多聚賴氨酸對(duì)梨果采后青霉病防效及其抗性誘導(dǎo)機(jī)制

竇 勇， 胡佩紅， 田林雙， 吳存兵

(1.江蘇財(cái)經(jīng)職業(yè)技術(shù)學(xué)院糧食與食品藥品學(xué)院，江蘇淮安 223003； 2.淮安正昌飼料有限公司技術(shù)部，江蘇淮安 223008)

梨(Nakai)屬于薔薇科植物，梨果營養(yǎng)豐富，富含多種維生素和纖維素，具有利于消化、通便、去咳化痰和保護(hù)心血管的效果。在自然情況下，梨果采摘后生理衰變速度快，組織一旦受到機(jī)械損傷，極易受到霉菌侵染，腐爛率極高，食用品質(zhì)急劇下降，極大地降低了梨果的商品價(jià)值。據(jù)統(tǒng)計(jì)，梨果采后貯藏保鮮技術(shù)水平有限，因包裝、貯運(yùn)到上市銷售過程中生理病害及機(jī)械損傷引起的霉菌感染造成的經(jīng)濟(jì)損失約30%。梨果采后由真菌引起的病害主要為擴(kuò)展青霉()引起的青霉病及由灰葡萄孢()引起的灰霉病，其中青霉病是影響梨果商品價(jià)值的最主要病害，它不僅會(huì)引起梨果腐爛變質(zhì)，部分致病青霉菌還會(huì)分泌展青霉素(patulin，簡稱PAT)，PAT對(duì)人類具有明顯的致癌、致畸、致突變作用，嚴(yán)重危害消費(fèi)者生命健康。目前，控制梨果采后病害的方法包括物理方法、化學(xué)方法、生物控制方法。Li等發(fā)現(xiàn)用紫外線處理梨果，能有效控制梨果采后霉菌病害，其腐爛直徑顯著低于對(duì)照組。李自芹用0.7 g/L的水楊酸或0.15%苯甲酸鈉處理庫爾勒梨果，可有效控制庫爾勒梨果采后黑頭病，并保存良好的儲(chǔ)藏品質(zhì)。張奇儒從果園里分離篩選出1株可有效控制梨果采后青霉病的酵母菌，該菌經(jīng)鑒定為異常威克漢姆酵母，經(jīng)毒理學(xué)研究表明該菌安全、無毒，使用濃度為1×10個(gè)/mL的異常威克漢姆酵母對(duì)梨果采后青霉病的控制效果最佳。梨果采后病害的物理控制方法具有安全、無毒的優(yōu)點(diǎn)，但物理方法操作繁雜且費(fèi)用高。而生物防治目前研究主要集中于安全無毒的拮抗酵母的篩選，由于在梨果病害防治過程中存在酵母菌活力下降的不足之處，造成推廣運(yùn)用存在一定的阻礙。化學(xué)防治方法具有顯著的防病效果，目前使用最為普遍，但化學(xué)殺菌劑存在一定的藥物殘留，危害消費(fèi)者健康，且在使用過程中會(huì)對(duì)環(huán)境造成一定程度的污染，此外一些食品防腐劑如山梨酸鉀及苯甲酸鈉也可在一定程度上控制梨果采后病害，但其只能抑制霉菌生長，不能殺滅霉菌，對(duì)病害控制效果有限。

多聚賴氨酸(poly--lysine，簡稱PL)是一種常見的食品防腐劑，它是由多個(gè)賴氨酸單體組成的直鏈狀多聚體，分子式為CHNOn，是由白色鏈霉菌屬的生產(chǎn)菌產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物，經(jīng)分離提取精制而獲得的發(fā)酵產(chǎn)品，進(jìn)入人體后可分解為賴氨酸，因此PL安全無毒。本研究針對(duì)造成梨果采后損失最嚴(yán)重的病害青霉病，通過打孔處理和整果處理方法，研究PL對(duì)梨果采后青霉病的控制效果和其對(duì)梨果儲(chǔ)藏品質(zhì)的影響，探明其控制梨果采后青霉病的最佳使用濃度，并初步探討其抗性誘導(dǎo)機(jī)制，以期使PL能在梨果采后病害防控及貯藏保鮮中得到應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)時(shí)間與地點(diǎn)

