園林植物再生與遺傳轉(zhuǎn)化體系研究進(jìn)展

李懿鑫， 果弘毅， 儲歆彤， 高俊峰， 吳瑜瑋， 劉國元， 張 健

(南通大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院觀賞植物遺傳育種重點實驗室，江蘇南通 226000)

園林植物指觀葉、觀花、觀果、觀莖、觀形的木本和草本植物，是園林綠化的主要材料，在城市綠化方面起著至關(guān)重要的作用，如調(diào)節(jié)氣候、凈化空氣、美化城市環(huán)境等。由于土地鹽堿化、荒漠化等生態(tài)問題日趨嚴(yán)重，普通的園林植物已滿足不了正常需求。因此，快速開發(fā)和培育出更多的新品種園林植物來滿足生產(chǎn)、生活需要，是解決這一問題的關(guān)鍵。遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)打破了常規(guī)育種方式，可以高效、快速創(chuàng)造新種質(zhì)。隨著植物組織培養(yǎng)技術(shù)的廣泛應(yīng)用和遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)的不斷深入發(fā)展，研究人員在成功建立高效再生體系的基礎(chǔ)上，運(yùn)用多種遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)，將關(guān)聯(lián)性狀的耐鹽、耐旱、耐高溫、抗蟲、抗病等相關(guān)基因用于轉(zhuǎn)基因遺傳育種，已成功建立了多種植物的遺傳轉(zhuǎn)化體系。

本研究結(jié)合國內(nèi)外研究進(jìn)展對影響園林植物再生的關(guān)鍵因素、遺傳轉(zhuǎn)化的相關(guān)技術(shù)以及影響農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化效率的因素等方面進(jìn)行綜述，旨在為進(jìn)一步利用遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)進(jìn)行園林植物的轉(zhuǎn)基因育種奠定基礎(chǔ)。

1 園林植物再生體系的研究進(jìn)展

植物的組織培養(yǎng)流程清晰，具體包括外植體的選擇、外植體的消毒、誘導(dǎo)愈傷組織、誘導(dǎo)不定芽、誘導(dǎo)生根、煉苗、移栽等過程。在植物再生的過程中，要根據(jù)材料的不同取材部位，取材部位的不同發(fā)育階段，對培養(yǎng)基類型、激素濃度、光照時間等進(jìn)行調(diào)整。

近年來，有許多的園林植物已成功建立了組培再生體系。如菊科(Asteraceae)的萬壽菊(L.)、向日葵(L.)、甜葉菊[(Bertoni) Hemsl.]等，蘭科(Orchidaceae)的蝴蝶蘭(H. G. Reichenbach)、蕙蘭(Rolfe)、君子蘭()等，報春花科(Primulaceae)的報春花(Franch.)、小報春(Franch.)、鄂報春(Hance)等，鳳仙花科(Balsaminaceae)的鳳仙花(L.)，毛茛科(Ranunculaceae)的芍藥(Pall.)，鳶尾科(Iridaceae)的鳶尾(Maxim.)、香雪蘭(Klatt.)等，百合科(Liliaceae)的百合(var.Baker)、郁金香(L.)等10余科的草本園林觀賞植物組培再生體系已相當(dāng)成熟，具體如表1所示。

表1 草本園林植物組培再生體系的構(gòu)建

與草本植物相比，木本植物外植體的木質(zhì)化程度較高，在培養(yǎng)過程中容易出現(xiàn)褐化現(xiàn)象，隨著組培技術(shù)的提高，一批重要木本園林植物如楊柳科(Salicaceae)的楊樹(L.)、胡楊(Oliv.)等，銀杏科(Ginkgoaceae)的銀杏(L.)，松科(Pinaceae)的油松(Carriere )、云杉(Mast.)等，木蘭科(Magnoliaceae)的玉蘭[(Desrousseaux) D.L.Fu]、鵝掌楸[(Hemsl.) Sarg.]等，?？?Moraceae)的桑樹(L.)，薔薇科(Rosaceae)的月季(Jacq.)、海棠()等，蕓香科(Rutaceae)的柑橘(Blanco)、花椒(Maxim.)等，山茶科(Theaceae)的山茶(L.)、油茶(Abel.)等50余科的木本園林植物已成功建立再生體系，具體如表2所示。

