凍融胚胎過夜培養(yǎng)后移植患者妊娠情況分析

王曉婷，陳宥藝，韓曉艷，張 祥，閆春芳

(西安市第四醫(yī)院生殖醫(yī)學中心，陜西 西安 710004)

對于新鮮取卵周期未移植行全胚冷凍，或移植后未孕仍有剩余凍存胚胎的患者，凍融胚胎移植(frozen-thawed embryo transfer，F(xiàn)ET)是一個有效的臨床策略。它具有凍融移植周期子宮內(nèi)膜容受好、能有效預防卵巢過度刺激綜合征、降低治療成本并能增加累計臨床妊娠率等優(yōu)勢。雖然影響凍融胚胎移植妊娠率的因素很多，但是凍融胚胎的質(zhì)量及繼續(xù)發(fā)育潛能無疑是最重要的影響因素之一。本研究回顧性分析了西安市第四醫(yī)院536例凍融胚胎移植周期，旨在探索凍融胚胎過夜培養(yǎng)后卵裂球增長與否及繼續(xù)發(fā)育的情況對臨床妊娠結(jié)局的影響，并為需要進行單胚胎移植的患者，提供最佳的胚胎選擇方案。

1資料與方法

1.1患者資料

收集2018年1月至2019年3月在西安市第四醫(yī)院進行凍融胚胎移植患者的536個周期的臨床資料。研究對象的納入標準：①女方因盆腔輸卵管、排卵障礙、子宮內(nèi)膜異位癥、不明原因等因素，男方因少弱畸形精子癥或無精子癥等因素進入常規(guī)體外受精與胚胎移植(in vitro fertilization，IVF)或卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)周期；②所有患者的解凍胚胎均是胚齡為第3天卵裂期的冷凍胚胎、過夜培養(yǎng)后移植2枚胚胎的凍融移植周期。排除標準：①患者有明確影響胚胎著床的因素，包括子宮畸形、輸卵管積水、子宮腺肌癥等；②夫婦一方染色體核型異常；③女方有未控制至正常的糖尿病、結(jié)核、甲亢，以及其他自身免疫系統(tǒng)疾病者。

1.2方法

1.2.1內(nèi)膜準備

所有患者均于月經(jīng)周期第2～4天行陰道超聲及基礎(chǔ)性激素檢查，根據(jù)既往月經(jīng)周期、基礎(chǔ)疾病及患者的意愿，采用自然周期、促排卵周期、人工周期或降調(diào)節(jié)+人工周期方案行移植前的內(nèi)膜準備，子宮內(nèi)膜厚度≥7mm作為凍融胚胎移植的標準。

1.2.2解凍胚胎

所有納入研究對象的胚胎均為常規(guī)IVF或ICSI受精、體外培養(yǎng)、采用玻璃化冷凍保存的第3天卵裂期胚胎。所有胚胎均采用玻璃化冷凍方法冷凍，冷凍前根據(jù)卵裂球個數(shù)、均勻程度及碎片情況對胚胎進行分級[1]，冷凍胚胎均評級為Ⅰ～Ⅲ級。使用玻璃化解凍試劑盒(日本加藤公司)對第3天卵裂期胚胎進行解凍復蘇。試劑盒包括解凍液TS、稀釋液DS、沖洗液WS1和WS2，解凍過程：將胚胎從液氮中取出，迅速置于37℃的TS液中，1min后將其依次轉(zhuǎn)移至DS、WS1、WS2中分別放置3min、5min、5min。最后轉(zhuǎn)移至預先平衡好的37℃胚胎培養(yǎng)液G2 PLUS(瑞典vitrolife公司)，置于37℃、6%CO2、5%O2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)18～20h。

