年青性染色體及鑒定方法

楚張卿 ，羅瑋 ，夏云

（1.中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所,成都 610041;2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué),北京 100049;3.綿陽(yáng)師范學(xué)院生態(tài)安全與保護(hù)四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,四川 綿陽(yáng) 621000）

脊椎動(dòng)物的性別決定機(jī)制一般可以分為2種，即遺傳性別決定和環(huán)境性別決定（Marshall，2008）。哺乳動(dòng)物和鳥類的性別是遺傳性別決定型且性染色體對(duì)高度異形化，如哺乳動(dòng)物的性別決定系統(tǒng)是XX/XY型，即雄性異配，該系統(tǒng)中Y染色體高度退化；而鳥類的性別決定系統(tǒng)為ZZ/ZW型，即雌性異配，且W染色體高度退化。不同于哺乳動(dòng)物和鳥類中高度異形化的性染色體，冷血脊椎動(dòng)物魚類、兩棲類以及爬行類中大部分物種的性染色體在形態(tài)上既無太大差異，也未發(fā)生顯著的分化（Hillis&Green，1990；Schmid&Steinlein，2001；Devlin&Nagahama，2002；Eggert，2004）。這種分化程度較低的性染色體被稱為“年青性染色體”，即在性染色體分化后相當(dāng)長(zhǎng)的一段時(shí)間里，染色體形態(tài)及基因容量并無明顯變化。

經(jīng)典的性染色體分化模型認(rèn)為，性染色體通常是由常染色體進(jìn)化而來，常染色體對(duì)中的1條染色體因突變?cè)谂既婚g獲得了性別決定基因，如、或等（Charlesworth.，2005；Bachtrog.，2011；Bellott.，2014），該常染色體對(duì)就具備了一定的性別決定功能，被稱為原始的性染色體（Beukeboom&Perrin，2014），該基因及其周圍的部分區(qū)域之間的重組開始受到抑制，即重組抑制，以此來保護(hù)原始性染色體上的性別決定區(qū)域（Graves，2006）。隨后性別拮抗基因在性別決定區(qū)域周圍聚集，導(dǎo)致重組抑制區(qū)域沿著Y/W染色體逐漸擴(kuò)大（Charlesworth.，2005），同時(shí)丟棄大量的無功能基因，并最終演變?yōu)樾螒B(tài)上高度分化的異態(tài)形性染色體對(duì)（Bachtrog，2006，2013），如哺乳動(dòng)物和鳥類中常見的高度異形化的Y或W染色體。因此重組抑制是性染色體分化的第一個(gè)階段，也是最關(guān)鍵的一個(gè)階段（Rice，1987），并隨著其周圍的性別拮抗基因和性別決定基因遺傳給下一代。

經(jīng)典的性染色體分化模型是從模式生物中的穩(wěn)定且高度分化的性染色體對(duì)形成的模式提出的，如哺乳動(dòng)物、果蠅等，但與哺乳動(dòng)物和鳥類中高度分化的性染色體相比，魚類、兩棲類以及爬行類中大部分物種的性染色體的形態(tài)差異不大（Hillis&Green，1990；Schmid&Steinlein，2001；Devlin&Nagahama，2002；Eggert，2004）。而且性別決定系統(tǒng)或性染色體在這些類群中的不同科、屬之間也存在差異，甚至在同一物種的不同地理種群中也不同（Ogata.，2003；Tanaka.，2007）。雖然有關(guān)魚類、兩棲類以及爬行類性染色體和性別決定的研究已經(jīng)很多，但大多都集中于性染色體容易辨別的類群。由于年青性染色體在形態(tài)上難以識(shí)別，擁有這一類性染色體的非模式物種的性別決定和性染色體研究仍有許多未解之謎，但隨著技術(shù)的發(fā)展（如高通量測(cè)序技術(shù)），關(guān)于年青性染色體研究也逐漸成為性染色體研究的熱點(diǎn)，為性染色體進(jìn)化提供了更全面的材料。