試驗(yàn)時(shí)間為2021年3月20日至5月30日，在江蘇財(cái)經(jīng)職業(yè)技術(shù)學(xué)院糧食與食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品加工技術(shù)實(shí)驗(yàn)室完成。

1.2 主要儀器

試驗(yàn)儀器主要有TopPette單道可調(diào)移液器[大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器(北京)股份公司]、MS104TS/02電子天平[梅特勒-托利多國際貿(mào)易(上海)有限公司]、LHS-250SC型恒溫恒濕培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)、AP-0650010血球計(jì)數(shù)板(德國MARIENFELD公司)、GL-20G-Ⅱ高速冷凍離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)。

1.3 供試材料

1.3.1 供試水果 試驗(yàn)用正常商業(yè)成熟度的梨果(Shuijing)，選擇個(gè)體大小基本一致，沒有機(jī)械損傷和病蟲害，且未經(jīng)任何商業(yè)防腐處理的梨果。用體積分?jǐn)?shù)為0.2%的NaClO溶液浸泡處理梨果 1 min，再用自來水沖洗干凈后晾干備用。

1.3.2 供試病原菌 選擇自然腐爛長滿青霉菌的梨果上分離出的青霉菌，經(jīng)生理生化和分子生物學(xué)鑒定該菌為擴(kuò)展青霉菌，為梨果的致病菌。挑取1環(huán)青霉菌孢子接種于20 mL馬鈴薯葡萄糖肉湯(PDB)培養(yǎng)基中，25 ℃培養(yǎng)24 h，吸取0.1 mL孢子懸浮液均勻涂布于馬鈴薯葡萄瓊脂培養(yǎng)基(PDA)上，在 25 ℃ 下培養(yǎng)7 d。7 d后，在培養(yǎng)基中加入無菌生理鹽水，用無菌的移液管頭輕輕刮取青霉菌孢子，用血球計(jì)數(shù)板測定孢子懸浮液濃度，用無菌生理鹽水稀釋至1×10個(gè)/mL，備用。

1.3.3 主要試劑 試驗(yàn)主要試劑有次氯酸鈉(化學(xué)純，購自國藥化學(xué)試劑有限公司)、多聚賴氨酸(分析純，購自國藥化學(xué)試劑有限公司)。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 多聚賴氨酸打孔處理對(duì)梨果采后青霉病的控制效果研究 采用無菌打孔器在供試?yán)婀嗟捞幘鶆虼?個(gè)孔，孔徑為4 mm×3 mm，將20 μL不同濃度的多聚賴氨酸溶液(200、400、600、800、1 000 mg/L)分別注入小孔里，對(duì)照組注入等量的無菌生理鹽水。將其置于已用乙醇消毒后的塑料筐中，用聚乙烯薄膜覆蓋包裹好，置于恒溫恒濕箱中，于相對(duì)濕度為96%、20 ℃條件下儲(chǔ)存24 h。用移液槍將20 μL濃度為1×10個(gè)/mL的青霉孢子懸液注入孔中，相同條件下，儲(chǔ)存6 d，每隔1 d統(tǒng)計(jì)梨果腐爛情況，并測定腐爛直徑。試驗(yàn)分6個(gè)處理，每個(gè)處理12個(gè)梨，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4.2 多聚賴氨酸整果處理對(duì)梨采后青霉病的控制效果研究 根據(jù)“1.4.1”節(jié)的試驗(yàn)結(jié)果，采用抑制梨果腐爛效果最佳濃度的多聚賴氨酸，浸泡供試?yán)? min，同樣在梨的赤道處用無菌打孔器打3個(gè)孔，孔徑為4 mm×3 mm，注入20 μL/孔濃度為 1×10個(gè)/mL的青霉孢子懸液，梨置于經(jīng)乙醇消毒后的塑料方框內(nèi)，用聚乙烯薄膜包裹好并置于恒溫恒濕箱中，設(shè)置溫度為20 ℃，相對(duì)濕度為96%，儲(chǔ)存 6 d，每隔1 d統(tǒng)計(jì)腐爛情況，并測定腐爛直徑，腐爛直徑為腐爛孔的直徑，未腐爛孔的腐爛直徑定義為0。試驗(yàn)分6個(gè)處理，每個(gè)處理12個(gè)梨，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4.3 多聚賴氨酸整果處理對(duì)梨采后儲(chǔ)藏品質(zhì)的影響 根據(jù)“1.4.2”節(jié)的試驗(yàn)結(jié)果，采用整果處理控制青霉病效果最佳濃度的多聚賴氨酸，浸泡供試?yán)? min，以無菌生理鹽水為對(duì)照組。用聚乙烯薄膜覆蓋包裹好置于恒溫恒濕箱中，于20 ℃，相對(duì)濕度96%的條件下，儲(chǔ)存60 d后，測定梨的可滴定酸含量、維生素C含量、硬度、可溶性固形物含量、失重率、褐變度，并統(tǒng)計(jì)其腐爛率和腐爛直徑，各指標(biāo)測定方法如下：

