楊居崩，李 爽，聶發(fā)龍，趙顯芳，朱紫陌，代 蓉，李秀芳

（云南中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，云南 昆明 650500）

上呼吸道感染（URTI）是外鼻孔至環(huán)狀軟骨下緣包括鼻、咽或喉部急性炎癥的總稱，常由病毒和細菌相互作用引起，包括普通感冒、流行性感冒、病毒性咽炎等［1?2］。由于引起URTI 的病原微生物絕大部分經(jīng)口鼻進入機體，因此鼻黏膜屏障對于防御病原體進入機體至關(guān)重要。該屏障由機械屏障、化學(xué)屏障、微生物屏障和免疫屏障有機地結(jié)合在一起，共同阻止病原微生物對機體的侵襲［3］。鼻黏膜免疫功能低下是URTI 發(fā)生的重要原因，也與URTI反復(fù)發(fā)作密切相關(guān)［4?5］。銀翹散源于清代醫(yī)家吳鞠通《溫病條辨》，被稱為“辛涼平劑”，臨床常用于治療普通感冒、流行性感冒、急性支氣管炎等疾病，療效良好。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，銀翹散可通過增強上呼吸道免疫屏障功能發(fā)揮預(yù)防及改善URTI 的作用［6?8］，本研究中探討了銀翹散對模型小鼠鼻黏膜屏障功能低下的影響?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與動物

儀器：Infinite M200 PRO型酶標儀（瑞士Tecan公司）；EPS ?301型垂直電泳儀、Mini Trans ?Blot?Cell型濕轉(zhuǎn)儀，均購自美國Bio ?Rad 公司；UVP凝膠成像分析系統(tǒng)（美國Bio Spectrum 公司）；XS125A 型分析天平（瑞士Precisa公司）。

試藥：BCA 蛋白濃度檢測試劑盒（批號為090321211027）、RIPA 裂解液（批號為20211104）、過硫酸銨（APS）（批號為ST005）、TEMED（批號為ST728），均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；吐溫?20（德國Biofroxx 公司，批號為EZ6789B150）；10%十二烷基硫酸鈉（SDS，批號為G522KA5701）、二硫蘇糖醇（DTT，批號為A620058 ?0025），均購自生工生物工程（上海）股份有限公司；Tris（批號為1109U071）、1 mol/L Tris ?HCl緩沖液（批號為20191217）、1.5 mol/ L Tris ?HCl 緩沖液（批號為20211230）、甘氨酸（批號為1210J061），均購自北京索萊寶科技有限公司；免疫球蛋白A抗體（Anti ?IgA，美國Novus Biologicals 公司，批號為NB7501）；Rabbit Anti ?Goat IgG（H+L）（批號為20000332）、Goat Anti ?Rabbit IgG（H + L）（批號為20000373）、β ?Actin Mouse McAb（批號為10021787）、緊密連接蛋白（Occludin）Rabbit PolyAb（批號為13409 ?1 ?AP），均購自美國Proteintech 公司；脂多糖（LPS，批號為068M4093V）、異硫氰酸熒光素（FITC）?葡聚糖（批號為CBW4630），均購自美國Sigma公司；水為去離子水。

飲片：金銀花（批號為C180301）、連翹（批號為C180601）、桔梗（批號為C181001）、竹葉（批號為C190201）、生甘草（批號為C180501）、淡豆豉（批號為C190401）、牛蒡子（批號為C180801）、葦根（批號為C180901）、薄荷（批號為C181204）、荊芥穗（批號為C190701），均購自云南慈慧藥業(yè)有限公司。

動物：SPF級雄性KM小鼠，5周齡，體質(zhì)量18～20 g，購自成都達碩實驗動物有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK（川）2020 ?030，飼養(yǎng)于云南中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗室［SYXK（滇）K2017 ?0005］，飼養(yǎng)期間小鼠自由飲水，飼喂普通維持飼料。飼養(yǎng)環(huán)境：晝夜各半、循環(huán)照明，濕度恒定，溫度為22～25 ℃。所有操作均符合云南中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理學(xué)要求（審批號R ?06202009）。

1.2 方法

1.2.1 藥液制備

除薄荷和荊芥穗外，取其余藥材飲片，加入12倍量的水，浸泡30 min，煎煮10 min，再將薄荷和荊芥穗倒入共煎5 min，濾過，取續(xù)濾液，45 ℃下旋蒸至所需濃度。4 ℃保存，使用時以溫水預(yù)熱，1周內(nèi)使用［9］。

