鋁是自然界中常見(jiàn)的一種元素，大量研究表明鋁負(fù)荷引起肝臟形態(tài)異常和功能障礙

，其損傷的機(jī)制可能與氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)相關(guān)

。研究發(fā)現(xiàn)鋁通過(guò)誘導(dǎo)氧自由基形成，從而引起氧化應(yīng)激損傷致細(xì)胞凋亡

。半胱氨酰白三烯受體1(CysLTR1)與肝細(xì)胞損傷過(guò)程關(guān)系密切，據(jù)報(bào)道CysLTR1抑制劑孟魯司特可防止小鼠對(duì)乙酰氨基酚誘導(dǎo)的肝損傷

，也有研究發(fā)現(xiàn)抑制CysLTR1可以減少肝細(xì)胞凋亡保護(hù)腸 I/R繼發(fā)肝損傷

。細(xì)胞凋亡是引發(fā)肝損傷的重要機(jī)制之一

，既往研究發(fā)現(xiàn)CysLTR1通路通過(guò)調(diào)控細(xì)胞自噬參與鋁負(fù)荷肝細(xì)胞損傷

。然而CysLTR1通路參與鋁負(fù)荷肝細(xì)胞凋亡的具體機(jī)制仍未完全清楚，MK-571是 CysLTR1的特異性受體拮抗劑。本研究旨在通過(guò)應(yīng)用MK-571作用鋁負(fù)荷肝細(xì)胞，探討CysLTR1通路調(diào)節(jié)鋁負(fù)荷肝細(xì)胞氧化應(yīng)激及凋亡機(jī)制的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 細(xì)胞株：HL-7702(L02)為人源正常肝細(xì)胞(北納創(chuàng)聯(lián)生物公司)，RPMI-1640培養(yǎng)基(美國(guó)Hyclone)，胎牛血清(FBS)(德國(guó)Biotech)，MTT(美國(guó)Genview)，MK-571(英國(guó)Cayman Chemical)，麥芽酚、三氯化鋁(國(guó)藥化工)。ALT試劑盒、AST試劑盒、SOD試劑盒(南京建成)，MDA、BCA試劑盒(碧云天)，抗體：Bcl-2(博士德，武漢)、Bax(Proteintech，美國(guó))、Caspase3(Abcam，美國(guó))、Caspase9(CST，美國(guó))、GAPDH(Proteintech，美國(guó))，二抗購(gòu)自武漢三鷹生物有限公司。

在汽車(chē)發(fā)動(dòng)機(jī)電控系統(tǒng)維修、汽車(chē)自動(dòng)變速器維修、汽車(chē)電氣系統(tǒng)維修等課程過(guò)程考核中，引入汽車(chē)檢測(cè)與維修技能大賽的規(guī)則評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，不僅考核學(xué)生的理論知識(shí)掌握情況，同時(shí)從學(xué)生的崗位操作技能、故障分析能力等方面對(duì)學(xué)生進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。例如：汽車(chē)發(fā)動(dòng)機(jī)電控系統(tǒng)維修課程過(guò)程考核中設(shè)有進(jìn)氣系統(tǒng)電氣元件檢測(cè)、發(fā)動(dòng)機(jī)電控系統(tǒng)數(shù)據(jù)分析、發(fā)動(dòng)機(jī)不能起動(dòng)故障診斷等內(nèi)容，通過(guò)考試模式的改革和考核標(biāo)準(zhǔn)的變更力求實(shí)現(xiàn)與崗位技能要求的零對(duì)接。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)、分組 L02為貼壁細(xì)胞，用RPMI-1640(含1%鏈霉素+青霉素)培養(yǎng)基配置成含10%FBS的培養(yǎng)液，置于5% CO

、37℃恒溫孵箱，每24 h換液一次。將培養(yǎng)好的細(xì)胞分為3組：正常對(duì)照組、鋁負(fù)荷組[(200 μmol/L Al(malt)3]、MK-571(3 nmol/L)+Al(200 μmol/L)組。

1.2.5 Western Blot檢測(cè)蛋白表達(dá) 按常規(guī)方法操作。

2.2 MK-571作用于鋁負(fù)荷L02肝細(xì)胞ALT、AST、SOD和MDA含量變化 見(jiàn)表1。

所謂“就業(yè)的時(shí)效性”是指學(xué)生在畢業(yè)就業(yè)時(shí)要抓住機(jī)遇及時(shí)就業(yè)，在保證就業(yè)的前提下通過(guò)工作中自身的努力不斷提高自己的業(yè)務(wù)水平，為日后進(jìn)入更好的領(lǐng)域工作打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。而不要高不成低不就最后耽誤自己的前途。

