醋酸菌菌膜生產(chǎn)工藝條件優(yōu)化

張九裕，孫楠，張薇，樊明濤, 1b

醋酸菌菌膜生產(chǎn)工藝條件優(yōu)化

張九裕1a，孫楠2，張薇2，樊明濤1a, 1b

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué) a.生命科學(xué)學(xué)院 b.食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 咸陽(yáng) 712100；2.陜西師范大學(xué) 食品工程與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，西安 710119）

優(yōu)化用醋酸菌生產(chǎn)菌膜的最適培養(yǎng)條件和方法，以期獲得天然、安全的食品包裝用膜的生產(chǎn)工藝。以澀柿醋為原料，分離篩選出高產(chǎn)菌膜的優(yōu)良醋酸菌種，通過(guò)單因素和Plackett?Burman 等試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化醋酸菌菌膜最適培養(yǎng)方法和工藝條件。從澀柿醋中分離純化獲得產(chǎn)膜醋酸菌，經(jīng)鑒定為葡糖醋桿菌。用醋酸菌生產(chǎn)醋酸菌菌膜最優(yōu)培養(yǎng)條件：蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%、蛋白胨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.7%、酵母提取物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.2%、檸檬酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.15%、K2HPO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.16%、乙酸體積分?jǐn)?shù)為1%、無(wú)水乙醇體積分?jǐn)?shù)為2%，種齡為32 h，接種量為9%；培養(yǎng)5 d后，醋酸菌菌膜的平均產(chǎn)率為364.65 g/L，是優(yōu)化前的（246.03 g/L）的1.48倍。濕膜平均含水率為99.38%，復(fù)水率為71.09%～83.39%，菌膜干膜復(fù)水率高且復(fù)水速度快，復(fù)水1 min其含水率便可達(dá)到70%以上。醋酸菌用經(jīng)過(guò)優(yōu)化選擇的培養(yǎng)液和方法，可生產(chǎn)出高質(zhì)量的菌膜。

醋酸菌；菌膜；包裝；條件優(yōu)化

細(xì)菌纖維素（Bacterial cellulose）與一般的植物纖維素相比，具有純度高（由一個(gè)單糖單位組成的同聚多糖）、細(xì)膩、持水性高、復(fù)水性高以及濕態(tài)柔韌性強(qiáng)等優(yōu)良特性[1]。目前，細(xì)菌纖維素已在多個(gè)領(lǐng)域獲得商業(yè)化的應(yīng)用，如食品工業(yè)中用作增稠劑、成型劑、結(jié)合劑等[2]；在醫(yī)學(xué)上常用作傷口敷料，如作為人工皮膚治療燒傷；在其他方面，如聲音震動(dòng)薄膜、化妝品和生物材料方面也得到了較好的應(yīng)用。Jipa等[3]報(bào)道，使用含乳酸鏈球菌素的細(xì)菌纖維素來(lái)包裝frankfurter香腸，有效地控制了李斯特桿菌并減少了香腸表面的好氧型細(xì)菌總數(shù)。Xiao等[4]發(fā)現(xiàn)細(xì)菌纖維素與多聚乳酸的復(fù)合物具有更好的細(xì)菌纖維素透明度和生物適應(yīng)性，并且力學(xué)性能變得更好，該復(fù)合物更加適用于食品包裝。Hsiao等[5]發(fā)明了管狀細(xì)菌纖維素可直接應(yīng)用于素食食品包裝。雖然，細(xì)菌纖維素的理化性質(zhì)和柔韌性均優(yōu)于植物纖維素，在工業(yè)生產(chǎn)中有很廣泛的應(yīng)用前景，但由于細(xì)菌纖維素的合成過(guò)程非常復(fù)雜，產(chǎn)量不高，使它在工業(yè)中的應(yīng)用受到限制[6]。

醋酸菌菌膜（Acetic Acid Bacteria Pellicle，AP）是食醋生產(chǎn)過(guò)程或貯存中在醋液表面形成的一層凝膠狀薄膜，是醋酸菌發(fā)酵食醋時(shí)代謝的副產(chǎn)物，隨著醋液發(fā)酵或貯存時(shí)間的延長(zhǎng)而慢慢變厚增多[7-8]，該層薄膜實(shí)際就是由食醋中含有的醋桿菌屬微生物發(fā)酵形成的一種細(xì)菌纖維素薄膜。醋酸菌膜在陜西、山西等地常加工成“醋粉”，視其為地方名食。筆者發(fā)現(xiàn)，用澀柿和杏等水果生產(chǎn)食醋時(shí)，在醋液表面極易產(chǎn)生大量的菌膜。