1.2.3解凍胚胎存活標準

解凍后胚胎有半數(shù)及以上卵裂球存活視為存活胚胎[2]。

1.2.4分組方法

依照移植的2枚胚胎過夜培養(yǎng)后(18～20h)卵裂球增長與否分為3個大組：A2組(n=425)，有2枚胚胎均有卵裂球增長；A1組(n=89)，只有1枚胚胎有卵裂球增長；A0組(n=22)，有2枚胚胎均無卵裂球增長。再根據(jù)每個胚胎卵裂球增長的數(shù)目及發(fā)育情況將A2組分層為5個小組，即aa組、ab組、ac組、bb組、cc組(a：胚胎致密化、融合或者形成早期囊胚；b：胚胎增長卵裂球個數(shù)>2個；c：胚胎增長卵裂球個數(shù)≤2個)。

1.2.5確定妊娠結(jié)局

移植后14d測血人絨毛膜促性腺激素(β-human chorionic gonadotrophin，β-hCG)，血β-hCG≥50IU/L者判斷為生化妊娠并繼續(xù)黃體支持。移植后30d陰道超聲檢查，見孕囊及心管搏動為臨床妊娠。

1.3統(tǒng)計學方法

2結(jié)果

2.1一般臨床結(jié)果

凍融移植的536個周期，獲得臨床妊娠周期293例，臨床妊娠率為54.7%；孕囊數(shù)389個，胚胎種植率為36.3%；早期流產(chǎn)49例，早期流產(chǎn)率為16.7%。A2、A1、A0組的年齡、內(nèi)膜厚度、身體質(zhì)量指數(shù)(body mass index，BMI)和不孕年限比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1、表2。

表1 A2、A1、A0 組患者的基本情況

表2 A2組的5個小組患者的基本情況

2.23組胚胎繼續(xù)發(fā)育情況與患者臨床妊娠情況的關(guān)系

凍融胚胎經(jīng)培養(yǎng)18～20h后進行移植，A2、A1、A0 3組的臨床妊娠率分別為60.9%、36.0%、9.1%，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=37.76，P<0.05)；3組胚胎種植率分別為41.1%、21.3%、4.5%，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=44.73，P<0.05)；3組早期流產(chǎn)率分別為16.2%、18.8%、50.0%，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表3。

表3 A2、A1、A0 3組的臨床妊娠情況的總體比較[%,(n/N)]

3組間的臨床妊娠率(A2組vs A1組：χ2=18.704；A2組vs A0組：χ2=23.146)和胚胎種植率(A2組vs.A1組：χ2=24.359；A2組vs.A0組：χ2=23.389)兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；3組早期流產(chǎn)率兩兩比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.3 A2組的5個小組臨床妊娠情況比較

分兩個層次比較A2組內(nèi)5個小組(aa組、ab組、ac組、bb組、cc組)的臨床妊娠情況，首先將至少移植含有1枚胚胎出現(xiàn)致密化、融合或者形成早期囊胚的3個小組(aa組、ab組、ac組)進行比較，在至少有1枚a類胚胎的前提下，觀察另一枚胚胎發(fā)育情況對臨床妊娠結(jié)局的影響；其次再對aa組(2枚胚胎均出現(xiàn)致密化、融合或者形成早期囊胚)、bb組(2枚胚胎卵裂球增長個數(shù)均>2個)、cc組(2枚胚胎增長卵裂球個數(shù)均≤2個)3個小組之間妊娠情況進行比較，結(jié)果如下。

2.3.1 aa、ab、ac 3組間比較

aa、ab、ac 這3個小組中，均至少有1枚胚胎出現(xiàn)致密化、融合或者形成早期囊胚。結(jié)果顯示，隨著另一枚胚胎增長卵裂球數(shù)目的下降，臨床妊娠率和胚胎種植率有下降趨勢，早期流產(chǎn)率呈上升趨勢，見表4。組間兩兩比較顯示：aa組的臨床妊娠率(χ2=5.976)和胚胎種植率(χ2=15.906)均顯著高于ac組，且ab組的胚胎種植率顯著高于ac組(χ2=9.839)，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，3組間的早期流產(chǎn)率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表4 aa、ab、ac 3組的臨床妊娠情況的總體比較[%,(n/N)]

