[30]。本研究檢測(cè)烏龍茶寡肽清除DPPH自由基的能力,其IC50為0.033 mg·mL-1,低于陽(yáng)性對(duì)照——抗氧化劑谷胱甘肽對(duì)DPPH自由基的IC50(0.099 mg·mL-1),表明寡肽的抗氧化能力優(yōu)于谷胱甘肽。

      綜上所述,本研究初步探究了閩北烏龍茶寡肽的生物學(xué)活性,結(jié)果發(fā)現(xiàn)其具有較強(qiáng)的抗氧化活性,且具備一定的降血糖和降血脂能力,后續(xù)可進(jìn)一步在寡肽氨基酸序列的基礎(chǔ)上進(jìn)行活性研究。

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