用醋酸菌加工的食品包裝膜天然、安全、環(huán)保，生產(chǎn)這種包裝膜是食品包裝材料的發(fā)展趨勢(shì)，迄今未見(jiàn)更多的研究報(bào)道。文中以試驗(yàn)室自釀的澀柿醋為材料，從中分離篩選出產(chǎn)菌膜的優(yōu)勢(shì)菌株，通過(guò)試驗(yàn)對(duì)醋酸菌高產(chǎn)菌膜的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，以期通過(guò)微生物發(fā)酵，獲得可用于食品包裝的醋酸菌膜的生產(chǎn)技術(shù)和工藝參數(shù)，為包裝材料的生產(chǎn)和發(fā)展提供理論依據(jù)和實(shí)踐指導(dǎo)。

1 試驗(yàn)

1.1 材料與儀器

主要材料：澀柿醋、杏醋，食品發(fā)酵試驗(yàn)室釀制，2種醋液表面都長(zhǎng)有1 cm厚的菌膜；葡萄糖、酵母提取物、蛋白胨、瓊脂、無(wú)水乙醇、冰乙酸、Na2HPO4、檸檬酸鈉、K2HPO4、CaCO3。

AE培養(yǎng)基[9]（醋酸乙醇培養(yǎng)基）組成：質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的葡萄糖，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%的酵母提取物，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.4%的蛋白胨，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%的瓊脂，體積分?jǐn)?shù)為3%的無(wú)水乙醇，體積分?jǐn)?shù)為3%的冰乙酸。

RAE培養(yǎng)基（強(qiáng)化AE）組成：質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的葡萄糖，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的酵母提取物，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的蛋白胨，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.338%的Na2HPO4，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.15%的檸檬酸鈉，體積分?jǐn)?shù)為2%的無(wú)水乙醇，體積分?jǐn)?shù)為1%的冰乙酸，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%的瓊脂。

增殖培養(yǎng)基組成：質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的葡萄糖，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的酵母提取物，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的蛋白胨，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.338%的Na2HPO4，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.15%的檸檬酸鈉，體積分?jǐn)?shù)為2%的無(wú)水乙醇，體積分?jǐn)?shù)為1%的冰乙酸。

分離培養(yǎng)基組成：質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的葡萄糖，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的酵母提取物，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的CaCO3，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%的瓊脂。

斜面保藏培養(yǎng)基組成：質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.8%的酵母提取物，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的葡萄糖，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.03%的CaCO3，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.03%的瓊脂，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的蛋白胨，體積分?jǐn)?shù)為0.5%的無(wú)水乙醇。

主要儀器設(shè)備：立式高壓滅菌器，上海佳騰試驗(yàn)設(shè)備有限公司；恒溫振蕩器，躍進(jìn)醫(yī)療機(jī)械廠；凈化工作臺(tái)，新苗醫(yī)療機(jī)械制造有限公司；電熱恒溫水槽，躍進(jìn)醫(yī)療機(jī)械廠；智能恒溫恒濕培養(yǎng)箱，寧波江南儀器廠；鼓風(fēng)干燥箱，北京科偉永興儀器有限公司；Motic（BA200、BA300），光學(xué)顯微鏡。

1.2 醋酸菌培養(yǎng)

1.2.1 種子液制備

用無(wú)菌接種針?lè)謩e從長(zhǎng)有AP薄膜的杏醋、澀柿醋中挑取適量的菌膜至無(wú)菌研缽中，并在無(wú)菌條件下進(jìn)行研磨后分別吸取10 mL至裝有90 mL已滅過(guò)菌的液體RAE培養(yǎng)基的三角瓶中，置于搖床（120 r/min、30 ℃）培養(yǎng)24 h。

1.2.2 接種培養(yǎng)

分別制備RAE培養(yǎng)基、AE培養(yǎng)基各500 mL，在121 ℃高壓下滅菌20 min，冷卻至50～60 ℃后加入無(wú)水乙醇和冰乙酸混勻，倒入平板；每平板接種子液0.2 mL，涂布，30 ℃倒置培養(yǎng)，每天觀察生長(zhǎng)情況。

1.3 產(chǎn)膜菌種篩選分離

1.3.1 菌種分離

增殖培養(yǎng)：將菌膜與醋醪用無(wú)菌研缽在無(wú)菌條件下研磨后，吸取10 mL的菌懸液于裝有90 mL增殖培養(yǎng)基的三角瓶中，用搖床（120 r/min，30 ℃）培養(yǎng)24 h制成種子液。