可滴定酸含量：參考韓雅姍的方法。每隔 5 d 進(jìn)行酸堿滴定法的測定，可滴定酸含量以蘋果酸含量計(jì)(折算系數(shù)為0.067)。

維生素C含量：使用紫外分光光度法，波長選擇在最大吸收峰243 nm處測定吸光度，計(jì)算供試蘋果中維生素C的含量。

硬度：參考 Gunness等的方法，采用TA-XT2i 質(zhì)構(gòu)分析儀對(duì)梨果的硬度進(jìn)行測定。

可溶性固形物含量：采用全自動(dòng)折光儀進(jìn)行測定，結(jié)果以百分比計(jì)。

失質(zhì)量率：蘋果儲(chǔ)存前后的質(zhì)量差，結(jié)果以百分比計(jì)。

自然腐爛率：統(tǒng)計(jì)蘋果腐爛情況，計(jì)算腐爛率。

褐變度()：參考蔡孟軒等的研究結(jié)果，波長選擇在最大吸收峰420 nm處測定吸光度。

1.4.4 多聚賴氨酸處理梨對(duì)其抗性酶活性的影響試驗(yàn)分為2組，每組15個(gè)梨。試驗(yàn)組使用600 mg/L的多聚賴氨酸溶液浸泡3 min，對(duì)照組使用無菌的生理鹽水浸泡3 min。風(fēng)干后，置于事先準(zhǔn)備好的已用乙醇消毒后的塑料筐中，再用聚乙烯薄膜包裹好放進(jìn)恒溫恒濕箱中，儲(chǔ)存6 d，分別測貯藏0、2、4、6 d后梨苯丙氨酸解氨酶(PAL)、多酚氧化酶(PPO)、過氧化物酶(POD)的活性。取2 g梨果果肉(皮下0.2～10.0 mm)，立即用液氮迅速冷凍后與少量硅砂混合，置于預(yù)冷的研缽中，研磨至粉末。加入1 mL含0.038%乙二胺四乙酸(EDTA)和1%聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)的預(yù)冷PBS (50 mmoL/L，pH值7.8)，溶解粉末并轉(zhuǎn)移到離心管中，剩余的組織用9 mL的PBS洗滌收集，然后在4 ℃下以10 000 r/min離心 5 min，收集上清液用于測定PAL、PPO、POD活性(單位為U/g)。

1.4.4.1 苯丙氨酸解氨酶活性的測定 取1 mL上清液于比色皿中，加入3 mL硼酸鹽緩沖液，于 290 nm 處測定吸光度。在37 ℃的水浴鍋中水浴 60 min，再次測定吸光度，以1 mL 50 mmoL/L的 PBS (pH值=7.8) 為空白對(duì)照。計(jì)算2次的吸光度差，以吸光度每升高0.01為1個(gè)PAL酶活單位。

1.4.4.2 多酚氧化酶活性測定 吸取2.8 mL的 0.1 mmol/L 鄰苯二甲酚(50 mmol/L PBS，pH值為6.4)溶液于比色皿中，加入0.2 mL待測粗酶提取液，30 ℃保溫6 min，于398 nm處測定吸光度，每隔1 min自動(dòng)測定1次，連續(xù)測定3次。以吸光度上升0.01為1個(gè)PPO酶活單位。

1.4.4.3 過氧化物酶活性測定 將0.2 mL粗酶提取液，加入到2.2 mL，50 mmol/L PBS(pH 值為6.4，含0.3%愈創(chuàng)木酚)中。再加入0.6 mL 0.3%的HO(50 mmoL/L PBS，pH值6.4)，30 ℃保溫 6 min，于470 nm處測定吸光度，每隔1 min自動(dòng)測定1次，連續(xù)測定3次。采用0.2 mL 50 mmoL/L PBS(pH值=6.4)作為空白對(duì)照。POD酶活單位定義為吸光度每上升0.01為1個(gè)酶活單位。

