煙草赤星病高效生防內(nèi)生細(xì)菌的分離篩選及發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化

蔡永占， 白 濤， 劉冬梅， 邱春麗， 符宗偉， 朱穎勛， 華小兵， 趙崇鈞， 張 琪

(1.云南省煙草公司曲靖市公司，云南曲靖 655000；2.云南省微生物發(fā)酵工程研究中心有限公司，云南昆明 650217)

煙草赤星病(tobacco brown spot disease，TBSD)是由鏈格孢菌在煙葉成熟時(shí)期侵染造成病斑的一種真菌性病害，在各煙區(qū)普遍發(fā)生，直接影響煙葉的產(chǎn)量和品質(zhì)，給煙農(nóng)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失，是煙草生產(chǎn)上威脅最大的病害之一。現(xiàn)階段對(duì)煙草赤星病的防治方法主要有2種。一種是篩選具有抗病性的煙草品種或通過田間措施增強(qiáng)植株抗性；另一種是使用化學(xué)藥劑防治。目前國內(nèi)針對(duì)煙草赤星病的化學(xué)藥劑主要有氟硅唑、異菌脲、菌核凈、嘧菌酯、醚菌酯、多菌靈、甲基硫菌靈和腐霉利等?；瘜W(xué)藥劑防治雖取得了一些成效，但因其選擇性差、高殘留和不易降解，也造成了生態(tài)環(huán)境被破壞、煙葉品質(zhì)下降、環(huán)境污染加重、抗藥性問題日益突出等后果，且赤星病一般在煙葉成熟期發(fā)病，農(nóng)藥殘留會(huì)影響卷煙質(zhì)量及人類身體健康。因此研究開發(fā)出能防治赤星病的生物防控技術(shù)尤為重要。

篩選煙草赤星病病菌拮抗菌是實(shí)施生物防控的一項(xiàng)重要工作，也是近年來國內(nèi)外科研工作者研究的熱點(diǎn)。方敦煌等從煙草赤星病病斑上分離得到14株拮抗赤星病病菌的微生物，對(duì)峙培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)其中6株對(duì)赤星病主要病原鏈格孢菌()具有不同致病力的6個(gè)菌株均具拮抗作用；馬冠華等從幾個(gè)不同煙草品種的不同生長(zhǎng)時(shí)期的不同生長(zhǎng)部位中分離得到近 2 000 株內(nèi)生細(xì)菌，經(jīng)過篩選得到4株對(duì)赤星病菌的生長(zhǎng)都有較強(qiáng)抑制作用的細(xì)菌；馬志遠(yuǎn)從陜西、云南、湖北和河南 4 省煙區(qū)的煙草根際土壤和煙葉中分離篩選到10株對(duì)赤星病菌有拮抗效果的芽孢桿菌，其中 M-07 菌株的拮抗效果最好，抑菌條帶寬度達(dá)到14.2 mm。目前，大多數(shù)研究還只停留在實(shí)驗(yàn)室階段，少見煙草赤星病病菌拮抗菌規(guī)?；a(chǎn)應(yīng)用的報(bào)道，同時(shí)由于大多數(shù)拮抗菌的針對(duì)性不強(qiáng)，導(dǎo)致田間應(yīng)用的防治效果和穩(wěn)定性都相對(duì)較差。本研究以曲靖煙區(qū)分離得到的煙草赤星病病原菌為靶標(biāo)，從曲靖煙區(qū)健康煙株內(nèi)分離得到高效生防內(nèi)生細(xì)菌，并對(duì)其發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，旨在為其規(guī)?；a(chǎn)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)，為曲靖煙區(qū)煙草赤星病的防治提供新思路。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)時(shí)間和地點(diǎn)

