李 波，鄭樹(shù)城，曾偉偉，王 慶，李瑩瑩，尹紀(jì)元，王雅慧，呂月鳳，石存斌，趙志英，姜志勇，王英英

(1．上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命科學(xué)學(xué)院，上海，201306；2．中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部漁用藥物創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省水產(chǎn)動(dòng)物免疫技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州，510385；3.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院，動(dòng)物分子設(shè)計(jì)與精準(zhǔn)育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，普通高校動(dòng)物分子設(shè)計(jì)與精準(zhǔn)育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，生命科學(xué)與工程學(xué)院，廣東佛山，440605； 4.廈門大學(xué)海洋與地球?qū)W院， 福建廈門， 361100；5.海南省海洋與漁業(yè)科學(xué)院，海口，571126；6.廣東省農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，廣州，510030)

多聚免疫球蛋白受體是一種Ⅰ型跨膜糖蛋白，能夠轉(zhuǎn)運(yùn)分泌型抗體抑制病原微生物黏附和入侵。哺乳動(dòng)物的多聚免疫球蛋白(polymeric immunoglobulin,pIg)R分子由胞質(zhì)區(qū)，胞外配體結(jié)合區(qū)和跨膜區(qū)三部分構(gòu)成，其中胞外配體結(jié)合區(qū)含有5個(gè)免疫球蛋白樣功能結(jié)構(gòu)域(ILD1～I(xiàn)LD5)，其中ILD1是與pIg結(jié)合的重要結(jié)構(gòu)域，與其它脊椎動(dòng)物中ILD的數(shù)量不同，魚(yú)類pIgR分子只發(fā)現(xiàn)有對(duì)應(yīng)哺乳動(dòng)物ILD1和ILD5的兩個(gè)免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域。

目前pIgR的免疫學(xué)功能研究主要集中在粘膜上皮細(xì)胞中pIg的調(diào)節(jié)、與配體的結(jié)合以及對(duì)pIg的胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)等方面。在魚(yú)類研究上則主要涉及pIgR在病原感染過(guò)程中的調(diào)控作用。研究發(fā)現(xiàn)，泥鰍()、鯽()、鯉()、斑馬魚(yú)()、草魚(yú)()以及大菱鲆()等魚(yú)類感染細(xì)菌后的pIgR表達(dá)水平相較健康的魚(yú)體具有顯著性差異。虹鱒()以及海鱸()體內(nèi)的pIgR通過(guò)與其共生菌和病原菌相結(jié)合而發(fā)揮抑制病原菌增殖的作用，表明pIgR在維持微生物群落以及抵御黏膜表面病原菌入侵方面發(fā)揮著重要作用。白斑綜合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)利用pIgR作為感染日本囊對(duì)蝦()的細(xì)胞表面受體，其胞外部分能夠與WSSV的VP24互作，胞內(nèi)部分則與鈣調(diào)素作用募集網(wǎng)格蛋白和AP-2復(fù)合物促進(jìn)WSSV的侵入。

本研究通過(guò)PCR技術(shù)對(duì)羅非魚(yú)pIgR基因R完整的開(kāi)放閱讀框序列進(jìn)行擴(kuò)增，預(yù)測(cè)了羅非魚(yú)pIgR的蛋白結(jié)構(gòu)，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，檢測(cè)羅非魚(yú)感染羅非魚(yú)湖病毒(TiLV)后脾、腎以及皮膚組織中pIgR表達(dá)的變化，構(gòu)建了重組真核表達(dá)載體pEGFP-R并將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至羅非魚(yú)腦細(xì)胞(TiB)中，初步研究了羅非魚(yú)pIgR對(duì)TiLV增殖的影響， 為羅非魚(yú)的抗病毒免疫研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)采用的健康羅非魚(yú)，平均體重(20±5) g，采購(gòu)自廣東省某養(yǎng)殖場(chǎng)，暫養(yǎng)于120 cm×50 cm×60 cm的玻璃魚(yú)缸中，水溫維持在(28±1)℃且持續(xù)曝氣充氧，定時(shí)定量投喂。表達(dá)載體pEGFP-N1和克隆宿主5購(gòu)自北京天根生物科技有限公司；TiB由珠江水產(chǎn)研究所魚(yú)病室建立并保存； TiLV-2017A由Sven.M.Bergennman博士(德國(guó)動(dòng)物健康研究院) 贈(zèng)送；限制性內(nèi)切酶EcoRI和KpnI、15 000 DNA marker、反轉(zhuǎn)錄試劑盒等購(gòu)于寶生物工程有限公司；RNA提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒和膠回收試劑盒購(gòu)自O(shè)mega生物技術(shù)有限公司；熒光定量試劑盒購(gòu)自艾克瑞生物工程有限公司。