表2 木本園林植物組培再生體系的構(gòu)建

目前，國內(nèi)外關(guān)于園林植物再生體系的研究報道很多，大量研究報道證明了外植體類型、基礎(chǔ)培養(yǎng)基、激素種類及配比等均影響園林植物的再生。

1.1 外植體類型

外植體類型是影響園林植物再生的關(guān)鍵因素之一，同一外植體的不同取材部位或同一取材部位的不同發(fā)育階段，其不定芽的分化能力均不相同。再生培養(yǎng)時，要根據(jù)植物的生長特性、繁殖方式來選取合適的外植體。一般選擇幼嫩的器官或組織，如幼葉、莖尖、嫩莖、種胚等，也可選擇種子、幼根、下胚軸、子葉、花器官等。吳青青等將百合的組培苗進(jìn)行4 ℃低溫處理，發(fā)現(xiàn)處理后的組培苗生長點活動旺盛，適宜進(jìn)行莖尖培養(yǎng)，并成功獲得了再生的脫毒苗；而張西英等采用熱處理與莖尖培養(yǎng)結(jié)合的方式得到了脫毒的郁金香，同時研究了不同莖尖大小對郁金香莖尖培養(yǎng)的影響，發(fā)現(xiàn)莖尖大小為1.5～2.0 mm時便于剝?nèi)?，也能取得一定的脫毒效果。何艷等通過對葉片的部位及葉齡進(jìn)行研究，將葉片切成0.50 cm×0.50 cm的小片，發(fā)現(xiàn)試管苗下段葉片較上端更易形成愈傷組織，試管苗發(fā)育狀態(tài)良好的葉基比未完全發(fā)育的葉尖、葉中部愈傷組織誘導(dǎo)效率高。孫瑞芬等對甜葉菊帶腋芽的莖段和莖尖進(jìn)行叢生芽的誘導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)在相同培養(yǎng)條件下，帶芽莖段作為外植體誘導(dǎo)叢生芽的效率更高，成功培育出成活率達(dá)70%的再生植株。楊柳科的木本園林植物已經(jīng)建立了較完整的再生體系，研究者常以葉片、莖尖、莖段、腋芽等為外植體，誘導(dǎo)不定芽，獲得再生植株。張瑞芝等以歐美楊的葉柄、葉片、莖段為外植體，發(fā)現(xiàn)葉柄產(chǎn)生愈傷組織的時間較短，誘導(dǎo)率高，而莖段相比較葉柄、幼葉愈傷產(chǎn)率較低，利用帶有腋芽的莖段來誘導(dǎo)產(chǎn)生無菌苗的效率則更高。

在園林植物中，常采用莖段進(jìn)行快繁得到無菌苗，以縮短植物的發(fā)育時間。在誘導(dǎo)愈傷組織時，葉柄的誘導(dǎo)率要優(yōu)于葉片和莖段。因此，在選擇外植體時，要根據(jù)植物的生長特性、取材部位及發(fā)育階段等多方面進(jìn)行考慮。

1.2 培養(yǎng)基類型

在組織培養(yǎng)中，培養(yǎng)基對外植體的培養(yǎng)具有非常重要的作用，MS、1/2MS、WPM、B5、N6等是植物組織培養(yǎng)中常用的培養(yǎng)基，這些培養(yǎng)基中均含有豐富的無機(jī)營養(yǎng)物質(zhì)和部分有機(jī)營養(yǎng)成分等。不同植物在脫分化、再分化、生長等過程中適宜的培養(yǎng)基各不相同。

