劉鵬程，張 繼，邱淦遠(yuǎn)，龔 俞，李雪松，李 維，張依裕，劉若余，*

(1.貴州大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院,高原山地動物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550025；2.貴州省畜禽遺傳資源管理站，貴州 貴陽 550001)

生物體的生長發(fā)育受到外界營養(yǎng)條件和體內(nèi)信號通路等多方面的調(diào)控，其中雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，mTOR信號通路可對細(xì)胞外包括生長因子、營養(yǎng)素、胰島素、氨基酸、葡萄糖等多種刺激產(chǎn)生應(yīng)答，在細(xì)胞中通過mTORC1和mTORC2兩種復(fù)合物發(fā)揮作用。其中，mTORC1信號通路能夠感受一系列細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境因素的變化，如能量水平、氨基酸濃度、生長因子等，進(jìn)而通過蛋白質(zhì)合成、脂肪生成、能量代謝、抑制自噬作用調(diào)節(jié)細(xì)胞生長；對mTORC2的研究較少，其主要在肌動蛋白細(xì)胞骨架、細(xì)胞存活及代謝等方面發(fā)揮重要作用。TBC1D7(TBC1 domain family，member 7)是tre2-bub2-cdc 16結(jié)構(gòu)域家族成員7，有研究證明TBC1D7是mTORC1上游TSC1-TSC2復(fù)合體的第三個子單元。近年來有研究發(fā)現(xiàn)，17基因?qū)ιn蠅和小鼠的生長存在調(diào)控作用，在果蠅中可調(diào)控ILP2(insulin like pepdite 2)的合成與分泌，并且不依賴于TSC復(fù)合物，進(jìn)而會影響果蠅個體的生長發(fā)育、衰老和壽命，在敲除17基因后果蠅和小鼠呈現(xiàn)個體變大和壽命變短的現(xiàn)象。可見，17基因在動物的生長發(fā)育中起調(diào)控作用，但17基因調(diào)控畜禽的生長發(fā)育還未檢索到相關(guān)研究。

關(guān)嶺牛是主產(chǎn)于貴州省關(guān)嶺縣的優(yōu)質(zhì)地方黃牛品種，是貴州省四大黃牛之一，因具有肉質(zhì)優(yōu)良、體質(zhì)健壯、耐粗飼和耐役用等優(yōu)點(diǎn)而受到人們青睞。但其也存在體型較小，后軀欠發(fā)達(dá)，生長性能較差等不足。因此，充分利用中國地方品種優(yōu)勢，并應(yīng)用現(xiàn)代生物技術(shù)快速培育生長速度快、屠宰率和凈肉率高的新型地方黃牛品種(系)，是肉牛選育的重要方向。DNA混合池是將提取到同樣特質(zhì)的個體DNA按比例混合得到的，再經(jīng)PCR擴(kuò)增測序后可以直接檢測SNPs，該方法成本低且效率高。

17基因定位于牛的23號染色體，為了研究17基因的性質(zhì)和功能，以便后續(xù)深入探究其對關(guān)嶺牛生長性狀的影響，提高關(guān)嶺牛分子輔助選擇效率。本實(shí)驗(yàn)以關(guān)嶺牛為研究對象，采用DNA混合池和直接測序法對關(guān)嶺牛17基因單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)(single nucleotide polymorphism sites，SNPs)進(jìn)行篩選，并對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，探究該基因編碼蛋白理化性質(zhì)、功能信息、遺傳特性。為后續(xù)在細(xì)胞水平、基因編輯方向研究17基因與對牛生長性狀的調(diào)控提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 血樣采集與DNA提取

在貴州省關(guān)嶺縣關(guān)嶺牛核心育種場對109頭關(guān)嶺牛進(jìn)行尾根靜脈采血。采用DNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)從凍存關(guān)嶺牛血樣中提取基因組DNA，采用UV2100紫外分光光度計(jì)(廈門群創(chuàng)科技有限公司)檢測每個DNA樣品濃度，基因組DNA以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中牛的17基因序列(登錄號NC_037350.1)，利用Primer primer 5.0設(shè)計(jì)10對特異性引物(表1)，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 關(guān)嶺牛TBC1D7基因引物信息