稀釋涂布：吸取種子液用無(wú)菌水依次稀釋制成不同濃度梯度的菌懸液，選取3個(gè)較小濃度的菌懸液，分別吸取0.2 mL于平板中均勻涂布，每個(gè)濃度梯度做3組平行，置于30 ℃恒溫箱中培養(yǎng)3～4 d后，觀察菌體的生長(zhǎng)情況。查看是否生出小型菌落，菌落周?chē)霈F(xiàn)透明圈的是醋酸桿菌，挑選透明圈較大的單菌落[10]進(jìn)行革蘭氏染色后在顯微鏡下觀察菌體形態(tài)，觀察結(jié)果如果顯示為革蘭氏陰性、短桿菌，則挑選其中分布均勻、透明圈大的單菌落移植于斜面培養(yǎng)基中，在30 ℃條件下恒溫培養(yǎng)24～48 h。

劃線分離：待斜面長(zhǎng)出豐厚的菌苔后，挑取斜面菌種進(jìn)行劃線分離，30 ℃恒溫培養(yǎng)3 d后鏡檢，若為純培養(yǎng)物，則轉(zhuǎn)入斜面保存培養(yǎng)基，在4 ℃下保藏。

1.3.2 菌種鑒定

菌落形態(tài)觀察：觀察記錄培養(yǎng)3～5 d的平板培養(yǎng)基中菌落的形態(tài)。

生理生化試驗(yàn)[11-16]：根據(jù)細(xì)菌常規(guī)生理生化試驗(yàn)方法，對(duì)初步篩選菌種進(jìn)行鑒定。

1.4 醋酸菌產(chǎn)膜生產(chǎn)條件優(yōu)化

1.4.1 種齡和接種量選擇

1）種齡選擇。挑取適量斜面保藏菌種于增殖培養(yǎng)基中，振蕩混勻后用8層紗布封口，置于搖床（120 r/min、30 ℃）依次振蕩培養(yǎng)16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38 h后，測(cè)定菌液光密度（OD值）[17]（600 nm），并以5%的接種量接入裝有100 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基的三角瓶（量程為250 mL）中，振蕩混勻后用8層紗布封口，30 ℃靜置培養(yǎng)5 d，測(cè)定AP的產(chǎn)率。

2）接種量選擇。接種量是指移入種子液的體積和接種后培養(yǎng)液體積的比。挑取斜面菌種于裝有增殖培養(yǎng)基的三角瓶中，振蕩混勻后用8層紗布封口，并以得出的最適種齡為培養(yǎng)時(shí)間，分別以1%、3%、5%、7%、9%、11%、13%的接種量接入裝有100 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基的三角瓶（量程為250 mL）中，振蕩混勻后用8層紗布封口，30 ℃靜置培養(yǎng)5 d，測(cè)定AP的產(chǎn)率。

1.4.2 培養(yǎng)基成分優(yōu)化

1）碳源選擇及用量確定。以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的不同單一碳源（葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖、甘露醇），分別替代原基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的葡萄糖，同時(shí)設(shè)定空白對(duì)照（即在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中不添加葡萄糖），分別接入體積分?jǐn)?shù)為5%的種子液，30 ℃靜置培養(yǎng)5 d后測(cè)定AP的產(chǎn)率，選出AP產(chǎn)率高的碳源并確定其最適添加量[14]。質(zhì)量分?jǐn)?shù)水平為1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%。

2）氮源用量確定。通過(guò)查閱相關(guān)文獻(xiàn)并綜合經(jīng)濟(jì)考慮，試驗(yàn)選用有機(jī)氮源酵母提取物和蛋白胨，分別確定最適質(zhì)量分?jǐn)?shù)，分別將質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%、0.6%、0.9%、1.2%、1.5%的酵母提取物，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%、0.4%、0.7%、1.0%、1.3%的蛋白胨添加到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，在30 ℃下靜置培養(yǎng)5 d后，分別測(cè)定AP的產(chǎn)率。

3）無(wú)機(jī)鹽選擇及用量確定。以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的不同無(wú)機(jī)鹽（Na2HPO4、檸檬酸鈉、K2HPO4、MgSO4）代替原基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的Na2HPO4和檸檬酸鈉，30 ℃靜置培養(yǎng)5 d后測(cè)定AP的產(chǎn)率，選出AP產(chǎn)率高的無(wú)機(jī)鹽并確定其最適用量。