陳長征對影響金線蓮愈傷組織增殖的培養(yǎng)基進(jìn)行了選擇，使用MS、1/2MS和N6這3種培養(yǎng)基，證明MS培養(yǎng)基的效果顯著優(yōu)于1/2MS和N6培養(yǎng)基。而馮寧使用MS、1/2MS和1/3MS這3種基本培養(yǎng)基，研究了帶有腋芽的蝴蝶蘭莖段的生長和褐化情況，發(fā)現(xiàn)適當(dāng)降低培養(yǎng)基中大量元素的含量，蝴蝶蘭組培的褐化率也隨之降低，蝴蝶蘭腋芽的萌發(fā)率則隨之升高，在1/2MS培養(yǎng)基上的莖段，其腋芽萌發(fā)率超過90%，且長勢良好。

周熙瑩等使用MS、WPM培養(yǎng)基誘導(dǎo)84K楊的葉片和莖段的愈傷組織，發(fā)現(xiàn)葉片以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，愈傷組織的誘導(dǎo)效率更高、更加穩(wěn)定，而莖段誘導(dǎo)愈傷組織及愈傷組織誘導(dǎo)不定芽使用WPM培養(yǎng)基則更合適。孫永蓮以簸箕柳的莖段為外植體，用B5、MS、WPM、1/2MS 這4種基本培養(yǎng)基誘導(dǎo)腋芽，篩選出MS為簸箕柳組織培養(yǎng)的最適基本培養(yǎng)基。而Jardak等使用MT培養(yǎng)基，以柑橘的胚軸為外植體，成功建立了柑橘的再生體系。

綜上，MS培養(yǎng)基對木本園林植物和草本園林植物均適用，一般用于誘導(dǎo)愈傷組織，而WPM培養(yǎng)基常用于木本園林植物，適用于愈傷組織的誘導(dǎo)和不定芽的分化，1/2MS培養(yǎng)基也可用于園林植物不定芽的分化生和根。在實際的組織培養(yǎng)過程中，要根據(jù)培養(yǎng)階段來選擇合適的培養(yǎng)基，同時植物激素、其他培養(yǎng)物的添加也十分重要。

1.3 植物生長調(diào)節(jié)劑種類

在組織培養(yǎng)中，為了促進(jìn)外植體的生長發(fā)育，常添加不同濃度、不同種類和配比的植物生長調(diào)節(jié)劑。盡管植物生長調(diào)節(jié)劑用量非常微小，但其在植物生長中卻起著不可替代的作用。一般常用的有生長素、細(xì)胞分類素、赤霉素、脫落酸等。

生長素有萘乙酸、吲哚乙酸、吲哚丁酸、2，4-D等，它們不僅可以促進(jìn)細(xì)胞分裂，還能誘導(dǎo)愈傷組織形成和生根，具有極其重要的作用。2，4-D常用于愈傷組織的誘導(dǎo)，但高濃度的2，4-D有一定的毒害作用。NAA、IBA常用于生根培養(yǎng)，單一或者混合使用均可。王善娥使用單一激素NAA、BA、ZT、2，4-D、KT對誘導(dǎo)柳樹葉片愈傷組織率進(jìn)行了探究，發(fā)現(xiàn)NAA、2，4-D產(chǎn)生愈傷組織的速度較快，其他幾種激素誘導(dǎo)愈傷組織則較慢，且很快便褐化死亡。在誘導(dǎo)愈傷組織時，生長素和細(xì)胞分裂素的搭配使用，誘導(dǎo)出的愈傷組織狀態(tài)更佳。張大鵬等以KT、TDZ、6-BA、IBA、IAA、2，4-D、NAA為不同的激素處理，分析油棕葉片在不同激素誘導(dǎo)下的褐化率，發(fā)現(xiàn)6-BA和IBA處理下的褐化率明顯高于其他5種激素，KT處理下葉片的褐化率則顯著低于其他激素，而2，4-D、NAA、IAA對葉片的褐化率影響在各個水平上均無顯著差異，因此在愈傷誘導(dǎo)率相近的情況下，可優(yōu)先使用KT對油棕葉片進(jìn)行誘導(dǎo)。