1.3 DNA混合池構(gòu)建及PCR擴(kuò)增

取109個單樣母液DNA各5 μL構(gòu)建DNA混合池，以DNA混合池為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系共20 μL，其中:模板DNA 1 μL，2×PCR Master Mix 10 μL，上下游引物各1 μL，蒸餾水7 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性6 min；94 ℃變性30 s，63 ℃退火50 s，72 ℃延伸5 min，30個循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。

1.4 SNPs位點(diǎn)篩查與等位基因頻率估算

用凝膠回收試劑盒純化回收PCR產(chǎn)物后送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果用DNAStar軟件中的MegAlign和Editseq程序進(jìn)行比對和拼接，獲得關(guān)嶺牛17基因編碼區(qū)序列。采用Chromas軟件查看測序圖譜，MWSnap序列分析軟件標(biāo)尺測量關(guān)嶺牛17基因各突變位點(diǎn)等位基因峰圖高度，對各等位基因頻率進(jìn)行估算。

1.5 生物信息學(xué)分析

參照文獻(xiàn)[7-9]通過在線軟件(RNAfold web server)預(yù)測關(guān)嶺牛17基因mRNA二級結(jié)構(gòu)；運(yùn)用 ExPASy 服務(wù)器分析關(guān)嶺牛TBC1D7蛋白理化性質(zhì)、親水性和疏水性；用 TMHMM 軟件預(yù)測關(guān)嶺牛TBC1D7蛋白跨膜結(jié)構(gòu)；采用 SignalP 4.0在線工具對關(guān)嶺牛TBC1D7蛋白進(jìn)行信號肽預(yù)測；利用NetNGlyc 1.0 Server在線軟件預(yù)測關(guān)嶺牛TBC1D7蛋白的N-糖基化位點(diǎn)；用SOPMA軟件預(yù)測關(guān)嶺牛TBC1D7蛋白二級結(jié)構(gòu)。運(yùn)用在線網(wǎng)站SMART與STRING分別預(yù)測17基因編碼蛋白功能結(jié)構(gòu)域和相關(guān)互作蛋白。

2 結(jié)果與分析

2.1 關(guān)嶺牛TBC1D7基因DNA混合池PCR擴(kuò)增結(jié)果

采用分段擴(kuò)增方法獲得包含關(guān)嶺牛17基因CDS區(qū)的10段基因片段，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，條帶單一且明亮清晰，特異性好。產(chǎn)物大小分別為397、248、197、245、250、226、227、938、783、478 bp，與目標(biāo)片段大小一致(圖1)。

M，DL2000 DNA marker; 1～8.3，引物P1～P8.3的 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

2.2 關(guān)嶺牛TBC1D7基因測序結(jié)果

根據(jù)測序峰圖，將關(guān)嶺牛17基因測序與NCBI中公布的牛17基因CDS區(qū)序列進(jìn)行比對，以該基因CDS區(qū)第1位堿基開始計(jì)數(shù)的方式命名。在第5外顯子發(fā)現(xiàn)2個SNPs，分別為c.402T>C、c.414A>G。在第6外顯子發(fā)現(xiàn)2個SNPs，分別為c.609C>T、c.648T>C。由于突變位點(diǎn)核苷酸的密碼子簡并現(xiàn)象，4個位點(diǎn)的突變都未引起編碼氨基酸的改變，均屬同義突變(圖2)。

圖2 關(guān)嶺牛TBC1D7基因測序結(jié)果

2.3 等位基因頻率估算

由表2可知，關(guān)嶺牛17基因5個突變位點(diǎn)的等位基因頻率在突變前后皆存在差異，對比發(fā)現(xiàn)，c.402T>C位點(diǎn)突變前后等位基因頻率差異最大為0.218 4，c.414A>G位點(diǎn)次之。c.609C>T和c.648T>C位點(diǎn)突變前后等位基因頻率差異較小。