1.1.1 試驗(yàn)時(shí)間 2020年2月7日至6月23日。

1.1.2 試驗(yàn)地點(diǎn) 云南省安寧市青龍鎮(zhèn)禹龍甸云南省微生物發(fā)酵工程研究中心有限公司實(shí)驗(yàn)室。

1.2 供試材料

1.2.1 供試菌株 供試的煙草赤星病病原真菌鏈格孢菌由筆者所在課題組前期從曲靖煙區(qū)的病葉上分離純化獲得，現(xiàn)保藏于云南省微生物發(fā)酵工程研究中心有限公司菌種庫，菌株編號(hào)：YWFB-19-0013。

1.2.2 供試植株 供試健康煙株的根、莖、葉采自云南省曲靖市宣威市、麒麟?yún)^(qū)和師宗縣，烤煙品種為K326。

1.2.3 供試培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基：用于煙草內(nèi)生細(xì)菌的分離培養(yǎng)。配方如下(1 L)：蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 5 g，加入蒸餾水定容至1 L，充分溶解后，調(diào)節(jié)pH值至7.0，經(jīng)121 ℃高壓蒸汽滅菌 15 min 即可。加入1.5%瓊脂，同等條件滅菌，即可得到LB固體培養(yǎng)基。

馬鈴薯蔗糖(PSA)培養(yǎng)基：用于具拮抗作用的生防菌株篩選。配方(1 L)如下：馬鈴薯200 g，蔗糖14 g，加入蒸餾水定容至1 L，充分溶解后，經(jīng)121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min即可。加入1.5%瓊脂，同等條件滅菌，即可得到PSA固體培養(yǎng)基。

發(fā)酵培養(yǎng)基原始配方：用于拮抗菌發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化。配方(1 L)如下：大豆粉14 g，蛋白胨2 g，玉米粉4 g，碳酸鈣6 g，魚粉2 g，蔗糖3 g，氯化鈉0.3 g，磷酸二氫鉀0.3 g，磷酸氫二鉀0.3 g，硫酸錳0.2 g，硫酸鎂0.3 g，硫酸銨0.5 g，加入蒸餾水定容至1 L，充分溶解后，經(jīng)121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min即可。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 煙草內(nèi)生細(xì)菌的分離 將煙草的根、莖、葉分別用自來水沖洗干凈后，先在70%乙醇中振蕩浸泡1 min，再用有效氯含量1%的次氯酸鈉溶液振蕩浸泡1～5 min進(jìn)行表面消毒后，用滅菌水沖洗3次，于滅菌的研缽中研磨，將研磨汁液涂布于LB平板上。以組織消毒后用滅菌水沖洗的最后一次沖洗液涂板作為對(duì)照，檢測(cè)樣品表面消毒是否徹底，如長(zhǎng)菌落，研磨液所涂平板上長(zhǎng)的菌落為非內(nèi)生細(xì)菌，棄去；若對(duì)照中無菌落，在研磨液中長(zhǎng)出的菌落可能是內(nèi)生細(xì)菌，隨機(jī)挑取形態(tài)不同的菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)并保存。

1.3.2 鏈格孢菌拮抗內(nèi)生細(xì)菌的初篩和復(fù)篩 以煙草赤星病病原菌為指示菌，在PSA平板底部中心用記號(hào)筆點(diǎn)上一個(gè)點(diǎn)，以它為中心，在距離中心 3 cm 處按十字交叉點(diǎn)上4個(gè)點(diǎn)，將煙草赤星病病原菌菌餅接在PSA平板中心，在距中心3 cm 處的4個(gè)點(diǎn)上用接種環(huán)點(diǎn)接分離出的煙草內(nèi)生菌，以中心向四周輻射方向未點(diǎn)接煙草內(nèi)生菌為空白對(duì)照，各平板正置于28 ℃培養(yǎng)1周，測(cè)量不同煙草內(nèi)生菌對(duì)煙草赤星病病原菌的抑制效果。