6-芐氨基嘌呤、玉米素(ZT)、激動素、噻苯隆等細(xì)胞分裂素用于促進(jìn)細(xì)胞分裂和分化，促進(jìn)愈傷組織分化不定芽。其中，6-BA和KT使用較廣泛。例如，孫永蓮等研究發(fā)現(xiàn)，6-BA對簸箕柳愈傷組織的誘導(dǎo)率要高于KT，而6-BA 和TDZ結(jié)合使用時不定芽的分化數(shù)目最多且生長旺盛，分化率達(dá)100%。而與KT相比，相同濃度下的6-BA更易使試管苗玻璃化。于非等使用6-BA和TDZ直接將麗格海棠葉片誘導(dǎo)出不定芽。還有研究表明，在誘導(dǎo)不定芽的過程中，極其微量的TDZ可能是芽分化的關(guān)鍵。例如，甄成得到的毛果楊莖段分化最佳培養(yǎng)基中，加入的TDZ僅為0.000 8 mg/L。

赤霉素和脫落酸(ABA)有時也用于植物組織培養(yǎng)中。赤霉素對枝條生長和伸長區(qū)節(jié)間的發(fā)育具有一定的作用，對根的生長沒有促進(jìn)作用，能顯著促進(jìn)莖葉的生長，有時也用于誘導(dǎo)愈傷組織。脫落酸則對植物生長有抑制作用。

在培養(yǎng)基中添加植物激素時，常以生長素和細(xì)胞分裂素不同濃度的配比進(jìn)行搭配。一般認(rèn)為，細(xì)胞分裂素和生長素比值低時，有利于愈傷組織的形成，如生長素的濃度范圍一般為0.01～1.00 mg/L NAA或0.1～2.0 mg/L 2，4-D，與細(xì)胞分裂素 0.1～3.0 mg/L 6-BA搭配使用，用于誘導(dǎo)愈傷組織；而細(xì)胞分裂素和生長素比值高時，則有利于不定芽的分化，0.1～1.0 mg/L NAA和0.1～4.0 mg/L 6-BA 常被用于不定芽的分化，有時也使用2種以上的激素組合，如NAA+6-BA+0.000 1～0.100 0 mg/L TDZ，微量的TDZ在分化過程中起著不可替代的作用。但這并非絕對的，如烏日罕使用河北楊葉片誘導(dǎo)不定芽時，使用的激素濃度為 0.3 mg/L TDZ+0.4 mg/L IBA。

1.4 其他因素

溫度、光照、繼代次數(shù)、培養(yǎng)時間、封口材料等因素也會影響組織培養(yǎng)的效果。如王馨使用不同光質(zhì)的LED燈(藍(lán)光、綠光、紅光、白光和藍(lán)綠紅混合光)，對東北紅豆杉的愈傷組織進(jìn)行照射，探究不同光照條件下愈傷組織紫杉烷類化合物的積累，發(fā)現(xiàn)5種光質(zhì)均可促進(jìn)化合物的積累，紅光為最佳光質(zhì)。尚瑀琪等對連續(xù)繼代培養(yǎng)中馬尾松的芽生根能力進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)繼代次數(shù)的增加對馬尾松的生根能力有顯著影響，繼代次數(shù)在15～20次時，繼代芽生根能力最強(qiáng)，生根率達(dá)98.7%，而繼代40次以后，生根能力顯著下降。而有些植物卻能夠長期繼代，如玫瑰等在多次繼代后仍能保持原來的增殖能力和分化能力，還有些植物在繼代過程中發(fā)生變異的概率會增加。