表2 關(guān)嶺牛TBC1D7基因突變位點(diǎn)等位基因頻率估算

2.4 生物信息學(xué)分析

2.4.1 關(guān)嶺牛17基因mRNA二級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析

通過在線軟件(RNAfold web server)預(yù)測參考序列(XP_027306738.1)，對比參考序列和關(guān)嶺牛17基因4個SNPs 的mRNA二級結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明，SNPs 突變后引起mRNA二級結(jié)構(gòu)改變，并導(dǎo)致mRNA二級結(jié)構(gòu)的最小自由能發(fā)生改變(圖3)。其中c.402T>C、c.414A>G、c.609>T和c.648T>C分別導(dǎo)致mRNA二級結(jié)構(gòu)的最小自由能由突變前的-991.40 kcal·mol變?yōu)?993.20 kcal·mol、-992.70 kcal·mol、-993.30 kcal·mol和-990.20 kcal·mol。

圖3 關(guān)嶺牛TBC1D7基因mRNA 二級結(jié)構(gòu)

2.4.2 關(guān)嶺牛TBC1D7蛋白的理化性質(zhì)預(yù)測分析

關(guān)嶺牛17基因CDS 區(qū)全長882 bp，包含1個完整地開放閱讀框(open reading frame，ORF)，既有起始密碼子也有終止密碼子，編碼氨基酸293個，蛋白質(zhì)分子式為CHNOS，分子量約為33 904.44 ku，理論等電點(diǎn)(pI)約為6.76，半衰期30 h，不穩(wěn)定指數(shù)為52.53。由表3可知，亮氨酸數(shù)量最多，共35個，占整個氨基酸組成的11.9%;色氨酸數(shù)量最少，占整個氨基酸組成的1.7%，正電荷殘基總數(shù)(Arg+Lys)37個，負(fù)電荷殘基總數(shù)(Asp+Glu)38個。

表3 TBC1D7基因編碼蛋白的氨基酸組成

2.4.3 關(guān)嶺牛TBC1D7蛋白疏水性/親水性預(yù)測分析

據(jù)預(yù)測圖(圖4)可知。第238位的纈氨酸(Val)疏水性最強(qiáng)為(2.944)，第83位的天冬氨酸(Asp)親水性最強(qiáng)為(-2.556)。在整條肽鏈中，親水性氨基酸占62.46%，疏水性氨基酸占37.54%，總體表現(xiàn)為親水性。由此可預(yù)測關(guān)嶺牛TBC1D7蛋白為一種可溶性蛋白。

正值表示疏水，負(fù)值表示親水。

2.4.4 關(guān)嶺牛TBC1D7蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測分析

采用TMHMM在線跨膜運(yùn)輸軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果顯示，組成TBC1D7蛋白的293位氨基酸均在膜內(nèi)，不存在跨膜區(qū)域，故關(guān)嶺牛TBC1D7蛋白不是跨膜蛋白(圖5)。

圖5 TBC1D7蛋白跨膜區(qū)域分析

2.4.5 關(guān)嶺牛TBC1D7蛋白的信號肽預(yù)測分析

采用 SignalP 4.0在線工具對關(guān)嶺牛TBC1D7蛋白進(jìn)行信號肽預(yù)測，分析結(jié)果主要涉及3個值：C、S和Y。其中C 值是剪切位點(diǎn)的值，每個氨基酸會有一個C值，剪切位點(diǎn)處的C值最高。每個氨基酸對應(yīng)1個S值，在結(jié)果顯示的圖標(biāo)中有一個曲線顯示S值的變化趨勢，信號肽區(qū)域的S值較高，可用S平均值判斷確定分泌蛋白(若S平均值高于0.5，預(yù)測存在信號肽)。Y值是綜合考慮S值和C值的一個參數(shù)最大值，可以分析判斷信號肽剪切位置。由圖6可知，C值、S值和Y值均較低，結(jié)果說明，關(guān)嶺牛17基因編碼的蛋白不存在信號肽，為非分泌蛋白。

圖6 關(guān)嶺牛TBC1D7基因編碼蛋白的信號肽預(yù)測

2.4.6 關(guān)嶺牛TBC1D7蛋白的N-糖基化位點(diǎn)預(yù)測分析

如圖7，關(guān)嶺牛17基因編碼蛋白中存在6個潛在的N-糖基化位點(diǎn)。分別是Asn8、Asn160、Asn163、Asn182、Asn254和Asn265。蛋白質(zhì)糖基化修飾不僅影響蛋白質(zhì)的空間構(gòu)想、生物活性、運(yùn)輸和定位，而且在分子識別、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞免疫等特定生物過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。