2.3.2 aa、bb、cc 3組間比較

aa、bb、cc 3個小組中，隨著2枚胚胎卵裂球增長數(shù)目的減少，臨床妊娠率和胚胎種植率依次出現(xiàn)下降趨勢，見表5。組間兩兩比較顯示：其中，aa組的臨床妊娠率顯著高于cc組(χ2=8.108)，aa組的胚胎種植率顯著高于cc組(χ2=6.971)，bb組的早期流產(chǎn)率顯著低于cc組(χ2=3.890)，上述差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表5 aa、bb、cc 3組臨床妊娠情況的總體比較[%,(n/N)]

3討論

3.1對凍融胚胎復蘇后繼續(xù)發(fā)育情況進行評估的重要性

隨著FET技術(shù)的普及，廣大人類輔助生殖技術(shù)專家及工作者希望可以在提高妊娠率和種植率的同時，降低多胎率和流產(chǎn)率，增加FET的安全性[3]。這就要求我們對FET周期中的胚胎發(fā)育潛力進行判斷，不僅僅要評估冷凍前的胚胎評分，還需結(jié)合解凍后胚胎的繼續(xù)發(fā)育情況進行綜合考量。

有研究認為凍融胚胎復蘇后即使有卵裂球損傷或死亡，過夜培養(yǎng)后如能繼續(xù)生長，仍可獲得較好的種植率，而且是否能繼續(xù)生長對此類胚胎的種植潛力非常關(guān)鍵[4]。還有研究發(fā)現(xiàn)，隨著胚胎復蘇后卵裂球增長數(shù)目的增加，臨床妊娠率似有升高的趨勢[5]。卵裂期胚胎解凍后過夜培養(yǎng)如能繼續(xù)發(fā)育并且發(fā)生致密化將會有更高的活產(chǎn)率[4]。低質(zhì)量胚胎過夜培養(yǎng)后如能獲得更多的卵裂也會有比較不錯的妊娠率，盡管這個比率會低于高質(zhì)量胚胎[6]。眾多研究表明，復蘇后胚胎的發(fā)育潛能至關(guān)重要，且其影響因素需要從多個角度進行探索，本研究旨在通過觀察解凍后過夜培養(yǎng)的2枚胚胎繼續(xù)發(fā)育情況與患者妊娠情況的關(guān)系，以期更加細化、精準地評價胚胎的種植潛能，為臨床解凍移植策略提供最優(yōu)的胚胎選擇依據(jù)。

3.2為優(yōu)化臨床結(jié)局制定最佳的胚胎選擇策略

本研究中，A2、A1、A0這3個組間的臨床妊娠率和種植率比較均有統(tǒng)計學差異，且A2組>A1組>A0組，說明胚胎解凍過夜培養(yǎng)后是否有卵裂球增長與臨床妊娠情況息息相關(guān)，這與之前研究一致[7]。本研究結(jié)果還顯示：A0組(2枚胚胎均無卵裂球增長)臨床妊娠率和胚胎種植率大大降低，表明如果解凍胚胎過夜培養(yǎng)18～20h后仍無卵裂球增長，提示妊娠失敗的可能性較大。Laverge等[8]在1998年研究報道，對復蘇后經(jīng)過夜培養(yǎng)后沒有卵裂球增長的胚胎，進行熒光原位雜交發(fā)現(xiàn)染色體異常比例很高，僅有20%左右的胚胎為正常二倍體。若移植此類胚胎，不但胚胎著床率低，且因染色體異常而發(fā)生流產(chǎn)的幾率增加[9-10]。如此高的染色體異常比例，臨床結(jié)局可想而知。因此本研究提示，提前解凍胚胎過夜培養(yǎng)時，應該把是否有卵裂球增長作為一個重點觀察指標，來指導凍融胚胎移植策略；2枚胚胎均無卵裂球增長的周期、除非患者不同意其它移植策略或已經(jīng)沒有凍存胚胎可供選擇，否則建議繼續(xù)行胚胎培養(yǎng)至囊胚移植，尤其對于反復種植失敗的患者，不建議對此類胚胎進行移植。