2.3 MK-571對(duì)鋁負(fù)荷L02肝細(xì)胞凋亡的影響 圖2表明，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，鋁負(fù)荷L02肝細(xì)胞凋亡率較對(duì)照組細(xì)胞明顯增加(

<0.01)，而給予MK-571作用后細(xì)胞凋亡率較鋁負(fù)荷組顯著降低(

<0.01)。

1.2.2 MTT法測(cè)細(xì)胞活力 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，接種于96孔板中(100 μl/孔)，待貼壁后進(jìn)行藥物干預(yù)處理。作用36 h后，避光，各孔中加入20 μl MTT，孵箱培養(yǎng)4 h，棄培養(yǎng)液，加DMSO 150 μl，迅速置于避光盒中，放置于水平搖床，充分溶解板中結(jié)晶。最后置于光吸收酶標(biāo)儀，選用490 nm檢測(cè)光密度(OD)值。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，接種于六孔板中密度為5×10

個(gè)/孔，藥物作用36 h后，收集細(xì)胞，離心(1 000 r/min×10 min)，用冷PBS洗滌，重懸。根據(jù)碧云天細(xì)胞凋亡試劑盒按操作說(shuō)明進(jìn)行染色，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

本文的研究對(duì)象是有多種配方，生產(chǎn)煉鋼用鐵水、鑄鐵用鐵水等多種鐵水產(chǎn)品的煉鐵廠，本文對(duì)所研究的問(wèn)題作出以下假設(shè)：

2 結(jié)果

2.1 MK-571對(duì)肝細(xì)胞L02增殖活力的影響 MK-571干預(yù)鋁負(fù)荷肝細(xì)胞L02 36 h后，在3 nmol/L附近有較好的保護(hù)的作用(

<0.01，圖1A)。由圖1B可知在3 μmol/L濃度內(nèi)對(duì)肝細(xì)胞增殖活力影響較正?？瞻讓?duì)照細(xì)胞有差異(

<0.01)，而MK-571濃度≤1 μmol/L則不影響細(xì)胞的活力。因此選取3 nmol/L作為實(shí)驗(yàn)的干預(yù)劑量。

1.2.3 檢測(cè)細(xì)胞ALT、AST、SOD、MDA的含量 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，每孔接種密度為5×10

個(gè)，作用于六孔板中，藥物處理36 h后，收集細(xì)胞混懸液，離心(1 000 r/min×10 min)及PBS洗2次。最后加PBS冰水浴下超聲破碎，收集裂解細(xì)胞，充分混勻，測(cè)定蛋白濃度。將制備好的細(xì)胞勻漿根據(jù)ALT、AST、SOD、MDA試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

長(zhǎng)期以來(lái)，珠江口東西兩岸一直面臨發(fā)展不協(xié)調(diào)的問(wèn)題。東岸經(jīng)濟(jì)發(fā)達(dá)，而西岸經(jīng)濟(jì)發(fā)展相對(duì)落后，產(chǎn)業(yè)和人口聚集度較低，難以形成規(guī)模效益。同時(shí)，粵港澳大灣區(qū)還面臨創(chuàng)新資源分布不均、資源浪費(fèi)嚴(yán)重、發(fā)明創(chuàng)新質(zhì)量不高、跨境創(chuàng)新合作機(jī)制不健全等問(wèn)題，這些短板限制了粵港澳大灣區(qū)的持續(xù)發(fā)展。

2.4 各組L02 肝細(xì)胞中相關(guān)蛋白表達(dá)水平變化 由圖3可知，與正常L02細(xì)胞相比，鋁負(fù)荷細(xì)胞中Caspase 3、Caspase 9、BAX蛋白表達(dá)顯著升高(

<0.05和

<0.01)，而B(niǎo)cl-2顯著降低(

<0.01)；給予MK-571作用，其蛋白表達(dá)Caspase 3、Caspase 9、BAX明顯下調(diào)(

<0.05和

<0.01)，而B(niǎo)cl-2表達(dá)明顯上調(diào)(

<0.05)。

3 討論

氧化應(yīng)激反應(yīng)在引起機(jī)體損傷中發(fā)揮重要作用，是生物體的一種應(yīng)激反應(yīng)。氧化應(yīng)激參與腫瘤、炎癥和代謝綜合征等多種疾病，當(dāng)機(jī)體活性氧(ROS)大量產(chǎn)生，ROS/活性氮的比值增高，不能被機(jī)體抗氧化劑作用抵消，擾亂細(xì)胞氧化還原失去平衡，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能損傷