圖7 關(guān)嶺牛TBC1D7基因編碼蛋白的N-糖基化位點(diǎn)預(yù)測

2.4.7 關(guān)嶺牛TBC1D7蛋白二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析

蛋白二級結(jié)構(gòu)是依靠不同氨基酸之間的氫鍵形成的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。關(guān)嶺牛17基因編碼蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測如下(圖8)。結(jié)果顯示，關(guān)嶺牛17基因編碼蛋白包含4種二級結(jié)構(gòu)。其中α-螺旋占66.89%(196個氨基酸)；無規(guī)則卷曲占25.60%(75個氨基酸)；β-轉(zhuǎn)角占4.44%(13個氨基酸)，另外的9個氨基酸(4.44%)構(gòu)成延伸鏈。高含量的α-螺旋對蛋白空間穩(wěn)定性產(chǎn)生了重要作用。

h，α-螺旋; e，延伸鏈; t，β-轉(zhuǎn)角; c，無規(guī)則卷曲。

通過SWISS-MODEL同源建模獲得關(guān)嶺牛17基因編碼蛋白三級結(jié)構(gòu)模型，由圖9可見，關(guān)嶺牛17基因編碼蛋白主要由α-螺旋和無規(guī)則卷曲構(gòu)成，符合二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果。

圖9 TBC1D7基因編碼蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

2.4.8 關(guān)嶺牛TBC1D7蛋白功能結(jié)構(gòu)域及互作蛋白預(yù)測分析

運(yùn)用在線網(wǎng)站SMART預(yù)測17基因編碼蛋白功能結(jié)構(gòu)域，結(jié)果顯示，17基因編碼蛋白只存在一個RabGAP-TBC結(jié)構(gòu)域(圖10)。運(yùn)用STRING在線工具對關(guān)嶺牛17基因編碼蛋白進(jìn)行互作蛋白預(yù)測。結(jié)果表明，關(guān)嶺牛17基因編碼蛋白存在互作的蛋白有TSC1、TSC2、RHEB、AKT1、AKT2、AKT3、RPS6KA1、RPS6KA2、RPS6KA3、DDIT4等(圖11)。

圖10 TBC1D7基因編碼蛋白功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測分析

圖11 關(guān)嶺牛TBC1D7基因編碼蛋白互作網(wǎng)絡(luò)預(yù)測

3 討論

TBC1D7的結(jié)構(gòu)功能研究表明，TBC1D7可以穩(wěn)定結(jié)合TSC1蛋白C末端區(qū)域，促使后者發(fā)生二聚化并維持此二聚結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。有研究表明，AKT可通過磷酸化TBC1D7蛋白第124位絲氨酸的方式調(diào)控TBC1D7蛋白與14-3-3ζ及β-TrCP2的相互作用，而14-3-3ζ可與mTORC1復(fù)合物中Raptor亞基相互作用來抑制mTORC1的激酶活性。生長因子受體信號傳導(dǎo)和細(xì)胞的整體代謝狀態(tài)在細(xì)胞質(zhì)中由mTORC1的機(jī)械靶點(diǎn)進(jìn)行協(xié)調(diào)。當(dāng)TSC1-TSC2-TBC1D7(TSC-TBC)復(fù)合物形成時，它通過其GTP酶激活蛋白(GAP)結(jié)構(gòu)域抑制mTORC1活性，蓋中朝等的研究證實(shí)了TBC1D7的表達(dá)量與mTORC1活性呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。

在真核生物細(xì)胞控制分解代謝和合成代謝的過程中，mTOR信號通路是關(guān)鍵的通路之一，在細(xì)胞生長、增殖等生理過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，而TBC1D7作為mTOR信號通路中的重要組件，會不會也對細(xì)胞乃至機(jī)體的生長發(fā)育產(chǎn)生影響呢？2017年任肅霞研究發(fā)現(xiàn)，17基因可以通過調(diào)節(jié)胰島素肽2(insulin like pepdite 2，ILP2)信號的方式調(diào)節(jié)蒼蠅和小鼠的生長，且該過程不依賴于TSC復(fù)合物。17基因調(diào)節(jié)哺乳動物生長發(fā)育已經(jīng)在小鼠上得到驗(yàn)證，由于17基因在人、小鼠和果蠅中的功能有較強(qiáng)的保守性，可以猜想17基因?qū)Υ笮图倚蟮臋C(jī)體生長發(fā)育也可能存在調(diào)控作用，或許能作為候選基因以提高牛生長發(fā)育性狀的分子標(biāo)記輔助選擇。