用同樣的方法將初篩中抑菌帶較寬的菌株進(jìn)行復(fù)篩，各平板正置于28 ℃培養(yǎng)24 h后測(cè)定復(fù)篩菌株對(duì)煙草赤星病病原菌的抑菌率。

1.3.3 拮抗內(nèi)生細(xì)菌發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化研究 應(yīng)用Design-Expert軟件，采用響應(yīng)面法對(duì)抑菌率最高的拮抗菌進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化。配制Design-Expert軟件程序設(shè)計(jì)的培養(yǎng)基配方，以1/1 000的接菌量接入種子液，于35 ℃，160 r/min的恒溫?fù)u床內(nèi)培養(yǎng)72 h后取樣檢測(cè)其菌含量。

1.3.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析處理

采用 Excel 和 Design-Expert軟件來進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析與處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙草內(nèi)生細(xì)菌的分離

將所采集的煙草根、莖、葉表面消毒后，一共分離得到71株內(nèi)生細(xì)菌，將其編號(hào)為YWF-19-0001至YWF-19-0071。部分內(nèi)生細(xì)菌的平板照片見圖1。

2.2 鏈格孢菌拮抗內(nèi)生細(xì)菌的篩選

以分離得到的71株煙草內(nèi)生細(xì)菌為目標(biāo)菌，采用對(duì)峙平板法測(cè)定其對(duì)鏈格孢菌的抑制作用。由表1可知，對(duì)鏈格孢菌具有抑制作用的有22株，其中抑菌帶寬度≥10 mm的有5株，5 mm≤抑菌帶寬度<10 mm的有7株，抑菌帶寬度<5 mm的有10株。部分內(nèi)生細(xì)菌對(duì)鏈格孢菌的抑制效果見圖2。

表1 拮抗鏈格孢菌內(nèi)生細(xì)菌初篩結(jié)果

2.3 鏈格孢菌拮抗內(nèi)生細(xì)菌的復(fù)篩

將上述試驗(yàn)中效果較為明顯的5株內(nèi)生細(xì)菌再次對(duì)煙草赤星病病菌進(jìn)行拮抗驗(yàn)證，對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的抑制效果如表2所示。從表2可知，YWF-19-0004 、YWF-19-0065、YWF-19-0068、YWF-19-0070 和YWF-19-0071的平均抑菌帶寬度分別為10.6、10.3、12.5、11.8、12.3 mm，抑菌率分別為51.25%、50.67%、56.70%、53.33%和55.58%。

表2 拮抗內(nèi)生細(xì)菌對(duì)鏈格孢菌菌絲生長(zhǎng)的抑制效果

2.4 生防內(nèi)生細(xì)菌發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

2.4.1 主要影響因素的確定 應(yīng)用Design-Expert軟件，采用響應(yīng)面法對(duì)抑菌率最高的YWF-19-0068菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化。響應(yīng)面法的Plackett burman 設(shè)計(jì)是從多種因素中選取對(duì)試驗(yàn)指標(biāo)有顯著影響的因子，為下一步研究提供參考。影響發(fā)酵液菌量的碳源有碳酸鈣、蔗糖、玉米粉。氮源有大豆粉、蛋白胨、魚粉。PB試驗(yàn)篩選YWF-19-0068菌株基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的顯著因子，對(duì)基礎(chǔ)培養(yǎng)基的6個(gè)組分：玉米粉(A)、大豆粉(B)、魚粉 (D)、碳酸鈣(E)、蛋白胨(G)、蔗糖(H)進(jìn)行全面考察，選擇11因子2水平的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，增加5個(gè)虛擬項(xiàng)(C、F、J、K、L)來估計(jì)試驗(yàn)誤差。每個(gè)因子取高低2個(gè)水平。分別取高值和低值為：玉米粉濃度4、8g/L，大豆粉濃度10、16g/L，魚粉濃度2、6 g/L，碳酸鈣濃度4、8 g/L，蛋白胨濃度2、6 g/L，蔗糖濃度5、10 g/L。PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果如表3所示。