4）有機(jī)酸選擇及用量確定。以體積分?jǐn)?shù)為1%的不同有機(jī)酸（檸檬酸、酒石酸、蘋(píng)果酸、富馬酸、冰乙酸）代替原基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的冰乙酸，并設(shè)定空白對(duì)照，30 ℃靜置培養(yǎng)5 d后測(cè)定AP的產(chǎn)率，選出AP產(chǎn)率高的有機(jī)酸并確定其最適用量。體積分?jǐn)?shù)水平為0%、1%、2%、3%、4%。

5）無(wú)水乙醇用量確定。在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別添加體積分?jǐn)?shù)為0%、1%、2%、3%、4%、5%、6%的無(wú)水乙醇，在30 ℃下靜置培養(yǎng)5 d后測(cè)定AP的產(chǎn)率。

以上每組試驗(yàn)均設(shè)3組平行。

1.4.3 Plackett?Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)葡糖醋桿菌代謝產(chǎn)細(xì)菌纖維素的一般影響因素以及前期的單因素試驗(yàn)，設(shè)計(jì)Plackett?Burman試驗(yàn)[18]，選取蔗糖、酵母提取物、K2HPO4、檸檬酸鈉、蛋白胨、冰乙酸、無(wú)水乙醇為試驗(yàn)因素，以AP濕膜質(zhì)量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，利用Minitab 16統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，因素及編碼水平見(jiàn)表1。

表1 Plackett?Burman試驗(yàn)因素及編碼水平

Tab.1 Experimental factors and coding level of Plackett?Burman

1.4.4 響應(yīng)曲面（RSM）試驗(yàn)設(shè)計(jì)

結(jié)合Plackett–Burman試驗(yàn)的結(jié)果來(lái)確定影響AP產(chǎn)率的主要因素及其水平范圍，再采用Box–Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法對(duì)細(xì)菌纖維素培養(yǎng)條件進(jìn)行響應(yīng)曲面分析試驗(yàn)，從而獲得培養(yǎng)AP的最適培養(yǎng)基[19-20]。因素水平及編碼見(jiàn)表2。

表2 Box?Behnken試驗(yàn)因素及編碼水平

Tab.2 Experimental factors and coding level of Box-Behnken

1.4.5 醋酸菌菌膜參數(shù)測(cè)定

1）菌膜的處理及AP產(chǎn)率。將培養(yǎng)好的膜從三角瓶中取出，用蒸餾水沖洗數(shù)次，浸泡一夜（除去膜中的培養(yǎng)基和表面的雜質(zhì)），再用濃度為0.1 mol/L的NaOH溶液90 ℃浸泡處理2 h，直到膜呈乳白色，半透明狀；將膜取出用水清洗數(shù)次，用體積分?jǐn)?shù)為0.5%的乙酸溶液浸泡5 min，再用蒸餾水沖洗數(shù)次，直至用pH試紙測(cè)其表面水分為中性時(shí)，除去AP濕膜表面的多余水分，即為細(xì)菌纖維素濕膜；將細(xì)菌纖維素濕膜置于干燥箱中（90±3）℃下烘至完全干燥，即為細(xì)菌纖維素干膜[21-22]。AP產(chǎn)率計(jì)算方法為：

AP產(chǎn)率=濕膜質(zhì)量/培養(yǎng)液體積

2）AP濕膜含水率與干膜復(fù)水率計(jì)算。

AP濕膜的含水率計(jì)算式為：

AP的干膜稱(chēng)完質(zhì)量后，放入培養(yǎng)皿中并向其中加入蒸餾水，浸泡24 h后，取出用濾紙吸干表面水分，稱(chēng)量其吸水后的質(zhì)量，計(jì)算醋酸菌菌膜干膜的復(fù)水率：

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)膜醋酸菌的形態(tài)和生化鑒定

將產(chǎn)膜醋酸菌接種于柿醋中，培養(yǎng)5 d。發(fā)現(xiàn)2種果醋所制種子液在RAE、AE培養(yǎng)基上均能產(chǎn)膜，但在RAE培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)速度均比在AE培養(yǎng)基上要快。杏醋醋酸菌所產(chǎn)膜易碎不易揭起，柿醋醋酸菌所產(chǎn)膜韌性較強(qiáng)，不易碎且易揭起。故選擇RAE培養(yǎng)基作為產(chǎn)膜醋酸菌的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，選擇長(zhǎng)有AP膜的澀柿醋作為分離產(chǎn)膜菌種的原材料。用RAE培養(yǎng)培養(yǎng)從澀柿醋中分離的產(chǎn)膜醋酸菌，進(jìn)行了菌落形態(tài)觀察和生理生化特征測(cè)定。