SNPs是基因組水平上單個核苷酸的突變，對其進(jìn)行研究和分析對研究基因的功能和指導(dǎo)選種選育具有重要意義。DNA混合池?cái)U(kuò)增后直接測序是一種簡單有效SNP位點(diǎn)篩選方法。本研究通過DNA混合池?cái)U(kuò)增后直接測序的方法在關(guān)嶺牛17基因第5和第6外顯子中共檢測到4個同義突變位點(diǎn)，分別為c.402T>C、c.414A>G、c.609C>T和c.648T>C，在其余外顯子中未發(fā)現(xiàn)SNPs，4個SNPs由于關(guān)嶺牛17基因比較保守，以及氨基酸密碼子存在簡并性均未引起編碼氨基酸變異，但這些變異位點(diǎn)可能對RNA剪接、穩(wěn)定性和折疊等產(chǎn)生影響，進(jìn)而影響基因的表達(dá)與生理功能。

蛋白質(zhì)是生命活動的主要載體，其結(jié)構(gòu)與機(jī)體生長、發(fā)育等功能密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，關(guān)嶺牛TBC1D7蛋白由293個氨基酸折疊而成；為親水的可溶性蛋白；不穩(wěn)定指數(shù)52.53(>40)，為不穩(wěn)定蛋白。通常情況下，蛋白質(zhì)穩(wěn)定性與半衰期是呈正相關(guān)的，在本研究中，關(guān)嶺牛TBC1D7蛋白為不穩(wěn)定蛋白卻有相對較長的半衰期(30 h)，這可能與TBC1D7蛋白的氨基酸結(jié)構(gòu)組成和在機(jī)體中多種生理功能的發(fā)揮有關(guān)系。

基因編碼區(qū)中的核苷酸突變可能導(dǎo)致mRNA二級結(jié)構(gòu)的改變，進(jìn)而影響其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能。本研究發(fā)現(xiàn)，關(guān)嶺牛17基因4個位點(diǎn)突變前后mRNA二級結(jié)構(gòu)和自由能均發(fā)生了改變并影響其結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。其中c.402T>C、c.414A>G、c.609C>T突變分別使mRNA自由能降低了1.8、1.3和1.9 kcal·mol，導(dǎo)致mRNA二級結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性升高；c.648T>C突變使mRNA自由能增加了1.2 kcal·mol，即穩(wěn)定性降低。mRNA二級結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的變化可能會對基因的表達(dá)效率產(chǎn)生影響，這些影響均有可能對17基因?qū)ε５纳L以及其他性狀帶來關(guān)聯(lián)性的改變。蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)是多肽主鏈骨架原子沿一定的軸盤旋或折疊而形成的特定的構(gòu)象。本研究中關(guān)嶺牛17基因編碼蛋白的二級結(jié)構(gòu)主要由196個氨基酸構(gòu)成的α-螺旋、75個氨基酸構(gòu)成的無規(guī)則卷曲、13個氨基酸構(gòu)成的β-轉(zhuǎn)角和9個氨基酸構(gòu)成的延伸鏈組成。其中α-螺旋結(jié)構(gòu)含量最高，達(dá)到了66.89%，這對蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性具有重要作用。本研究關(guān)嶺牛17基因編碼蛋白中未發(fā)現(xiàn)信號肽，揭示該蛋白可能是一種定位于細(xì)胞器基質(zhì)或細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中的非分泌蛋白。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，關(guān)嶺牛17基因編碼蛋白中存在6個潛在的N-糖基化位點(diǎn)，會對分子識別、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞免疫等多種生命功能產(chǎn)生影響。綜上，關(guān)嶺牛17基因編碼區(qū)具有4個SNPs，并且影響了mRNA二級結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，預(yù)測結(jié)果顯示其編碼蛋白為不穩(wěn)定的非分泌蛋白，后續(xù)將收集關(guān)嶺牛的表型數(shù)據(jù)，篩選影響生長發(fā)育性狀的位點(diǎn)。