利用響應(yīng)面分析軟件對(duì)表3中的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到回歸模型方差分析和各因素的主效應(yīng)結(jié)果(表4、表5)，該模型的值為0.019 5<0.05，說明該模型顯著，能較好地?cái)M合數(shù)據(jù)。根據(jù)值的大小可以判定，培養(yǎng)基中各因子對(duì)YWF-19-0068菌株菌量影響的重要性排序?yàn)?蔗糖濃度>玉米粉濃度>碳酸鈣濃度>蛋白胨濃度>魚粉濃度>大豆粉濃度。蔗糖濃度、玉米粉濃度和碳酸鈣濃度3個(gè)因子的值均小于 0.05，說明其對(duì)YWF-19-0068菌株菌量有顯著影響，因此選定蔗糖濃度、玉米粉濃度和碳酸鈣濃度作為下一步試驗(yàn)的關(guān)鍵因素。

表3 PB 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表4 Plackett burman 試驗(yàn)分析與結(jié)果

表5 Plackett burman 試驗(yàn)回歸分析結(jié)果

2.4.2 最適濃度范圍的確定 對(duì)蔗糖 、玉米粉和碳酸鈣濃度3個(gè)主要影響因子進(jìn)行最陡爬坡路徑試驗(yàn)，確定此3個(gè)因子的最適濃度范圍(表6、圖3)。 蔗糖、玉米粉和碳酸鈣濃度對(duì)發(fā)酵液含菌量均是正影響，為正值，當(dāng)蔗糖濃度為11 g/L，玉米粉濃度為7 g/L，碳酸鈣濃度為5 g/L 時(shí)對(duì)應(yīng)的發(fā)酵液含菌量達(dá)到最大值，對(duì)鏈格孢屬病原菌抑菌率達(dá)67%以上，為3個(gè)因子的最大響應(yīng)值區(qū)域。

表6 最陡爬坡路徑試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.4.3 響應(yīng)面分析 采用 Box-Behnken 的中心組合設(shè)計(jì)原理，以蔗糖濃度11 g/L、碳酸鈣濃度5 g/L和玉米粉濃度7 g/L為中心點(diǎn)施行響應(yīng)面分析，設(shè)計(jì)3 因素3水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，各自變量水平見表7，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表8。

表7 響應(yīng)分析法設(shè)計(jì)因子及水平

表8 響應(yīng)分析法試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

1511029.0516-10130.451700038.56

響應(yīng)面分析法對(duì)菌含量濃度的分析見表9，由表9可知，本試驗(yàn)二次多項(xiàng)回歸方程的值小于 0.05，說明模型顯著，回歸方程失擬項(xiàng)檢驗(yàn)值為 0.235 9>0.05，說明失擬項(xiàng)不顯著，未知因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果干擾小。擬合檢驗(yàn)顯著，說明所建立的模型是有效的，與實(shí)際情況擬合，3 個(gè)參數(shù)對(duì)菌含量濃度的影響是顯著的。

表9 響應(yīng)面分析法對(duì)菌含量濃度的分析

根據(jù)回歸方程所做出的響應(yīng)曲面和等高線圖見圖4。如果等高線圖形呈橢圓形，說明2個(gè)因素的交互作用顯著，如呈圓形，說明交互作用不顯著；等高線的密集程度可說明該因子對(duì)菌含量影響的大小。由圖4可以看出，等高線為橢圓形，說明交互作用顯著。等高線的疏密可以看出玉米粉濃度和碳酸鈣濃度對(duì)菌含量的影響>蔗糖和玉米粉濃度對(duì)菌含量的影響>蔗糖和碳酸鈣濃度對(duì)菌含量的影響。