1 年青性染色體

經(jīng)典性染色體進(jìn)化假說，從提出到現(xiàn)在一直統(tǒng)治著整個(gè)性染色體進(jìn)化的理論研究，該假說的確在少數(shù)特化類群中得到了很好的驗(yàn)證，如鳥類和哺乳動(dòng)物，同時(shí)也引發(fā)了有關(guān)“性染色體生來就是要被毀滅的”世紀(jì)大討論（Aitken&Marshall，2002；Steinemann&Steinemann，2005）。但隨著染色體研究技術(shù)的不斷突破以及對(duì)大量非模式物種的研究，研究者發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)具有年青同形性染色體（Vicoso&Bachtrog，2013）的物種中有大量未發(fā)生退化的同形性染色體。例如，魚類中90%物種的性染色體（Devlin&Nagahama，2002）、兩棲類中96%物種的性染色體為同形染色體（Hillis&Green，1990；Schmid&Steinlein，2001；Eggert，2004）。目前，對(duì)于這種年青性染色體普遍存在現(xiàn)象的解釋，主要有性染色體“高頻轉(zhuǎn)換”假說和“不老泉”假說。比較基因組研究表明，性染色體在基因組中的位置往往是不穩(wěn)定的，且經(jīng)常在染色體之間發(fā)生轉(zhuǎn)換（Bachtrog.，2014）。因而，推測(cè)同形性染色體之間的高頻轉(zhuǎn)換才是性染色體進(jìn)化的常態(tài)，而當(dāng)性染色體對(duì)之間的分化偶然超過某個(gè)閾值時(shí)，會(huì)掉入進(jìn)化陷阱，這種情形下，性染色體的轉(zhuǎn)換將被終止，性染色體繼續(xù)退化而最終異形化（圖 1）（Abbott，2017；Vicoso，2019）。因此，有學(xué)者提出，性染色體長(zhǎng)期處于一種快速的新舊替換狀態(tài)，沒有足夠的時(shí)間走向退化，從而維持其形態(tài)不變，保持著不斷更新的“年青”狀態(tài)（Volff.，2007；Vicoso，2019）。對(duì)多個(gè)支系進(jìn)行的比較基因組學(xué)研究顯示，一些演化支系的確已經(jīng)發(fā)生了頻繁的性染色體轉(zhuǎn)換事件，包括兩棲類（Hillis&Green，1990；Jeffries.，2018）、爬 行 類（Gamble.，2015）和魚類（Myosho.，2015）。Gamble等（2015）在12種壁虎中發(fā)現(xiàn)了17～24次的性別決定系統(tǒng)的轉(zhuǎn)化。Hillis和Green（1990）通過對(duì)63種蛙和蠑螈的性別決定系統(tǒng)類型分析，揭示了在兩棲動(dòng)物系統(tǒng)發(fā)育史上，性別發(fā)育系統(tǒng)從祖先的雌性異配型系統(tǒng)轉(zhuǎn)換為雄性異配型系統(tǒng)，至少發(fā)生了8次轉(zhuǎn)換。Jeffries等（2018）對(duì)蛙科Ranidae中的28個(gè)物種性別決定系統(tǒng)的研究，發(fā)現(xiàn)了至少13次性別決定系統(tǒng)轉(zhuǎn)換事件，其中11次是XY與XY之間的轉(zhuǎn)換。Roco等（2015）在熱帶爪蟾中曾發(fā)現(xiàn)了至少3種性染色體，且第三種性染色體處于過渡形態(tài)，存在于2個(gè)性別決定系統(tǒng)之間（Schartl，2015）。Miura等（2016）觀察到，轉(zhuǎn)換現(xiàn)象在粗皮蛙中也曾多次發(fā)生，因?yàn)樵谠撐锓N中，同時(shí)存在XX/XY和ZZ/ZW 2種性別決定系統(tǒng)。

圖1 性染色體形成的主流理論模型及性染色體轉(zhuǎn)換（參考Abbott等，2017）Fig.1 The classical theoretical model of sex chromosome formation and sex chromosome transitions(referring to Abbott et al.，2017)