2 園林植物遺傳轉(zhuǎn)化體系研究進(jìn)展

植物遺傳轉(zhuǎn)化也稱轉(zhuǎn)基因技術(shù)，以植物的原生質(zhì)體、器官、組織、細(xì)胞等材料為受體，通過不同的方法將外源基因轉(zhuǎn)入到受體中，從而獲得外源基因穩(wěn)定表達(dá)的再生植株。在園林植物再生體系的基礎(chǔ)上，已在菊花、蘭花、百合、郁金香等草本園林植物及銀杏、楊樹、油松、柑橘、黃楊等木本園林植物上成功實現(xiàn)了遺傳轉(zhuǎn)化。草本園林植物的生長周期短，與生長周期長的木本園林植物相比，不論是傳統(tǒng)育種方式還是轉(zhuǎn)基因育種都相對容易。而木本園林植物常以傳統(tǒng)的育種方式進(jìn)行育種，其遺傳性狀改良較復(fù)雜、周期長，通過基因工程育種能夠極大地縮短育種年限。

目前，多數(shù)園林植物利用植物的葉片、種子、莖段、下胚軸等都能實現(xiàn)遺傳轉(zhuǎn)化，通過脫分化形成愈傷組織后再分化不定芽、體細(xì)胞胚發(fā)生、外植體直接再生不定芽等途徑，得到穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化體系，從而達(dá)到驗證基因功能的目的。在柑橘遺傳轉(zhuǎn)化研究中，常用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)幼苗上胚軸片段，由于種子具有季節(jié)依賴和基因型依賴等特點，使得柑橘的遺傳轉(zhuǎn)化效率大幅降低，因此利用細(xì)胞懸浮培養(yǎng)進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化可能是一種更好的選擇，具有更高的器官發(fā)生潛力，細(xì)胞懸浮液的轉(zhuǎn)化更有利于非嵌合轉(zhuǎn)基因柑橘植株的產(chǎn)生，轉(zhuǎn)化效率為35%，而且細(xì)胞懸浮培養(yǎng)能有效地維持細(xì)胞的活力和再生潛能。因此，建立高效的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)對植物基因功能的研究和新品種選育有非常重要的作用。

在遺傳轉(zhuǎn)化過程中，除了高效的再生體系外，遺傳轉(zhuǎn)化方法也很重要。目前，遺傳轉(zhuǎn)化的方法主要有農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、基因槍法、聚乙二醇(PEG) 介導(dǎo)法、顯微注射法、電擊法、花粉管通道法、離子束法等。其中，將DNA直接轉(zhuǎn)移的方法有電擊法和顯微注射法等，利用植物的原生質(zhì)體作為轉(zhuǎn)化受體，此方法對原生質(zhì)體的再生要求比較高，對于一些原生質(zhì)體再生困難的物種研究難度較大。利用花粉管通道法的研究也有相關(guān)報道，如茶樹利用花粉管通道法成功獲得了轉(zhuǎn)基因植株，但轉(zhuǎn)基因植株的結(jié)實率明顯低于正常植株，技術(shù)仍需進(jìn)一步改進(jìn)。目前，常用的轉(zhuǎn)化方法有農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、基因槍法和聚乙二醇(PEG)介導(dǎo)法。

2.1 農(nóng)桿菌介導(dǎo)法

農(nóng)桿菌介導(dǎo)法是通過農(nóng)桿菌將外源目的基因?qū)胫参锘蚪M的方法，以此形成含有外源基因的再生植株，實現(xiàn)遺傳性狀的改良。用于轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌主要是根癌農(nóng)桿菌和發(fā)根農(nóng)桿菌。在自然條件下，根癌農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒上有1段T-DNA，農(nóng)桿菌通過感染多數(shù)裸子植物和雙子葉植物的傷口部位，將T-DNA插入到植物的基因組中，在植物基因組中進(jìn)行整合表達(dá)；而發(fā)根農(nóng)桿菌則能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生高度分支的毛狀根。目前根癌農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)理論機(jī)制最清楚、技術(shù)方法最成熟，是當(dāng)前研究中使用最多的方法，具有操作簡便易行、轉(zhuǎn)化方法簡單高效、轉(zhuǎn)化效率高、重組后的外源DNA結(jié)構(gòu)完整且不易變異等優(yōu)點。