2.4.4 優(yōu)化試驗(yàn)驗(yàn)證 在相同的發(fā)酵條件下利用基礎(chǔ)培養(yǎng)和優(yōu)化后的培養(yǎng)基對(duì)YWF-19-0068菌株進(jìn)行發(fā)酵的結(jié)果見表10。從表10中可以看出，采用優(yōu)化后的培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵，菌量為36.85×10CFU/mL，是基礎(chǔ)培養(yǎng)基發(fā)酵所得菌量8.24×10CFU/mL 的4.47倍。

表10 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化前后的結(jié)果對(duì)比

3 討論與結(jié)論

國家煙草專賣局提倡綠色防控理念，減少化學(xué)農(nóng)藥使用，采用微生物菌劑或其他綠色防控措施替代化學(xué)農(nóng)藥，這已經(jīng)成為煙草病蟲害防控的主要思路。因此，篩選出具有生防功能的微生物，將其應(yīng)用到煙草生產(chǎn)中，并評(píng)價(jià)其針對(duì)煙草赤星病的防控效果，對(duì)煙草赤星病防控、生態(tài)環(huán)境保護(hù)以及人們生命健康具有重大意義。而在進(jìn)行工業(yè)發(fā)酵時(shí)，碳源和氮源是微生物細(xì)胞和代謝產(chǎn)物的重要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，也是發(fā)酵培養(yǎng)基的重要組成部分，不同細(xì)菌對(duì)各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的需求量不同。通過優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基配方，提高發(fā)酵液中的菌含量，為大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)，有助于降低生產(chǎn)成本，提高制劑的生防效果。

本研究利用煙草鮮樣，分離出煙草內(nèi)生細(xì)菌共計(jì)71株，編號(hào)YWF-19-0001～YWF-19-0071，并以煙草赤星病病原真菌鏈格孢菌為指示菌， 篩選出15株對(duì)其具有拮抗作用的菌株。針對(duì)其中抑制作用效果較好的菌株進(jìn)行復(fù)篩，最終得到5株抑菌帶寬≥10 mm、抑菌率≥50%的拮抗菌，編號(hào)分別為YWF-19-0004、YWF-19-0065、YWF-19-0068、YWF-19-0070、YWF-19-0071。

應(yīng)用Design-Expert軟件，采用響應(yīng)面法對(duì)抑菌率最高的YWF-19-0068菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化研究，獲得YWF-19-0068菌株的優(yōu)化培養(yǎng)基配方：大豆粉濃度14 g/L，蛋白胨濃度2 g/L，魚粉濃度2 g/L，蔗糖濃度11 g/L，玉米粉濃度為 7 g/L，碳酸鈣濃度5 g/L，氯化鈉濃度0.3 g/L，磷酸二氫鉀濃度0.3 g/L，磷酸氫二鉀濃度0.3 g/L，硫酸錳濃度0.2 g/L，硫酸鎂濃度0.3 g/L，硫酸銨濃度0.5 g/L。利用優(yōu)化培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵，YWF-19-0068菌株的菌量為36.85×10CFU/mL，是基礎(chǔ)培養(yǎng)基發(fā)酵所得菌量8.24×10CFU/mL的4.47倍，說明優(yōu)化培養(yǎng)基能有效提高YWF-19-0068菌株的菌量，有助于降低生產(chǎn)成本，具有較高的實(shí)用價(jià)值。

總而言之，從健康的煙草植株中，可篩選出煙草赤星病高效生防內(nèi)生細(xì)菌，通過對(duì)其發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化研究，可以有效提高生防菌的菌量，為其規(guī)?；a(chǎn)奠定基礎(chǔ)。本研究團(tuán)隊(duì)將繼續(xù)進(jìn)行煙草內(nèi)生菌株防治煙草赤星病的研究，旨在將篩選出的菌株制成菌劑應(yīng)用于田間，并研究其田間驗(yàn)證效果，為煙草內(nèi)生菌株在煙草赤星病防控方面提供基礎(chǔ)及技術(shù)支撐，也為其在后期的推廣應(yīng)用提供數(shù)據(jù)支撐。