。據(jù)報(bào)道金屬離子鋁可以影響肝臟氧化應(yīng)激導(dǎo)致肝臟損傷

，課題組前期研究發(fā)現(xiàn)200 μmol/L Al(malt)3作用36 h處理L02肝細(xì)胞可以有效建立鋁負(fù)荷肝細(xì)胞損傷模型

，因此采用這一造模方法用于本次體外實(shí)驗(yàn)研究。

然而,蠕蟲(chóng)狀鏈模型也存在一些不足.由于蠕蟲(chóng)狀鏈用投影長(zhǎng)度來(lái)表示分子鏈尺寸,看上去沒(méi)有用到統(tǒng)計(jì)單元數(shù)的統(tǒng)計(jì)關(guān)系,統(tǒng)計(jì)單元的多寡僅影響其投影的長(zhǎng)度,不影響計(jì)算結(jié)果,因此可用于描述那些因統(tǒng)計(jì)單元數(shù)不足而無(wú)法用等效自由結(jié)合鏈來(lái)處理的分子鏈.但實(shí)際上,不斷投影取最后的投影長(zhǎng)度的方法也是統(tǒng)計(jì)的結(jié)果.這種暗含式的統(tǒng)計(jì)處理方法很隱蔽,使人們?cè)趯⑵溥\(yùn)用到剛性鏈時(shí)沒(méi)有覺(jué)得有什么不妥.

MDA通過(guò)氧自由基代謝產(chǎn)生，其含量反映了體系脂質(zhì)過(guò)氧化進(jìn)展?fàn)顟B(tài)

。SOD可以減少脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)抗氧化作用，主要通過(guò)歧化作用降低體內(nèi)過(guò)多的氧自由基

，因此SOD水平的高低反映了機(jī)體抗氧化能力的強(qiáng)弱。當(dāng)前結(jié)果顯示鋁負(fù)荷L02肝細(xì)胞中MDA含量較正常組顯著增加、SOD活性顯著下降，提示L02肝細(xì)胞處于氧化應(yīng)激損傷狀態(tài)。CysLTR1受體拮抗劑MK-571(3nmol/L)作用36 h后可以有效降低鋁負(fù)荷L02細(xì)胞中ALT、AST、MDA水平，并提高SOD的水平，減輕了鋁負(fù)荷引起的L02肝細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)，使鋁負(fù)荷細(xì)胞的凋亡率明顯降低。

細(xì)胞凋亡是肝損傷發(fā)生的重要機(jī)制之一，在細(xì)胞凋亡調(diào)控過(guò)程中Caspase系統(tǒng)及Bcl-2家族在起到關(guān)鍵作用。Ghribi等

研究表明鋁誘導(dǎo)的兔子中呈現(xiàn)出上調(diào)Bax，下調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)趨勢(shì)。也有研究發(fā)現(xiàn)鋁可以直接調(diào)控Bax以及Bcl-2 mRNA的表達(dá)，其與BAX成正相關(guān)，而與Bcl-2成負(fù)相關(guān)

。在Bcl-2家族的中，Bcl-2和Bax分別為凋亡的抑制因子和促進(jìn)因子，Bcl-2蛋白存在于外部線(xiàn)粒體膜，可以防止凋亡并抑制Bax的激活

。而Caspase-9作為細(xì)胞凋亡重要的啟動(dòng)子，當(dāng)機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)時(shí)，通過(guò)活化并激活下游Caspase家族凋亡因子，產(chǎn)生級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)，促使細(xì)胞發(fā)生凋亡

。已有研究表明Caspase3、Bcl-2與鋁致肝損傷機(jī)制密切相關(guān)，鋁誘導(dǎo)肝毒性大鼠中Caspase3蛋白表達(dá)會(huì)顯著增加，而B(niǎo)cl-2蛋白表達(dá)降低

。在本次實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)細(xì)胞流式技術(shù)我們發(fā)現(xiàn)給予MK-571可以有效減少鋁負(fù)荷肝細(xì)胞L02凋亡率，并且鋁負(fù)荷L02肝細(xì)胞中蛋白Caspase3、Caspase9和Bax顯著上升，Bcl-2表達(dá)明顯下降。給予MK-571干預(yù)后顯著下調(diào)了鋁負(fù)荷L02肝細(xì)胞中Caspase3、Caspase9、Bax表達(dá)，上調(diào)了Bcl-2的表達(dá)。

[1]Bogdanovic M, Janeva AB, Bulat P. Histopathological changes in rat liver after a single high dose of aluminium[J]. Arh Hig Rada Toksikol, 2008, 59(2): 97-101.