1.2.2 LPS 單次滴鼻刺激實驗

分組與建模：將40只小鼠分為正常對照組（8只）和模型A 組（32 只）。模型A 組小鼠以LPS（2 mg/ kg，每20 g 體質(zhì)量20 μL，每側(cè)鼻腔各10 μL）單次滴鼻，正常對照組小鼠滴鼻等體積磷酸鹽緩沖液（PBS）。

IgA 及Occludin 蛋白表達：采用Western blot 法。模型A 組滴鼻結(jié)束后1，3，5，7 d 時各取8 只小鼠，過量麻醉處死，剝?nèi)⌒∈蟊丘つぃ羲?，加? mL RIPA 裂解液，冰上勻漿，14 000 r /min離心5 min，取上清，以BCA法檢測蛋白濃度。SDS ?PAGE電泳，電轉(zhuǎn)，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，清洗3次，加入一抗，4 ℃孵育過夜，清洗3次，加入二抗，室溫振搖孵育1 h，清洗3次，加入ECL 化學(xué)發(fā)光試劑，顯影、成像。將條帶灰度值數(shù)字化，目的條帶與內(nèi)參條帶灰度比值為各目的蛋白相對表達量。

1.2.3 LPS 連續(xù)滴鼻刺激實驗

分組與建模：將40只小鼠分為正常對照組（8只）和模型B 組（32 只）。滴鼻劑量同1.2.2 項。模型B 組各取8 只小鼠分別連續(xù)1，3，5，7 d 滴鼻給藥，每天1 次，均于末次滴鼻前1 h以FITC ?葡聚糖滴鼻。正常對照組小鼠滴鼻等體積PBS。

IgA及Occludin蛋白表達：末次給藥后處死小鼠，剝?nèi)”丘つぃ?.2.2 項下Western blot 法測定蛋白相對表達量。

鼻黏膜上皮屏障通透性：采用酶標儀測定小鼠血清葡聚糖水平，以評估小鼠鼻黏膜上皮屏障通透性，水平越高表明通透性越好。

1.2.4 銀翹散對模型小鼠的影響

分組與建模：將32只小鼠分為正常對照組（等體積蒸餾水）、模型C組（等體積蒸餾水），以及銀翹散低、高劑量組（相當(dāng)于生藥24.18 g/kg 和72.54 g/kg），各8 只。除正常對照組外（等體積PBS 滴鼻），其余組小鼠以LPS（劑量同1.2.2項）滴鼻后6 h灌胃相應(yīng)藥物（0.2 mL/10 g）或等體積蒸餾水，每天1次，連續(xù)7 d。

IgA及Occludin蛋白表達：末次給藥后處死小鼠，剝?nèi)”丘つぃ?.2.2 項下Western blot 法測定蛋白相對表達量。按1.2.3項下方法評估小鼠鼻黏膜上皮屏障通透性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 26.0 統(tǒng)計學(xué)軟件分析。計量資料以±s表示。資料符合正態(tài)分布且各組方差齊，兩組間比較行t檢驗，兩組以上行單因素方差分析，兩兩比較行LSD?t檢驗；資料符合正態(tài)分布但各組方差不齊，或資料不符合正態(tài)分布且各組方差不齊，行Kruskal ?Wallis非參數(shù)檢驗，兩兩比較，采用Bonferroni 法校正P值。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。采用GraphPad Prism 9.0軟件作圖。

2 結(jié)果

2.1 LPS 單次滴鼻后小鼠鼻黏膜組織中IgA 及Occludin 蛋白表達水平

與正常對照組比較，模型A 組小鼠鼻黏膜組織中IgA 蛋白表達水平僅在滴鼻后1 d 時顯著降低（P＜0.01），3，5，7 d時持續(xù)升高且3 d時基本恢復(fù)正常；Occludin蛋白表達水平僅在3 d時顯著降低（P＜0.01）。詳見圖1。

2.2 LPS 連續(xù)滴鼻后小鼠鼻黏膜組織中IgA及Occludin 蛋白表達、鼻黏膜上皮屏障通透性

A1，B1.電泳圖 A2，B2.統(tǒng)計數(shù)據(jù)A.IgA B.Occludin注：與正常對照組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01。圖2同。圖1 LPS單次滴鼻后小鼠鼻黏膜組織中IgA，Occludin蛋白表達水平A1，B1.Electrophoretogram A2，B2.Statistical dataA.IgA B.OccludinNote：Compared with those in the normal control group，*P ＜0.05，**P ＜0.01（for Fig.1 ?2）.Fig.1 Expression levels of IgA and Occludin protein in nasal mucosa of mice after single nasal drip of LPS