另一種假說是由Perrin（2009）提出的“不老泉”假說，該假說認(rèn)為性反轉(zhuǎn)個(gè)體中性染色體的偶然重組事件，維持著性染色體的同形狀態(tài)。即使性染色體沒有在異配性別中重組（如XY雄性），它們也可能在性反轉(zhuǎn)個(gè)體（如XY雌性）中重組，因?yàn)橹亟M模式取決于表型而不是基因型性別（Kondo.，2001；Lynn.，2005；Campos-Ramos.，2009；Matsuba.，2010）。St?ck等（2011）對(duì)3種近緣的歐洲雨蛙（、、）的研究發(fā)現(xiàn)，這3個(gè)物種都具有相同的同態(tài)形性染色體對(duì)，在雄性中完全不存在X-Y重組。盡管如此，X染色體和Y染色體之間的性別連鎖位點(diǎn)序列并沒有顯示出差異。在系統(tǒng)發(fā)育分析中，X和Y等位基因是根據(jù)物種聚集的，而不是按配子進(jìn)行聚類。因此推測(cè)這些樹蛙的性染色體同態(tài)不是高頻轉(zhuǎn)換造成的，而是通過偶然的X-Y重組保持性染色體形態(tài)上的穩(wěn)定。St?ck等（2013）在4種蟾蜍（、、、）中也發(fā)現(xiàn)了相同的性染色體偶然重組模式。

2 年青性別決定系統(tǒng)及性染色體的鑒定

對(duì)于性染色體分化程度高的物種來說，可以通過常規(guī)的核型分析鑒定性染色體和性別決定系統(tǒng)（李樹深，胡健生，1999）。核型上的差異包括染色體數(shù)目差異（如XO）、染色體長(zhǎng)度的差異、著絲粒位置差異、染色體長(zhǎng)臂和短臂比值差異、甚至次縊痕差異等。與哺乳動(dòng)物高度異化的性染色體不同，絕大多數(shù)的魚類和兩棲類存在年青性染色體，其在形態(tài)上的分化程度很低（即同形的性染色體）（Miura，2017），傳統(tǒng)的細(xì)胞遺傳學(xué)方法難以從核型形態(tài)上進(jìn)行區(qū)分，僅部分可以通過G-帶、C-帶、Ag-NORs以及R-帶等帶型識(shí)別。這些帶型反映了性染色體分化的程度，在部分物種中呈現(xiàn)兩性差異，從而鑒定出同形性染色體（王子淑等，1983；李樹深，胡健生，1996；張加一，谷曉明，1997）。但基于細(xì)胞遺傳學(xué)的帶型制作過程繁瑣，結(jié)果準(zhǔn)確率不高。

除了傳統(tǒng)的帶型分析以外，由于在性別決定區(qū)域存在序列差異，以及雌雄之間在基因表達(dá)層面也存在差異，多種基于高通量測(cè)序的方法也可用于判斷性別決定系統(tǒng)和性染色體，分別是（1）基于DNA/RNA序列差異；（2）基于RNA表達(dá)差異；（3）基于蛋白質(zhì)表達(dá)產(chǎn)物差異以及基于蛋白質(zhì)組和代謝組之間的差異進(jìn)行篩選區(qū)分。這些新興的技術(shù)并不基于性染色體是否異形，大大提高了鑒定年青性染色體的效率。

2.1 比較DNA/RNA分子序列方法

高通量測(cè)序技術(shù)，包括DNA和RNA測(cè)序，已被大量用于性別連鎖分子標(biāo)記篩選和性別決定系統(tǒng)的鑒定。目前運(yùn)用該技術(shù)已開發(fā)出大量的特異性分子標(biāo)記，進(jìn)行性別決定系統(tǒng)及性染色體的鑒定（Palmer.，2019）。

2.1.1 基于分子標(biāo)記 通過篩選含有多態(tài)性的微衛(wèi)星位點(diǎn)，再將多個(gè)雌雄個(gè)體進(jìn)行等位基因分型，若雌雄含有不同的等位基因，則為性別連鎖位點(diǎn)。在對(duì)羅非魚的研究中，發(fā)現(xiàn)了6個(gè)與性別相關(guān)的微衛(wèi)星位點(diǎn)，可用于性別的鑒定（陳文偉等，2020）。在棘腹蛙中，通過微衛(wèi)星探針技術(shù)辨別染色體，不僅取得了良好效果，也為遺傳多態(tài)性的研究奠定了基礎(chǔ)（常曉嬡等，2013）。Yuan等（2017）利用1個(gè)性別特異性微衛(wèi)星標(biāo)記尋找棘腹蛙中的雄性異配子的同源模式，從而有助于解釋性別決定系統(tǒng)和性染色體的進(jìn)化。

擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）是一種檢測(cè)DNA多態(tài)性的方法，通過限制性內(nèi)切酶將基因組分解為大小不同的DNA片段，再對(duì)其進(jìn)行PCR擴(kuò)增，如在雌雄中出現(xiàn)不同的多態(tài)性，則為性別連鎖標(biāo)記。在研究香魚養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性時(shí)，通過AFLP標(biāo)記技術(shù)對(duì)其進(jìn)行性別特異性分子標(biāo)記的篩選，最終篩選出1條雄性特異性分子標(biāo)記的序列（閆松松等，2014）。劉雪清等（2015）嘗試在成熟期長(zhǎng)，且難以從外部形態(tài)鑒定性別的中華鱘基因組中尋找性別特異性的AFLP分子標(biāo)記，雖然最后結(jié)果并不理想，但這些數(shù)據(jù)仍為中華鱘性別相關(guān)問題的研究奠定了基礎(chǔ)。

單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）及插入缺失（In/Del）分子標(biāo)記具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，包括密度高、遺傳穩(wěn)定等。且雌雄個(gè)體會(huì)固定不同的SNP及In/Del，因此可被用于性別決定系統(tǒng)及性染色體的鑒定。在對(duì)中國(guó)家養(yǎng)雙峰駝進(jìn)行研究時(shí)，通過在群體間進(jìn)行Y-SNP多態(tài)標(biāo)記的篩選，發(fā)現(xiàn)篩選出的Y染色體特異引物可以用于性別鑒定（陳慧玲，2016）。林曉煜等（2018）曾在大黃魚中發(fā)現(xiàn)1個(gè)雄性特異SNP標(biāo)記，并以此為基礎(chǔ)開發(fā)出1種大黃魚的新型遺傳性別鑒定技術(shù)。Sun等（2018）針對(duì)黃姑魚的基因在X和Y染色體上存在的差異設(shè)計(jì)出特異引物，以此對(duì)野生群體和養(yǎng)殖群體的遺傳性別進(jìn)行了鑒定。

2.1.2 基于關(guān)聯(lián)分析 高通量測(cè)序出現(xiàn)后，基于關(guān)聯(lián)分析可大批量篩選性別連鎖的分子標(biāo)記，主要測(cè)序分析方法包括全基因組關(guān)聯(lián)分析（genomewide association study，GWAS）、限制性位點(diǎn)相關(guān)DNA測(cè)序（restriction site-associated DNA sequencing，RAD-seq）、基 因 分 型 測(cè) 序（genotyping-bysequencing，GBS）以及雌雄分庫(kù)測(cè)序等，這些方法都是針對(duì)未退化完全的性連鎖區(qū)域的序列，通常利用序列在性別間的關(guān)聯(lián)情況來找出與性別關(guān)聯(lián)的分子序列，并由此開發(fā)了RADSex等篩選軟件（Feron.，2021）?；陉P(guān)聯(lián)分析的方法將雌雄分為2組，分析雌雄組間特有的差異，這種差異可以在SNP、K-mers、Reads等層面來反映。

Lambert等（2016）在林蛙中通過多樣性陣列技術(shù)鑒定出8個(gè)雄性特有性別連鎖SNP，表明該物種為XX/XY性別決定系統(tǒng)。Hu等（2019）為進(jìn)一步了解大鯢的性別決定機(jī)制，利用限制性位點(diǎn)相關(guān)DNA（RAD）測(cè)序技術(shù)，分離出1個(gè)性別特異性遺傳標(biāo)記。類似于RAD-seq的方法，從DNA測(cè)序的數(shù)據(jù)中尋找性別特異的K-mers也可以鑒別出性別關(guān)聯(lián)的序列。Duminda等（2020）基于K-mer值對(duì)澳大利亞三線石龍子的性別連鎖序列進(jìn)行鑒定，共鑒定出7個(gè)可靠的Y染色體特異性標(biāo)記，表明其為XX/XY性別決定系統(tǒng)。Lin等（2020）在大黃魚群體中進(jìn)行了性別測(cè)定的GWAS，最終在18號(hào)染色體中確定了1個(gè)與雄性顯著關(guān)聯(lián)的SNP，為大黃魚性別決定機(jī)制的確定奠定了基礎(chǔ)。