對A2組(即2枚胚胎均有卵裂球數(shù)生長組)進一步分層分析，aa、ab、ac這3個小組的比較數(shù)據(jù)表明，無論臨床妊娠率還是胚胎種植率均與胚胎繼續(xù)增殖發(fā)育情況有關(guān)。而且隨著另一枚胚胎增長卵裂球數(shù)的下降，臨床妊娠率和胚胎種植率均出現(xiàn)下降趨勢，這與之前的研究報道一致[11]。aa組在臨床妊娠率和種植率上均高于ac組(P<0.05)，且ab組的胚胎種植率高于ac組(P<0.05)?？梢钥闯觯瑥呐R床妊娠角度來看，a類胚胎(即過夜培養(yǎng)后出現(xiàn)致密化、融合或者形成早期囊胚的胚胎)發(fā)育潛能有明顯的優(yōu)勢，其次為b類胚胎(即胚胎增長卵裂球個數(shù)>2個)。aa、bb、cc這3個組比較，aa組的臨床妊娠率和胚胎種植率顯著高于cc組(P<0.05)；bb組的早期流產(chǎn)率顯著低于cc組(P<0.05)，aa組和bb組早期流產(chǎn)率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。從早期流產(chǎn)率的角度來看，b類胚胎繼續(xù)發(fā)育的潛能優(yōu)于c類胚胎，后期需要加大樣本量進一步研究。本研究結(jié)果表明，過夜培養(yǎng)后胚胎卵裂球個數(shù)增長越多，尤其是已經(jīng)出現(xiàn)致密化、融合或形成早期囊胚的胚胎，患者將獲得較好的臨床結(jié)局，與Solé等2011年研究結(jié)果一致，因此，我們有理由認為選擇過夜培養(yǎng)后出現(xiàn)致密化、融合或形成早期囊胚的a類胚胎及卵裂球數(shù)目增長較多的b類胚胎進行移植，是獲得成功妊娠的一個很關(guān)鍵的胚胎選擇策略。

胚胎種植率增加的同時必然會伴有臨床多胎妊娠率的增加，凍融胚胎過夜培養(yǎng)后，如果同時移植2枚都能達到b類以上的胚胎，則胚胎種植率均可達到40%以上，從患者妊娠安全性角度考慮，移植前需要綜合考慮各方面因素盡量降低多胎率。如果是單角子宮、剖宮產(chǎn)術(shù)后的疤痕子宮及任何原因期望為單胎妊娠的患者，最好繼續(xù)培養(yǎng)至囊胚行單囊胚移植或選擇a類或b類胚胎進行移植，在保證較高臨床妊娠率的前提下，能有效地降低多胎率，增加FET的安全性。當然，對于獲得胚胎非常不容易且胚胎較少的患者，可能面臨囊胚培養(yǎng)后無可移植囊胚的風險，在臨床實際工作中，要根據(jù)患者的胚胎發(fā)育情況、子宮內(nèi)膜、身體狀況、家庭經(jīng)濟及患者意愿進行綜合分析，最終決定凍融胚胎移植的最優(yōu)方案。

3.3總結(jié)

綜上所述，凍融胚胎過夜培養(yǎng)后移植2個以上卵裂球增長的胚胎，尤其是已經(jīng)發(fā)生致密化、融合或形成早期囊胚的胚胎，能獲得比較高的臨床妊娠率、種植率和相對較低的流產(chǎn)率；單胚胎移植時可優(yōu)先選擇胚胎已經(jīng)致密化、融合或者形成早期囊胚的胚胎。對于反復移植失敗的患者，不建議移植卵裂球數(shù)目未增加或者卵裂球數(shù)增加≤2個的胚胎，可考慮繼續(xù)培養(yǎng)至囊胚再移植。