菌體形態(tài)結(jié)果見(jiàn)圖1—2，分離的醋酸菌菌落表面光滑乳白色，菌體呈短桿狀，單個(gè)或成對(duì)出現(xiàn)，革蘭氏染色呈陰性。生理生化特征試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。依據(jù)菌體形態(tài)觀察及生理生化試驗(yàn)結(jié)果，初步確定篩選分離所得菌種為葡糖醋桿菌（）。

圖1 醋酸菌菌落形態(tài)

圖2 醋酸菌顯微觀察

表3 菌種生理生化特征鑒定

Tab.3 Biochemical and physiologica characteristics of bacteria

2.2 培養(yǎng)基瓊脂對(duì)醋酸菌產(chǎn)膜的影響

在培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中瓊脂含量越低，其膜生長(zhǎng)速度越快越容易揭起，并分別以瓊脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0%、0.5%、0.9%、1%、1.2%、1.5%進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果表明培養(yǎng)1 d，液體培養(yǎng)基表面便覆蓋一層薄膜，可揭起，而添加瓊脂的量越大，其醋酸菌產(chǎn)菌膜的速率越慢，約2 d培養(yǎng)基表面才長(zhǎng)出膜，培養(yǎng)5 d膜仍不易揭起，且液體培養(yǎng)不易被雜菌污染，故選擇液體培養(yǎng)基作為AP生產(chǎn)培養(yǎng)基。

2.3 種齡對(duì)菌膜產(chǎn)率的影響

種齡即“種子”的群體生長(zhǎng)年齡，種齡的長(zhǎng)短都會(huì)影響AP的產(chǎn)率，種齡不夠或種齡過(guò)長(zhǎng)都會(huì)使AP的產(chǎn)率下降，因此，選擇合適的種齡對(duì)提高AP產(chǎn)率有著重要作用。由圖3可知，種齡在32 h時(shí)，菌液OD值最高，說(shuō)明此時(shí)菌液密度最高，種子活力最高。同時(shí)以培養(yǎng)32 h的種子培養(yǎng)液接種培養(yǎng)5 d后所得AP濕膜產(chǎn)率也均高于其他培養(yǎng)時(shí)間，見(jiàn)圖4，說(shuō)明種齡為32 h時(shí)最適合發(fā)酵生產(chǎn)AP。

圖3 種齡對(duì)醋酸菌生長(zhǎng)影響

圖4 種齡對(duì)AP產(chǎn)率的影響

2.4 接種量對(duì)AP產(chǎn)率的影響

接種量過(guò)多或過(guò)少均不利于AP生產(chǎn)，接種量過(guò)多會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)底物前期消耗過(guò)快，同時(shí)菌體濃度過(guò)大會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)基中的溶氧量過(guò)少，致使大量菌體死亡，從而影響AP產(chǎn)率；接種量過(guò)少，AP的合成速度變慢，致使AP產(chǎn)率下降。由圖5可知，當(dāng)接種量在9%以下時(shí)，AP產(chǎn)率隨接種量的增加產(chǎn)率不斷增加，但當(dāng)接種量高于9%時(shí)AP產(chǎn)率反而下降，因此確定9%為最佳接種量，AP濕膜產(chǎn)率為260 g/L。

圖5 接種量對(duì)AP產(chǎn)率的影響

2.5 碳源對(duì)AP產(chǎn)率的影響

每種微生物的生理特性不同，所能利用的碳源種類(lèi)也不一樣，培養(yǎng)基中添加不同的碳源，葡糖醋桿菌的利用程度不一樣，則醋酸菌菌膜的產(chǎn)率就有差異[18]。該試驗(yàn)在基礎(chǔ)培養(yǎng)基的上添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的不同單一碳源，以不含碳源的培養(yǎng)基作為空白對(duì)照，在30 ℃下靜置培養(yǎng)5 d后，結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6 不同碳源對(duì)AP產(chǎn)率的影響

碳源種類(lèi)不同，發(fā)酵所獲得的AP產(chǎn)率不同，葡萄糖、蔗糖和甘露醇作為碳源，產(chǎn)率較高，其中蔗糖產(chǎn)率高于甘露醇和葡萄糖，蔗糖作為碳源更有利于葡糖醋桿菌代謝產(chǎn)生AP，故選擇蔗糖為碳源，并確定其最適用量。由圖7可知，蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%時(shí)，AP產(chǎn)率最高。