在對(duì)大量樣本進(jìn)行測(cè)序時(shí)，為了降低測(cè)序成本、提高效率，出現(xiàn)了一種新型測(cè)序技術(shù)——Poolseq，其測(cè)序文庫(kù)不是由單個(gè)個(gè)體或細(xì)胞的DNA制備的，而是由來自不同個(gè)體或細(xì)胞的DNA片段的混合物制備的（Schl?tterer.，2014）。這種方法在魚類性別研究中得到了大量應(yīng)用（Wang T.，2019；Wen.，2019；Feron.，2020）。Zhang等（2017）在草魚中利用Pool-seq鑒定了5個(gè)Y-連接的scaffold（總計(jì)347 kb）、6個(gè)Y-特異性序列和14個(gè)Y連鎖基因，證明了基于新一代測(cè)序技術(shù)的DNA重測(cè)序技術(shù)在魚類性別標(biāo)記鑒定中的適用性，既為草魚Y染色體的研究奠定了基礎(chǔ)，也有助于闡明鯉科Cyprinidae魚類性染色體的進(jìn)化模式。

2.1.3 基于測(cè)序覆蓋深度 針對(duì)已有基因組測(cè)序的物種，采集雌雄個(gè)體進(jìn)行高通量測(cè)序或重測(cè)序，比較性染色體測(cè)序片段的深度可以判斷性別連鎖的區(qū)域和基因片段。XY系統(tǒng)中常染色體及雌性的2個(gè)X染色體之間有2個(gè)拷貝，而雄性的X染色體和Y染色體都只有1個(gè)拷貝。對(duì)基因組測(cè)序時(shí)，測(cè)序深度通常會(huì)是基因組大小的數(shù)十倍到數(shù)百倍。因此，從Reads的測(cè)序深度來說，如果一個(gè)區(qū)段雌性比對(duì)上的Reads比例是雄性的2倍，可確定該區(qū)域?yàn)樾詣e連鎖。該方法最早被用在了一些蛇類和鳥類的性染色體的確認(rèn)和判斷中（Vicoso&Bachtrog，2011；Zhou.，2014）。然而，這種方法僅適用于已經(jīng)分化了足夠時(shí)間的Y/W染色體，這是因?yàn)橹亟M抑制積累了大量的變異，使得處于Y或W染色體上的序列不會(huì)被比對(duì)到X或Z染色體上（Charlesworth.，2021）。新近分化的性染色體類群分化程度較弱，性染色體（X與Y，Z與W）之間仍然具有很高的相似性，測(cè)序的Reads不能特異性地比對(duì)到其中一條性染色體上，從而使該方法失效。

2.1.4 基于哈迪-溫伯格平衡 利用性染色體形成時(shí)重組抑制的特性，還可以利用哈迪-溫伯格平衡的原理從種群遺傳的角度來鑒定性別決定系統(tǒng)或性染色體。K?fer等（2021）基于自然種群中已知雌雄個(gè)體的等位基因和基因型的頻率，利用啟發(fā)式的概率計(jì)算方法（貝葉斯法），通過后驗(yàn)概率來檢測(cè)性別連鎖的基因。該方法比GWAS等方法所需的個(gè)體數(shù)少，每種性別的個(gè)體僅需5～10個(gè)。這種方法也可以使用RNA-seq、基因組重測(cè)序以及RAD-seq等的數(shù)據(jù)，其檢測(cè)效率取決于染色體重組抑制區(qū)域的大小和分化程度。由于該方法最基本的原理是基于哈迪-溫伯格平衡，因此理想樣本是來自于同一大種群下的隨機(jī)交配的個(gè)體，使用不同種群的標(biāo)本可能會(huì)增加假陽(yáng)性的風(fēng)險(xiǎn)。