[2]Luo J, Li X, Li X,

. Selenium-Rich Yeast protects against aluminum-induced peroxidation of lipide and inflammation in mice liv-er[J]. Biometals，2018, 31(6): 1051-1059.

[3]Ding Y, Tang J, You X,

. Study on the mechanism underlying Al-induced hepatotoxicity based on the identification of the Al-binding proteins in liver[J]. Metallomics，2019, 11(8):1353-1362.

[4]Yang Y, Wang H, Guo Y,

. Metal ion imbalance-related oxidative stress is involved in the mechanisms of liver injury in a rat model of chronic aluminum exposure[J]. Bio Trace Elem Res, 2016, 173(1):126-131.

[5]Yang Y, He Q, Wang H,

.The protection of meloxicam against chronic aluminium overload-induced liver injury in rats [J]. Oncotarget, 2017, 8(14):23448-23458.

[6]Zahedi-Amiri Z,Taravati A,HejazianL B.Protective effect of rosa damascene against aluminium chloride-induced oxidative stress[J].Biol Trace Elem Res，2018,187:27-127.

[7]Pu S, Liu Q, Li Y,

. Montelukast prevents mice against acetaminophen-induced liver injury[J]. Front Pharmacol, 2019, 10:1070.

[8]吳深寶，朱旭星，王向明，等. 孟魯司特對(duì)大鼠腸缺血再灌注繼發(fā)肝損傷的保護(hù)作用研究[J]. 中國(guó)臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2016，21(3)：270-275.

[9]Fu JQ, Zhang H, Zhuang Y,

．The role of N-acetyltransferase 8 in mesenchymal stem cell-based therapy for liver ischemia/reperfusion injury in rats[J]．PLoS One, 2014, 9(7): e103355.

[10]Hu C, Yang J, He Q,

. CysLTR1 blockage ameliorates liver injury caused by aluminum-overload via PI3K/AKT/mTOR-mediated autophagy activation in vivo and in vitro[J]. Mol Pharm, 2018, 15(5):1996-2006.

[11]Pisoschi AM, Pop A. The role of antioxidants in the chemistry of oxidative stress: A review[J]. Eur J Med Chem，2015, 97:55-74.

[12]巴圖德力根，張偉，韓志強(qiáng)，等. 蒙藥德都紅花7味散對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)性脂肪肝大鼠血脂四項(xiàng)和SOD、MDA 的影響[J].世界華人消化雜志，2015，23(31): 5011-5016．

[13]鄧青芳,周欣,陳華國(guó).多糖抗肝損傷作用及其機(jī)制研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)中藥雜志，2016， 41(16): 2958-2967.

[14]Ghribi O, DeWitt DA, Forbes MS,

. Co-involvement of mitochondria and endo-plasmic reticulum in regulation of apoptosis: Changes in cytochrome, Bcl-2 and Bax in the hippocampus of aluminum-treated rabbits[J]. Brain Research, 2001, 903(1-2): 66-73.

[15]Niu Q, Wang LP, Chen YL,

. Relationship between apoptosis of rat hippocampus cells induced by aluminum and the copy of the Bcl-2 as well as bax mRNA[J]. Wei Sheng Yan Jiu, 2005, 34(6):671-673.

[16]Lindsay J, Esposti MD, Gilmore, AP. Bcl-2 proteins and mitochondria-specificity in membrane targeting for death[J]. Biochimica et Biophysica Acta, 2011, 1813(4): 532-539.

[17]Korsmeyer SJ, Shutter JR, Veis DJ,

. Bcl-2/Bax: a rheostat that regulates an anti-oxidant pathway and cell death[J]. Semin Cancer Biol, 1993, 4(6): 320-327.

[18]Mak YT, Chan WY, Lam WP,

. Immunohistological evidences of Ginkgo biloba extract altering Bax to Bcl‐2 expression ratio in the hippocampus and motor cortex of senescence accelerated mi-ce[J]. Microsc Res Techniq, 2006, 69(8): 601-605.

[19]Al-Kahtani M, Abdel-Daim MM, Sayed AA,

. Curcumin phytosome modulates aluminum-induced hepatotoxicity via regulation of antioxidant, Bcl-2, and caspase-3 in rats[J]. Environ Sci Pollut Res Int, 2020, 27(17):21977-21985.