在遺傳轉(zhuǎn)化研究過程中，外植體類型、農(nóng)桿菌菌株類型、濃度和侵染時間、共培養(yǎng)時間、抗生素種類等也是影響農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化的重要因素。

2.1.1 外植體類型 不同類型的外植體是農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化過程中的重要影響因素之一。一般選取分裂能力強(qiáng)、生長旺盛的材料，使獲得的轉(zhuǎn)化材料效率高，轉(zhuǎn)化后再生植株的活力較強(qiáng)。用于遺傳轉(zhuǎn)化材料主要有體細(xì)胞胚、嫩莖、嫩葉、下胚軸、莖尖等。對于不同品種的植物、選擇不同的外植體進(jìn)行轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化效率也存在顯著差別。在柳樹的轉(zhuǎn)化體系中，以種子為外植體，由胚頂芽直接誘導(dǎo)出多芽，農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化效率為7.2%。利用體細(xì)胞胚為外植體，在牡丹、百合、火炬松、日本柳杉等品種中，均獲得了較好的遺傳轉(zhuǎn)化效果。還有以嫩葉為外植體通過直接誘導(dǎo)不定芽進(jìn)行轉(zhuǎn)化的，如楊樹葉片的遺傳轉(zhuǎn)化效率為32.2%。此外，柑橘的胚性懸浮細(xì)胞能夠有效維持細(xì)胞活力和再生潛力，也可以作為遺傳轉(zhuǎn)化材料，轉(zhuǎn)化效率為35%。還有毛狀根作為外植體也成功建立了遺傳轉(zhuǎn)化體系。

2.1.2 菌株類型、濃度和侵染時間 在農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化過程中，農(nóng)桿菌菌株的類型、菌液濃度和侵染時間也是影響遺傳轉(zhuǎn)化的重要因素之一。農(nóng)桿菌菌株LBA4404、EHA105、AGL1、GV3101等常用來侵染植物外植體。Wang等對白楊和山楊葉片進(jìn)行農(nóng)桿菌侵染，發(fā)現(xiàn)農(nóng)桿菌EHA105的轉(zhuǎn)化頻率最高，而GV3101的致病力很小或沒有毒力，因此選擇農(nóng)桿菌EHA105進(jìn)行試驗，在共培養(yǎng)基中添加50 mg/L乙酰丁香酮，獲得了較好的GUS表達(dá)效果。

在適宜的菌液濃度下，合適的侵染時間有利于提高轉(zhuǎn)化效率，降低染菌率。菌液密度越高，侵染時間越長，農(nóng)桿菌在培養(yǎng)過程中長勢越旺盛，外植體發(fā)生染菌、褐化的可能性會大幅提高；而菌液密度越低、侵染時間越短，外植體傷口與菌液接觸不充分，使得農(nóng)桿菌難以附著在外植體上。Wu等使用根癌農(nóng)桿菌GV3101和LBA4404對桑樹葉片進(jìn)行侵染，設(shè)置3種菌液濃度(為0.5、1.0、1.7)，發(fā)現(xiàn)3種菌液之間的GUS信號并沒有明顯差別，因此，選擇=0.5濃度進(jìn)行試驗。大量研究表明，在以葉片為外植體進(jìn)行轉(zhuǎn)化時，菌液一般為0.4～1.0，轉(zhuǎn)化效果最佳的侵染時間為5～20 min。