2.1.5 基于遺傳圖譜 遺傳圖譜又稱遺傳連鎖圖譜，是指基因以及專一的多態(tài)性標(biāo)記之間在基因組中相對(duì)位置的圖譜，反映了染色體的交換與重組。早期遺傳圖譜的構(gòu)建大多是利用顯性和共顯性標(biāo)記方法，如AFLP和SSR標(biāo)記，但隨著下一代測(cè)序技術(shù)，如RAD-seq、GBS等方法的發(fā)展，以SNP為主要的遺傳標(biāo)記可構(gòu)建更精細(xì)的遺傳圖譜，且根據(jù)此類遺傳圖譜還可以進(jìn)行數(shù)量性狀位點(diǎn)（quantitative trait locus，QTL）的檢測(cè)（Gonen.，2014；Uchino.，2018）。因此，通過構(gòu)建遺傳圖譜可以確定與性別性狀有關(guān)的QTL位點(diǎn)（Gao.，2020），在大比目魚遺傳圖譜的輔助下定位了其性別控制位點(diǎn)（Palaiokostas.，2013）。Qiu等（2018）構(gòu)建了1個(gè)有8 094個(gè)SNP標(biāo)記的黃姑魚高密度遺傳連鎖圖譜，并據(jù)此定位了QTL基因座以及相應(yīng)區(qū)間，在QTL區(qū)間中鑒定并發(fā)現(xiàn)了124個(gè)性別二型性的候選基因，包括、和。Gao等（2020）利用 GBS構(gòu)建了1個(gè)有5 705個(gè)SNP標(biāo)記的黃顙魚高密度遺傳連鎖圖譜，并將其定位到26個(gè)不同的連鎖群，鑒定發(fā)現(xiàn)出了11個(gè)顯著的性相關(guān)QTL基因座，且在QTL區(qū)間內(nèi)鑒定出6個(gè)性別相關(guān)基因，研究不僅闡明了黃顙魚的性別分化過程，且為之后的分子輔助育種奠定了研究基礎(chǔ)。

2.1.6 基于序列建樹 這是一種通過基因樹鑒定性染色體的新方法，即直接利用DNA/RNA鑒定。將測(cè)得的多個(gè)雌雄序列數(shù)據(jù)分別比對(duì)到參考基因組上，并在每條染色體上選取一定大小的窗口片段，將所有雌雄個(gè)體的2種分型都放在一起建樹。如果來自所有雄性的一種分型全聚在一起，并且形成單系，那該基因樹所在的片段是性別關(guān)聯(lián)的片段，且反映了XY的性別決定系統(tǒng)。如果所有雌性的一種分型序列全聚為一支，則為ZW型性別決定系統(tǒng)。該方法首先需要構(gòu)建X和Y序列的基因樹，由于X和Y序列之間差異較大，理想狀態(tài)下，X和Y序列分別是獨(dú)立的2個(gè)樹，由于序列很多，構(gòu)建出的基因樹也很多，此時(shí)哪棵樹用分子標(biāo)記可以把X和Y 2個(gè)基因樹靠攏在一起，即為性別連鎖標(biāo)記，區(qū)別不開則不是（Dixon.，2019；Toups.，2019）。

2.2 基于RNA表達(dá)

利用兩性之間一些基因在RNA表達(dá)水平上的差異，進(jìn)行性別決定與性染色體的相關(guān)研究。Shen等（2020）基于RNA-seq分析篩選到鲇11個(gè)性別特異表達(dá)的基因，并使用qRT-PCR技術(shù)對(duì)11個(gè)基因進(jìn)行驗(yàn)證，最終確定了8個(gè)性別特異表達(dá)基因。姚汶勵(lì)等（2019）通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的方法在草魚雌雄樣本中找到了數(shù)千個(gè)差異表達(dá)基因，最終發(fā)現(xiàn)基因和、基因分別與草魚早期精巢和卵巢發(fā)育調(diào)控相關(guān)。Qin等（2020）對(duì)黃姑魚性腺組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，并基于基因表達(dá)差異篩選出了與性別相關(guān)的基因，即僅在卵巢中表達(dá)，而僅在精巢中表達(dá)。

2.3 基于蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)

在20世紀(jì)80年代蛋白質(zhì)組學(xué)出現(xiàn)之前，學(xué)者普遍進(jìn)行傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)研究，即通過比較兩性之間蛋白質(zhì)的表達(dá)差異，從而確定性別決定系統(tǒng)，如同工酶法。Richard（1983）在中發(fā)現(xiàn)了一種性連鎖酶——烏頭酸酶，由于雌雄個(gè)體均攜帶這種酶，且烏頭酸酶1號(hào)位點(diǎn)與性別決定基因連鎖，便指出這些蛙類的性染色體可能表現(xiàn)為1對(duì)常染色體，且雄性性別決定基因位于其中1條同源染色體上。因傳統(tǒng)的同工酶法篩選效率低、準(zhǔn)確率不高，基于蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)可用于性別決定系統(tǒng)和性染色體的研究。