2.6 氮源用量對(duì)醋酸菌菌膜產(chǎn)率的影響

氮源是微生物發(fā)酵的主要原料之一，有無(wú)機(jī)氮源和有機(jī)氮源之分，通過(guò)查閱文獻(xiàn)并從經(jīng)濟(jì)角度考慮[19]，試驗(yàn)選擇蛋白胨、酵母提取物作為氮源發(fā)酵生產(chǎn)AP。AP產(chǎn)率隨蛋白胨和酵母提取物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化趨勢(shì)分別見(jiàn)圖8—9。

圖7 蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)AP產(chǎn)率的影響

圖8 蛋白胨質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)AP產(chǎn)率的影響

圖9 酵母提取物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)AP產(chǎn)率的影響

結(jié)果顯示AP產(chǎn)率在酵母提取物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.2%，蛋白胨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.7%時(shí)最高。

2.7 無(wú)機(jī)鹽對(duì)醋酸菌菌膜產(chǎn)率的影響

無(wú)機(jī)鹽是微生物生命過(guò)程中不可缺少的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，不同的無(wú)機(jī)鹽對(duì)不同微生物的生長(zhǎng)繁殖所起到的作用也不一樣。不同無(wú)機(jī)鹽對(duì)AP產(chǎn)率的影響圖10，其中K2HPO4和檸檬酸鈉對(duì)AP產(chǎn)率影響較為明顯，因此試驗(yàn)選擇K2HPO4和檸檬酸鈉作為生產(chǎn)AP的無(wú)機(jī)鹽。

通過(guò)設(shè)定不同的質(zhì)量分?jǐn)?shù)梯度確定K2HPO4和檸檬酸鈉最適質(zhì)量分?jǐn)?shù)以獲得較高產(chǎn)率的AP。從圖11和圖12所示結(jié)果可以看出，當(dāng)K2HPO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%，檸檬酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.15%時(shí)AP產(chǎn)率最高。

圖10 不同無(wú)機(jī)鹽對(duì)AP產(chǎn)率的影響

圖11 K2HPO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)AP產(chǎn)率的影響

圖12 檸檬酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)AP產(chǎn)率的影響

2.8 有機(jī)酸對(duì)醋酸菌菌膜產(chǎn)率的影響

在增殖培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加體積分?jǐn)?shù)為1%的不同有機(jī)酸代替乙酸，在30 ℃下靜置培養(yǎng)5 d后結(jié)果見(jiàn)圖13。乙酸對(duì)AP產(chǎn)率影響較為明顯，蘋(píng)果酸與檸檬酸對(duì)其產(chǎn)率影響不大，而富馬酸與酒石酸對(duì)AP產(chǎn)率不僅沒(méi)有促進(jìn)作用，而且抑制了菌體生長(zhǎng)，降低了AP產(chǎn)率，故而選擇乙酸作為進(jìn)一步優(yōu)化的有機(jī)酸。AP產(chǎn)率隨乙酸濃度變化趨勢(shì)見(jiàn)圖14，當(dāng)乙酸體積分?jǐn)?shù)為0.1%時(shí)，菌體能產(chǎn)生最大量的AP。當(dāng)乙酸的體積分?jǐn)?shù)過(guò)大時(shí)，抑制了菌體生長(zhǎng)反而降低了AP的產(chǎn)率。

圖13 不同有機(jī)酸對(duì)AP產(chǎn)率的影響

圖14 乙酸體積分?jǐn)?shù)對(duì)AP產(chǎn)率的影響

2.9 無(wú)水乙醇用量確定

葡糖醋桿菌能夠?qū)⑤^低體積分?jǐn)?shù)的無(wú)水乙醇轉(zhuǎn)化成生命活動(dòng)所需要的高能化合物，因此較低體積分?jǐn)?shù)的無(wú)水乙醇可以促進(jìn)葡糖醋桿菌發(fā)酵產(chǎn)生醋酸菌菌膜[20]。如圖15所示，當(dāng)無(wú)水乙醇體積分?jǐn)?shù)低于2%時(shí)，菌體細(xì)胞代謝所需要的能量能夠得到滿足，促進(jìn)AP的生成，AP產(chǎn)率增加。當(dāng)無(wú)水乙醇體積分?jǐn)?shù)大于2%時(shí)，隨著其體積分?jǐn)?shù)的增加，菌體生長(zhǎng)受到抑制，AP產(chǎn)率降低。綜上，無(wú)水乙醇體積分?jǐn)?shù)為2%時(shí)，促進(jìn)作用最為明顯，AP產(chǎn)率最大。