與正常對照組比較，模型B 組予LPS 滴鼻1 次（1 d 1 次，下同）和連續(xù)滴鼻3 次時，小鼠鼻黏膜組織中IgA蛋白表達水平顯著降低（P＜0.01），連續(xù)滴鼻5，7次時，IgA 蛋白表達水平雖持續(xù)升高，但未恢復(fù)至正常水平；Occludin 蛋白表達水平在連續(xù)滴鼻3 次時顯著降低（P＜0.01）。與正常對照組比較，模型B 組連續(xù)滴鼻3，5，7次后，小鼠血清葡聚糖水平顯著升高（P＜0.05）。詳見圖2。

2.3 銀翹散對模型小鼠相關(guān)指標的影響

與正常對照組比較，模型C 組小鼠鼻黏膜組織中Occludin 蛋白表達水平顯著降低（P＜0.01），血清葡聚糖水平顯著升高（P＜0.01）；與模型C 組比較，銀翹散低、高劑量組小鼠鼻黏膜組織中Occludin蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05），血清葡聚糖水平顯著降低（P＜0.01）；銀翹散高劑量組小鼠鼻黏膜組織中IgA 蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05）。詳見圖3。

A1，B1.電泳圖 A2，B2.統(tǒng)計數(shù)據(jù)A.IgA B.Occludin C.葡聚糖注：與正常對照組比較，△△P ＜0.01；與模型C組比較，#P ＜0.05，##P ＜0.01。圖3 銀翹散對模型小鼠相關(guān)指標的影響（±s，n=10）A1，B1.Electrophoretogram A2，B2.Statistical dataA.IgA B.Occludin C.DextranNote：Compared with those in the normal control group，△△P ＜0.01；Compared with those in the model group C，#P ＜0.05，##P ＜0.01.Fig.3 Effect of Yinqiao Powder on relevant indexes of model mice

3 討論

鼻黏膜屏障功能低下是URTI 發(fā)病的重要原因，氣管炎、支氣管炎、肺炎等嚴重的下呼吸道感染也常始于URTI［10?11］，故保持鼻黏膜屏障功能的完整性對于防治URTI 具有重要意義。有研究表明，IgA 有助于預(yù)防流感，鼻腔或血清中IgA含量較高的H1N1流感患者，恢復(fù)時間更短［12?13］。Occludin 蛋白是首個完整的形成緊密連接的跨膜蛋白［14?15］，在維持上皮細胞緊密連接屏障中起關(guān)鍵作用，Occludin 蛋白缺失將導(dǎo)致大分子的選擇通透性增加［16］。本研究結(jié)果表明，以LPS 分別單次滴鼻后第1 天和第3 天，小鼠鼻黏膜組織中IgA 和Occludin蛋白表達水平明顯降低，隨后開始升高至接近正常水平，說明LPS 單次刺激誘導(dǎo)的炎癥較輕，免疫屏障和機械屏障破壞程度輕，容易恢復(fù)至正常水平。LPS 連續(xù)滴鼻誘導(dǎo)持續(xù)炎癥刺激，滴鼻1 次和連續(xù)3 次時，小鼠鼻黏膜組織中IgA 蛋白表達水平明顯降低，Occludin 蛋白表達水平在連續(xù)滴鼻3，5，7 次時明顯降低，血清中FITC ?葡聚糖水平升高，即鼻黏膜上皮屏障的通透性升高，說明持續(xù)的炎癥刺激可降低鼻黏膜免疫屏障、機械屏障的功能，這為病原微生物的入侵提供了便利。

銀翹散是治療URTI 的代表方，具有辛涼透表、清熱解毒的功效，用于溫病初起、邪犯肺衛(wèi)證。方中以金銀花、連翹為君藥，可疏散風(fēng)熱、清熱解毒；薄荷、牛蒡子可辛涼解表、清利咽喉，桔?？砷_宣肺氣、止咳利咽，蘆根、竹葉可清熱生津，同為佐藥；生甘草既可調(diào)和藥性、護胃安中，又合桔梗清利咽喉，為佐使。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，銀翹散具有一定的解熱［17］、鎮(zhèn)痛［18］、抗炎［19］、抗病毒［20］的作用。課題組前期研究表明，銀翹散可明顯降低寒冷刺激后模型大鼠血清中炎性因子水平，并能提高鼻黏膜局部免疫防御能力［21］。本研究結(jié)果表明，與模型C組比較，銀翹散低、高劑量組小鼠鼻黏膜組織中IgA、Occludin蛋白表達水平明顯升高，鼻黏膜上皮屏障通透性明顯降低。

綜上所述，銀翹散可改善模型小鼠鼻黏膜免疫屏障功能，機制可能為促進鼻黏膜中Occludin 蛋白表達，降低鼻黏膜上皮屏障的通透性，從而提高鼻黏膜機械屏障功能。還可通過促進IgA 的表達，提高鼻黏膜免屏障功能。