1.2 總RNA的提取以及cDNA的合成

取健康羅非魚(yú)18尾。15尾用于攻毒，每尾腹腔注射200 μL濃度約為10copies/μL的TiLV，剩余3尾注射相同體積PBS作為對(duì)照。攻毒組在注射后的12、24、48、72、96 h參照文獻(xiàn)[4]分別取三尾魚(yú)的脾臟、腎臟、皮膚等組織進(jìn)行后續(xù)研究。使用Total RNA Kit I從收集的樣品中提取總RNA。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳和NANODROP 2000分光光度計(jì)確定RNA質(zhì)量與濃度。參照PrimeScriptRT Reagent Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書合成cDNA，-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 OnpIgR基因的克隆

根據(jù)NCBI上提供的pIgR參考序列(GenBank:MK061423.1)，設(shè)計(jì)R基因ORF序列特異性擴(kuò)增引物。引物名稱及序列如表1所示。 以1.2步驟中獲得的cDNA為模板使用高保真酶Prime STAR MAX，按照50 μL反應(yīng)體系配制反應(yīng)液，即Prime STAR MAX 25 μL，R-EcoRI-F，R-KpnI-R各1 μL，cDNA 2 μL，無(wú)酶水21 μL；反應(yīng)條件為98 ℃ 10 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 10 s，經(jīng)35次循環(huán)后獲得ORF全長(zhǎng)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的凝膠電泳鑒定后，在1 023 bp左右出現(xiàn)單一的目的條帶，采用Gel Extraction Kit(廣州飛揚(yáng)生物工程有限公司，中國(guó))對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化。將純化產(chǎn)物連接至pMD18T載體，轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)，使用氨芐抗性平板進(jìn)行篩選，經(jīng)PCR檢測(cè)陽(yáng)性后，送生工生物工程股份有限公司測(cè)序。

表1 引物信息Tab.1 Primers information

1.4 OnpIgR生物信息學(xué)分析

采用SMART在線服務(wù)器(https://smart.embl-heidelberg.de/smart/set_mode.cgi?NORMAL=1)預(yù)測(cè)R的結(jié)構(gòu)域。通過(guò)I-tasser在線服務(wù)器(https://zhanggroup.org/I-TASSER/)預(yù)測(cè)R的三維結(jié)構(gòu)。使用Cluster-X2.0程序進(jìn)行多物種pIgR氨基酸序列比對(duì)，使用MEGA-X軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)生和進(jìn)化分析，采用鄰位相連法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.5 定量分析TiLV感染后組織中pIgR的表達(dá)變化

根據(jù)得到的ORF序列設(shè)計(jì)了實(shí)時(shí)熒光定量引物(q-pIgR-F/q-pIgR-R)，以β-actin(Tia-β-actin-F/ Tia-β-actin-R)作為內(nèi)參基因(序列見(jiàn)表1)，按照SYBR Green Premix ProHS qPCR Kit 說(shuō)明書對(duì)1.2步驟中所取各組織中的pIgR進(jìn)行定量分析。最后根據(jù)所測(cè)得的Ct值，采用2法計(jì)算pIgR基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.6 真核表達(dá)載體的構(gòu)建

使用限制性內(nèi)切酶EcoRI和KpnI對(duì)擴(kuò)增獲得的R基因以及pEGFP-N1載體進(jìn)行酶切，反應(yīng)條件為37 ℃，1 h。使用Thermo Fisher 的T4連接酶對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接，連接條件為22 ℃ 10 min。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化后，涂布于卡那霉素抗性平板上篩選鑒定，陽(yáng)性克隆經(jīng)PCR以及酶切鑒定后送測(cè)序。序列正確的質(zhì)粒命名為pEGFP-R。使用Omega公司的無(wú)內(nèi)毒素的質(zhì)粒提取試劑盒提取重組質(zhì)粒pEGFP-R，測(cè)定質(zhì)粒濃度后-20 ℃保存。

1.7 Western Blot鑒定

將狀態(tài)良好的TiB細(xì)胞經(jīng)胰酶消化處理后，用含10% 胎牛血清(FBS)的M199培養(yǎng)基制備成含有1×10個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，分別吸取2.5 mL的細(xì)胞懸液接種到六孔板的三個(gè)孔中，待細(xì)胞單層覆蓋到80%～90%左右的時(shí)候，分別向其中的兩孔中轉(zhuǎn)染2 μg的重組質(zhì)粒pEGFP-R以及pEGFP-N1空載，剩下一孔不做轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染方法參照Lipo-fectamine2000(Invitrogen,USA)的說(shuō)明書進(jìn)行。轉(zhuǎn)染36 h后，棄上清，加入200 μL 1× SDS緩沖液收取細(xì)胞樣到1.5 mL的離心管中，混勻后煮沸5 min，12 000離心1 min獲得上清。蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳分離后，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜(NC膜)上進(jìn)行Western blot分析。5%脫脂奶室溫下封閉1 h，將商品化GFP兔抗按照1∶4 000倍稀釋后室溫孵育2 h，加入二抗(1∶4 000稀釋)室溫孵育2 h，加入顯色液顯色，拍照記錄。