2 結(jié)果與分析

2.1 多聚賴氨酸打孔處理對(duì)梨采后青霉病控制效果的研究

由圖1、圖2可知，多聚賴氨酸濃度為600 mg/L的試驗(yàn)組與對(duì)照組相比，在貯藏3～5 d內(nèi)腐爛率和腐爛直徑較低。濃度在0～600 mg/L時(shí)，隨著濃度的增大，其對(duì)梨果青霉病的抑制效果整體逐漸增大。當(dāng)濃度達(dá)到800 mg/L以上時(shí)，控制效果開始減弱，達(dá)到1 000 mg/L時(shí)，基本沒有抑制效果，可能是因?yàn)槎嗑圪嚢彼釢舛冗^大，破壞了梨果細(xì)胞結(jié)構(gòu)造成的。在貯藏6 d時(shí)，只有600 mg/L試驗(yàn)組腐爛率未達(dá)到100%，且腐爛直徑最低，說明打孔處理后，濃度為600 mg/L的多聚賴氨酸對(duì)梨果采后青霉病的控制效果最佳。

2.2 多聚賴氨酸整果處理對(duì)梨采后青霉病的控制效果研究

圖3是梨果經(jīng)濃度為600 mg/L的多聚賴氨酸浸泡處理3 min后接種青霉孢子，貯藏3 d后的腐爛情況，由圖3可知，多聚賴氨酸有效地控制了梨果的青霉病害。由圖4、圖5可知，貯藏6 d內(nèi)，梨果的腐爛率和腐爛直徑均顯著低于對(duì)照組。從腐爛率來看，在貯藏的前5 d，對(duì)照組的腐爛率迅速升高，且貯藏4 d腐爛率已超過50%；而處理組腐爛率升高幅度較低，基本保持在40%以內(nèi)，且在前3 d，尚未腐爛，到貯藏6 d時(shí)，腐爛率迅速升高至88.35%。從腐爛直徑來看，試驗(yàn)組從貯藏4 d時(shí)開始腐爛， 腐爛直徑增大緩慢，貯藏6 d時(shí)，試驗(yàn)組的腐爛直徑為15.74 mm相比對(duì)照組的43.43 mm顯著降低了63.76%。由此可見，600 mg/L多聚賴氨酸整果處理梨果可以有效控制采后青霉病。

2.3 多聚賴氨酸整果處理對(duì)梨采后儲(chǔ)藏品質(zhì)的影響

由表1可知，經(jīng)600 mg/L多聚賴氨酸整果處理的梨果，在貯藏60 d后，腐爛率為2.12%，而對(duì)照組的腐爛率達(dá)到15.27%，多聚賴氨酸顯著降低了梨果貯藏期的腐爛。處理組硬度顯著高于對(duì)照組(<0.05)，而失質(zhì)量率顯著低于對(duì)照組，說明多聚賴氨酸對(duì)梨果具有一定的保水效果。在可滴定酸含量、可溶性固形物含量、維生素C含量、褐變度等貯藏品質(zhì)指標(biāo)上，處理組與對(duì)照組差異不顯著。由此可見，多聚賴氨酸整果處理梨果，既能有效控制梨果采后青霉病，對(duì)梨的儲(chǔ)藏品質(zhì)也不會(huì)產(chǎn)生不良影響，在一定程度上提高了貯藏品質(zhì)。

表1 多聚賴氨酸整果處理對(duì)梨采后自然腐爛率及貯藏品質(zhì)的影響

2.4 多聚賴氨酸打孔處理對(duì)梨果PPO、POD、PAL活性的影響

2.4.1 多聚賴氨酸對(duì)梨PPO活性的影響 由圖6可知，對(duì)照組和處理組PPO活性都呈先上升后下降的趨勢，但處理組PPO活性整體顯著高于對(duì)照組。在貯藏4～6 d處理組和對(duì)照組PPO活性差別達(dá)到最大，多聚賴氨酸處理組梨果的PPO活性約為對(duì)照組的1.69～2.09倍。說明梨果經(jīng)過多聚賴氨酸誘導(dǎo)處理后，抗性酶PPO活性顯著提高，有效地提高了梨果對(duì)青霉病的抗病力。