2.1.3 共培養(yǎng)時間 外植體與菌株的共培養(yǎng)時間對轉(zhuǎn)化效率有顯著影響。共培養(yǎng)時間過短，會導(dǎo)致農(nóng)桿菌在外植體上不能充分生長，降低了T-DNA的整合效率；而共培養(yǎng)時間過長，則會導(dǎo)致農(nóng)桿菌過度繁殖，抑菌難度大大增加，增加了接種次數(shù)。Song等將白楊幼葉共培養(yǎng)3、4、5 d，發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)3 d最為合適，且隨著共培養(yǎng)時間的延長，芽誘導(dǎo)效率逐漸降低，而轉(zhuǎn)化效率則無明顯差別。研究表明，農(nóng)桿菌在外植體傷口處共培養(yǎng)16 h以上誘導(dǎo)形成冠癭瘤，才會發(fā)生轉(zhuǎn)化，通常以暗培養(yǎng)2～3 d 為最佳。

遺傳轉(zhuǎn)化過程中，共培養(yǎng)后的植物材料表面有大量農(nóng)桿菌附著，因此抑菌處理成為一個重要的環(huán)節(jié)。合適的抗生素不僅可以篩選出抗性植株，還能抑制和殺死農(nóng)桿菌的生長。

抑菌抗生素能夠有效抑制農(nóng)桿菌的活性，且抑菌抗生素的濃度在外植體的生長過程中也起著重要的作用。如果濃度過低，起不到抑制農(nóng)桿菌生長的作用，會導(dǎo)致農(nóng)桿菌過度繁殖；而濃度過高，則會抑制外植體的生長甚至導(dǎo)致外植體褐化死亡。常用的抑菌抗生素主要有頭孢霉素(Cef)、特美汀(Tim)、羧芐青霉素(Carb)等，在遺傳轉(zhuǎn)化體系中加入特美汀，愈傷組織的抑菌效果和再生效果比頭孢霉素和羧芐青霉素效果要好，且對植物材料的影響更小?？梢愿鶕?jù)植物外植體的特點，選擇合適的抑菌抗生素及濃度。Hayta等在培養(yǎng)基中添加硝酸銀，能夠明顯抑制農(nóng)桿菌的生長和促進(jìn)植株再生。Bruegmann等將白楊葉片共培養(yǎng)后，用 500 mg/L 頭孢霉素?zé)o菌水溶液對外植體進(jìn)行沖洗，抑制農(nóng)桿菌的生長。

農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化過程中，只有少數(shù)外植體能將外源DNA整合到自身的基因組中，大多數(shù)則未能轉(zhuǎn)化成功。利用轉(zhuǎn)化質(zhì)?；蜉d體帶有的選擇標(biāo)記，通過篩選抗生素來篩選轉(zhuǎn)化成功的外植體，抑制未轉(zhuǎn)化外植體的生長，從而高效地篩選轉(zhuǎn)化成功的抗性材料。常用的篩選抗生素有潮霉素(Hyg)和卡那霉素(Kana)。根據(jù)轉(zhuǎn)化過程中所用質(zhì)粒載體的不同，來選擇合適的抗生素。如報春花屬植物在遺傳轉(zhuǎn)化過程中常使用新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶Ⅱ()基因，基因?qū)Π被擒疹惪股乜敲顾?、新霉素和G-418具有耐藥性，得出卡那霉素是最常用的選擇性藥物，在125 mg/L的濃度下，卡那霉素抑制未轉(zhuǎn)化細(xì)胞的生長，而使轉(zhuǎn)化細(xì)胞從花梗愈傷組織中再生。