圖15 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)AP產(chǎn)率的影響

2.10 AP培養(yǎng)基優(yōu)化

在前期單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以蔗糖、蛋白胨、酵母提取物、K2HPO4、檸檬酸鈉、乙酸、無(wú)水乙醇為考察因素，利用Plackett–Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)，進(jìn)行12組試驗(yàn)，數(shù)據(jù)分析結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可知，主效應(yīng)中影響AP產(chǎn)率的主要因素為蔗糖（=0.002）、無(wú)水乙醇（=0.003）、K2HPO4（=0.009），主要因素的值均小于 0.050，可以作為進(jìn)一步優(yōu)化的關(guān)鍵因素。其他因素對(duì)AP產(chǎn)率影響不大（>0.05），在進(jìn)一步研究中作為條件因素考慮。

2.11 培養(yǎng)基組成與醋酸菌菌膜產(chǎn)率關(guān)系的二次方程的建立

參照前期的單因素試驗(yàn)及Plackett–Burman試驗(yàn)，對(duì)影響菌體代謝合成AP的主要因素蔗糖、K2HPO4、無(wú)水乙醇按Box–Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行17組試驗(yàn)（培養(yǎng)基其他成分按單因素試驗(yàn)結(jié)果配制：蛋白胨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.7%、酵母提取物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.2%、檸檬酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.15%、乙酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%），結(jié)果見(jiàn)表5。

表4 Plackett?Burman試驗(yàn)主效應(yīng)分析

Tab.4 Analysis of main effects for Plackett?Burman experiment

表5 Box–Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

Tab.5 Results of Box - Behnken experiment design

利用design expert軟件對(duì)表5中的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到AP產(chǎn)率（）對(duì)自變量蔗糖（1）、K2HPO4（2）、乙醇（3）的多元回歸方程為：

=35.92+0.331?1.222+2.63+0.3612?3.5213+2.4823?6.6412?0.3722?5.4732

由方差分析可知（表6），此模型極顯著（<0.000 1），失擬項(xiàng)不顯著（=0.467 6），預(yù)測(cè)值與真實(shí)值間有高度相關(guān)性（2=0.996 6），說(shuō)明模型與實(shí)際擬合良好，可應(yīng)用于AP生產(chǎn)產(chǎn)率的分析與預(yù)測(cè)。

從表7培養(yǎng)基成分的回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)結(jié)果可以看出，在模型參數(shù)中1與3、2與3之間的交互作用對(duì)AP產(chǎn)率的影響極顯著，1與2的交互作用對(duì)AP產(chǎn)率的影響不顯著。

2.12 AP表觀形態(tài)觀察

靜態(tài)培養(yǎng)條件下，AP膜浮于液體培養(yǎng)基表面。AP膜經(jīng)水處理后呈現(xiàn)乳黃色不透明狀，經(jīng)堿液處理后呈白色或乳白色半透明狀，外表光滑細(xì)膩，類(lèi)似凍狀，有彈性，經(jīng)（90±3）℃處理后，結(jié)構(gòu)致密，韌性強(qiáng)[21-22]。未處理的AP濕膜、經(jīng)水處理后的AP濕膜、經(jīng)堿液處理后的AP濕膜、干膜表觀形態(tài)對(duì)照見(jiàn)圖16。

2.13 AP濕膜含水率與干膜復(fù)水率

由表8可得，醋酸菌菌膜膜具有很強(qiáng)的持水性，醋酸菌菌膜濕膜平均含水率為99.38%，最低含水率也可達(dá)到99.22%，最高可達(dá)99.53%，復(fù)水率為71.09%～83.39%，AP干膜不僅復(fù)水率高且復(fù)水速度快，復(fù)水1 min其含水率便可達(dá)到70%以上。

表6 AP 發(fā)酵培養(yǎng)基多元二次方程方差分析

Tab.6 Anova for multivariate quadratic equation of AP fermentation medium

表7 培養(yǎng)基成分回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)

Tab.7 Regression equation coefficient significance test of medium components

注：**表示在0.01水平上的顯著性。

圖16 AP形態(tài)

表8 AP 濕膜含水率和干膜復(fù)水率

Tab.8 AP wet membrane water content and dry film rehydration rate

3 結(jié)語(yǔ)