2.4.2 多聚賴氨酸對(duì)梨 POD 活性的影響 從圖7可知，對(duì)比試驗(yàn)組與對(duì)照組的試驗(yàn)結(jié)果，POD活性變化趨勢基本一致，均是呈先上升后下降的趨勢，但多聚賴氨酸處理組POD活性整體顯著高于對(duì)照組。對(duì)照組與試驗(yàn)組的差異在貯藏6 d達(dá)到最大值，處理組梨POD活性為91.45 U/g，對(duì)照組POD活性為63.41 U/g。

2.4.3 多聚賴氨酸對(duì)梨 PAL 活性的影響 從圖8知，PAL活性均呈先上升后平緩的趨勢，處理組PAL活性下顯著高于對(duì)照組。從貯藏4 d開始，對(duì)照組和處理組的PAL活性均處于較高值，處理組PAL活性基本是對(duì)照組酶活性的2倍以上，說明經(jīng)多聚賴氨酸處理的梨果的抗性酶PAL活性顯著提高，增強(qiáng)了梨果的抗病力。

3 討論與結(jié)論

PAL、PPO、POD是植物細(xì)胞中最重要的3種抗性防御酶，當(dāng)病原菌侵染植物體時(shí)，植物組織細(xì)胞會(huì)通過提高PAL、PPO、POD的活性來防御外來病原菌的侵染，且這3種酶活性與抗病性呈正相關(guān)，因此可作為衡量植物抗病性的指標(biāo)。梨果經(jīng)多聚賴氨酸打孔處理誘導(dǎo)24 h，能夠明顯提高抗性酶PAL、PPO、POD的酶活性，從而提高了梨果對(duì)青霉病的抗性，通過對(duì)照組與試驗(yàn)組的對(duì)比表明，多聚賴氨酸溶液濃度在200～600 mg/L條件下，隨著溶液濃度的增加，對(duì)梨青霉病的腐敗率和腐敗直徑抑制效果逐漸加強(qiáng)；在600 mg/L條件下，對(duì)梨青霉病的抑制效果最好，能最大程度地減少青霉病對(duì)梨造成的傷害；在600 mg/L以上，抑制效果開始減弱，當(dāng)濃度達(dá)到1 000 mg/L時(shí)，對(duì)梨青霉病基本沒有抑制效果，可能是因?yàn)楦邼舛鹊亩嗑圪嚢彼釙?huì)破壞梨細(xì)胞組織，引起自身防御系統(tǒng)故障。梨果浸泡經(jīng)濃度為600 mg/L多聚賴氨酸處理3 min的梨，儲(chǔ)存60 d后，試驗(yàn)組腐爛率和腐爛直徑均明顯低于對(duì)照組。由此可見，多聚賴氨酸不僅對(duì)梨果青霉病具有顯著的控制效果，而且在一定程度上保護(hù)了梨果的儲(chǔ)藏品質(zhì)，有效延長了梨果的貯藏期。

在目前的生產(chǎn)實(shí)踐中，梨青霉病的防治主要還是依靠化學(xué)方法進(jìn)行，化學(xué)方法往往存在農(nóng)藥殘留，食用后對(duì)人體會(huì)存在一定的影響，甚至?xí)a(chǎn)生環(huán)境污染。多聚賴氨酸作為一種天然的食品防腐劑，進(jìn)入人體后可以被分解為賴氨酸，被人體正常消化吸收，具有安全無毒的優(yōu)點(diǎn)，此外多聚賴氨酸又具有明顯的抑菌效果，被廣泛應(yīng)用于食品防腐劑中。本研究結(jié)果表明600 mg/L的多聚賴氨酸浸泡處理梨果，能有效控制梨果采后青霉病，且多聚賴氨酸安全無毒，對(duì)梨果感官品質(zhì)具有較好的保護(hù)作用，因此，多聚賴氨酸在梨果采后保鮮和貯藏中將有較高的應(yīng)用價(jià)值。本課題后續(xù)研究將會(huì)拓展到多聚賴氨酸對(duì)梨果黑霉病控制、草莓采后病害、蘋果采后病害控制等方面，以期其能在水果采后病害控制方面得到推廣應(yīng)用。