2.2 基因槍法

基因槍法又稱粒子轟擊技術(shù)，是利用高速微彈將外源DNA導(dǎo)入植物組織或細(xì)胞的方法。在微小的金?；蜴u粒表面包裹著外源DNA，然后加速穿透細(xì)胞壁進(jìn)入目標(biāo)植物。當(dāng)微投射體進(jìn)入細(xì)胞時，轉(zhuǎn)移的DNA從粒子中分離出來，整合到宿主基因組中并穩(wěn)定表達(dá)?；驑尫ú粌H可以將目的基因轉(zhuǎn)入雙子葉植物，也能導(dǎo)入到單子葉植物，克服了農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化過程中寄主的限制問題，幾乎所有的器官、組織都可以作為轉(zhuǎn)化受體。此外，還能將多個質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)化至受體細(xì)胞，縮短了工作時間，提高了試驗效率。但是，在轉(zhuǎn)化過程中，使用的金粉或鎢粉價格較高，增加了試驗成本，且獲得的轉(zhuǎn)基因植株嵌合體比率較高、轉(zhuǎn)基因效率低、轉(zhuǎn)化不穩(wěn)定，仍需要進(jìn)一步改進(jìn)。

2.3 聚乙二醇介導(dǎo)法

PEG是一種細(xì)胞融合劑，能引起細(xì)胞膜表面電荷的紊亂，干擾細(xì)胞間正常的信息交流，從而促進(jìn)細(xì)胞之間的融合，誘導(dǎo)外源DNA分子進(jìn)入原生質(zhì)體。該方法操作簡便、不受品種的局限、成本低，但需要原生質(zhì)體作為受體，而許多植物原生質(zhì)體再生困難，因此該方法的使用受到了一定的限制。

3 展望

園林植物高效再生體系的建立已有很多報道，在莖尖脫毒、微體快繁等領(lǐng)域取得了重大的研究進(jìn)展，高效的再生體系和成熟的轉(zhuǎn)基因技術(shù)是實現(xiàn)園林植物遺傳育種和新品種改良的重要條件，再生及遺傳轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵步驟如圖1所示。

但有些物種仍停留在愈傷誘導(dǎo)階段，不定芽的分化成了制約該類物種再生體系構(gòu)建的難題，還會遇到褐化、玻璃化等問題。因此，仍需繼續(xù)加大研究力度，參考前人的研究基礎(chǔ)，加強(qiáng)技術(shù)、方法等方面的創(chuàng)新，加強(qiáng)基礎(chǔ)研究體系的構(gòu)建，攻克再分化過程這一難關(guān)，推進(jìn)園林植物再生體系的構(gòu)建。同時盡量降低組織培養(yǎng)過程中的玻璃化、褐化及染菌等問題，培育出生長狀態(tài)良好的愈傷組織，為再分化做準(zhǔn)備。

目前，多數(shù)園林植物利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，成功培育出耐鹽、耐高溫、耐旱等的轉(zhuǎn)基因新品系，但此方法轉(zhuǎn)化效率較低，易出現(xiàn)假陽性，需對轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行分子鑒定。同時農(nóng)桿菌的菌液濃度、侵染時間、共培養(yǎng)時間等因素，也影響著農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化效率。而基因槍法的轉(zhuǎn)化率要比農(nóng)桿菌的高，但在可操作性、受體細(xì)胞被轟擊后DNA的變化等方面，還需要進(jìn)一步完善。此外，花粉管通道法、PEG法、顯微注射法等遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)，可借鑒不同種類植物中的研究。隨著遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)的不斷創(chuàng)新和進(jìn)步，未來會成功培育出更多高效轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因新品種。

外植體的選擇、不同種類激素配比是園林植物再生體系成功建立的關(guān)鍵。而植株再生低、遺傳轉(zhuǎn)化效率低、轉(zhuǎn)基因植株離體再生率低等，是遺傳轉(zhuǎn)化過程中所面臨的瓶頸問題。因此，仍需不斷優(yōu)化培養(yǎng)條件，建立高效的再生及遺傳轉(zhuǎn)化體系，為園林植物遺傳育種及基因功能的研究提供有力的方法支撐，為新品種的選育和推廣奠定基礎(chǔ)。