以柿醋菌膜為材料，從中篩選分離出高產(chǎn)醋酸菌菌膜的菌種，運(yùn)用單因素試驗(yàn)獲得各因素水平范圍，再通過(guò)響應(yīng)曲面（RSM）試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)醋酸菌菌膜培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，以獲得最佳生產(chǎn)條件。同時(shí)，對(duì)醋酸菌菌膜膜的基本性質(zhì)做了研究，得到結(jié)論如下。

1）分離的產(chǎn)菌膜菌株經(jīng)形態(tài)觀察及生理生化鑒定后得出，該菌種為葡糖醋桿菌（）。

2）通過(guò)單因素試驗(yàn)，確定了最佳培養(yǎng)條件（接種量為9%，種齡為32 h，培養(yǎng)時(shí)間為5 d）和各因素用量水平范圍。

3）通過(guò)Plackett–Burman 試驗(yàn)選出影響細(xì)菌纖維產(chǎn)率的主要因素為蔗糖、無(wú)水乙醇、K2HPO4。

4）利用響應(yīng)曲面優(yōu)化試驗(yàn)，并綜合各試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果得出最優(yōu)生產(chǎn)培養(yǎng)基成分組成：蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%、蛋白胨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.7%、酵母提取物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.2%、檸檬酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.15%、K2HPO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.16%、冰乙酸體積分?jǐn)?shù)為1%、無(wú)水乙醇體積分?jǐn)?shù)為2%，在此條件下得到的實(shí)際AP的平均產(chǎn)率為364.65 g/L，是優(yōu)化前的（246.03 g/L）的1.48倍；醋酸菌菌膜濕膜平均含水率為99.38%，復(fù)水率為71.09%～83.39%，AP干膜不僅復(fù)水率高且復(fù)水速度快，復(fù)水1 min其含水率便可達(dá)到70%以上。

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Optimization of Production Conditions of Acetic Acid Bacteria Pellicle

ZHANG Jiu-yu1a, SUN Nan2, ZHANG Wei2, FAN Ming-tao1a, 1b

(1a. College of Life Science b. College of Food Science and Engineering, Northwest A&F University, Shaanxi Xianyang 712100, China; 2. College of Food Engineering and Nutritional Science, Shaanxi Normal University, Xi'an 710119, China)

The work aims to optimize the optimum culture conditions and methods for production of bacterial pellicle with acetic acid bacteria to obtain a natural and safe production process of pellicle for food packaging. Astringent persimmon vinegar was used as raw material, and excellent acetic acid bacteria with high yield membrane were isolated and screened. The optimum culture method and technological conditions of acetic acid pellicle were optimized by single factor and Plackett?Burman experimental design. The pellicle producing acetic acid bacteria was isolated and purified from astringent persimmon vinegar and identified as gluconacetobacter xylinum. The optimum conditions for culture of pellicle with acetic acid bacteria were as follows: sucrose 5% (mass fraction), peptone 0.7% (mass fraction), yeast extract 1.2% (mass fraction), sodium citrate 0.15% (mass fraction), K2HPO40.16% (mass fraction), acetic acid 1% (v/v), absolute ethanol 2% (v/v), seed age 32 h, inoculation amount 9%, cultured for 5 days. The average yield of pellicle was 364.65 g/L, which was 1.48 times as high as that before optimization (246.03 g/L). The average moisture content of wet pellicle was 99.38%, and the rehydration rate was 71.09%-83.39%. The rehydration rate of dry membrane was high and the rehydration speed was fast. The water content can reach more than 70% after one minute of rehydration. With the optimized culture medium and method, high-quality pellicle can be produced with acetic acid bacteria.

acetic acid bacteria; pellicle; packaging; condition optimization

TS206

A

1001-3563(2022)13-0031-11

10.19554/j.cnki.1001-3563.2022.13.005

2021?08?27

大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃（X202010712283）；西安市科技計(jì)劃（20193044YF032NS032）；中國(guó)富硒產(chǎn)業(yè)研究院2019年富硒專(zhuān)項(xiàng)“236”計(jì)劃（2019QCY–2.3–02）

張九裕（2001—），女，西北農(nóng)林科技大學(xué)本科生，主攻生物科學(xué)。

樊明濤（1963—），男，博士，西北農(nóng)林科技大學(xué)教授、博導(dǎo)，主要研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)與食品安全。

責(zé)任編輯：曾鈺嬋