蛋白質(zhì)組學(xué)提供了對(duì)特定細(xì)胞、組織或整個(gè)個(gè)體中所有受調(diào)控蛋白質(zhì)的完整分析（Zhu.，2018），其可以通過研究蛋白質(zhì)之間的相互作用以及蛋白質(zhì)的表達(dá)修飾方式，來揭示蛋白質(zhì)在生命過程中的作用（Wilkins.，1996）。代謝組學(xué)也是一門新的技術(shù)，研究目標(biāo)是代謝小分子產(chǎn)物，如糖、有機(jī)酸和氨基酸等（Oliver，2002）。該技術(shù)有2個(gè)顯著優(yōu)勢(shì)：一是在蛋白質(zhì)水平或基因水平這類微小的變化可在代謝水平放大，進(jìn)而更容易被觀測(cè)到（Miracle&Ankley，2005；CuberoLeon.，2012）；二是代謝產(chǎn)物的種類比基因或蛋白質(zhì)的種類少，因此操作簡(jiǎn)便，無需再進(jìn)行全基因組測(cè)序或建立表達(dá)序列的大型數(shù)據(jù)庫(kù)的步驟（Wang L.，2019）。目前利用“組學(xué)”的方法進(jìn)行科學(xué)研究越來越成熟，可以嘗試運(yùn)用這類“組學(xué)”方法對(duì)性染色體分化程度較低物種的性別決定機(jī)制進(jìn)行研究，Wang T等（2019）采用了蛋白質(zhì)組和代謝組相結(jié)合的方法，發(fā)現(xiàn)在河川沙塘鱧性別決定中起重要作用的蛋白質(zhì)有4種，分別是 Ctnnb1、Piwil1、Hsd17b1和 Dnali1，而在性別決定中起重要作用的代謝過程是脂代謝。在上述實(shí)驗(yàn)中，通過使用定量PCR技術(shù)以及原位雜交技術(shù)，發(fā)現(xiàn)了目標(biāo)蛋白質(zhì)在雌雄個(gè)體中的表達(dá)不同，為進(jìn)一步明確河川沙塘鱧的性別決定機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

3 展望

由于年青性染色體系統(tǒng)的類群演化模式多種多樣，甚至于同一物種或近緣種的性別決定機(jī)制或性染色體都會(huì)有所不同，并且與性別相關(guān)聯(lián)的區(qū)域相對(duì)于基因組來說太小，因此需結(jié)合多種鑒定技術(shù)，從而準(zhǔn)確鑒定性別決定系統(tǒng)和性染色體。在未來的研究中，可以將測(cè)序技術(shù)、組學(xué)數(shù)據(jù)和生物信息學(xué)結(jié)合起來，對(duì)非模式物種的性別決定系統(tǒng)及基因組進(jìn)行深入研究，而這種綜合研究可以算作性別組學(xué)的研究起點(diǎn)。對(duì)于新出現(xiàn)的概念——性別組學(xué)，幾乎涵蓋了基因組、轉(zhuǎn)錄組以及蛋白質(zhì)組的全部信息（St?ck.，2021）。這種綜合性的組學(xué)方法將開啟有關(guān)性染色體研究的新時(shí)代，它可以深入闡明脊椎動(dòng)物的性別決定及性染色體進(jìn)化問題，揭示其背后的遺傳機(jī)理，也可解釋更多年青性別決定系統(tǒng)的問題。到目前為止，在變溫脊椎動(dòng)物中，有關(guān)性別決定系統(tǒng)與生殖模式共同進(jìn)化的信息還知之甚少（Charnov&Bull，1977；Warner&Shine，2008；Organ.，2009）。在此研究背景之下，未來的測(cè)序方向應(yīng)集中在缺乏性別決定信息和生殖模式信息的物種上（St?ck.，2021）。利用性別組學(xué)的方法，將會(huì)對(duì)非模式脊椎動(dòng)物的性染色體序列信息有更深入的理解，也將會(huì)最終闡明性別決定為何有如此多的方式以及性別決定系統(tǒng)進(jìn)化的動(dòng)力和分子途徑。

感謝中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所兩棲爬行類動(dòng)物研究室的曾曉茂研究員和鄭渝池副研究員在文章題材選取和內(nèi)容討論以及文稿撰寫過程中給予了寶貴意見。