1.8 TiB細(xì)胞中OnpIgR過(guò)表達(dá)對(duì)TiLV增殖的影響

將狀態(tài)良好的TiB細(xì)胞于轉(zhuǎn)染前24 h接種到底面積為25 cm的6個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，平均分為2組。 每一組參照Lipofectamine2000說(shuō)明書步驟分別轉(zhuǎn)染50 μg的pEGFP-N1質(zhì)粒和pEGFP-R過(guò)表達(dá)質(zhì)粒，每組設(shè)置三個(gè)平行。并在轉(zhuǎn)染后的36 h時(shí)棄掉培養(yǎng)液，用HBSS清洗兩遍，分別加入濃度約為10copies/μL 的TiLV病毒液各1 mL，在28 ℃的培養(yǎng)箱中孵育1.5 h，之后棄掉病毒液，補(bǔ)加5 mL的含5%FBS的M199培養(yǎng)基，繼續(xù)放入28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在病毒感染后的48 h和72 h收樣。分別對(duì)-1基因，-8和-10基因進(jìn)行定量檢測(cè)。

1.9 數(shù)據(jù)分析

使用GraphPad Prism 8 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的數(shù)據(jù)按照tests方法進(jìn)行顯著性差異分析，>005表示差異不顯著，<005表示差異顯著，<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 羅非魚(yú)pIgR分子特征

通過(guò)PCR擴(kuò)增的基因經(jīng)測(cè)序比對(duì)后，確認(rèn)為羅非魚(yú)pIgR 完整ORF 序列。結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)顯示，羅非魚(yú)pIgR蛋白的第1～20個(gè)氨基酸構(gòu)成一個(gè)信號(hào)肽，第25～130以及第137～229個(gè)氨基酸分別構(gòu)成兩個(gè)Ig樣結(jié)構(gòu)域(圖1-A)；同源建模結(jié)果顯示，pIgR蛋白整體呈扭曲的“L”型，主要由反平行β片層和無(wú)規(guī)卷曲組成(圖1-B)；進(jìn)化樹(shù)分析顯示，pIgR主要分為哺乳類，兩棲類和鳥(niǎo)類，以及硬骨魚(yú)類三個(gè)亞群。其中羅非魚(yú)pIgR與同屬于鱸形目()的大口黑鱸()以及斜帶石斑魚(yú)()的pIgR最為接近(圖2)。

圖1 羅非魚(yú)pIgR蛋白結(jié)構(gòu)域與三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.1 Prediction of tilapia pIgR protein domain and 3D structureA結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)：紅色區(qū)域?yàn)樾盘?hào)肽，綠色區(qū)域?yàn)镮g樣結(jié)構(gòu)域，紫色區(qū)域?yàn)榈蛷?fù)雜度區(qū)；B：三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

圖2 不同物種pIgR蛋白序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of different species pIgR amino acids sequences

2.2 羅非魚(yú)pIgR時(shí)相表達(dá)模式分析

羅非魚(yú)在感染TiLV后，皮膚、脾臟以及腎臟三個(gè)組織器官中pIgR的表達(dá)量均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，感染后24 h皮膚中pIgR的表達(dá)量達(dá)到最高值(圖3-B)；在脾臟和腎臟中則是48 h時(shí)表達(dá)量達(dá)到最高值隨后開(kāi)始下降(圖3-A、3-C)。

圖3 不同組織中的時(shí)相表達(dá)Fig.3 pIgR expression in different tissues at post infectionA：pIgR在脾臟中的時(shí)相；B：pIgR在皮膚中的時(shí)相；C：pIgR在腎臟中的時(shí)相;*表示差異存在顯著性(P<0.05)，圖5同。

2.3 重組真核表達(dá)載體構(gòu)建與鑒定

結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染pEGFP-R在55～70 kDa的位置出現(xiàn)與預(yù)期大小相符的融合蛋白條帶(圖4)，表明重組真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-R可以在細(xì)胞內(nèi)正確表達(dá)出目的蛋白。

圖4 Western-blot鑒定重組質(zhì)粒pEGFP-OnpIgR體外表達(dá)情況Fig.4 Expression of recombinant plasmid pEGFP-OnpIgR in vitroM為蛋白Marker；1為轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒細(xì)胞樣；2為轉(zhuǎn)染pEGFP-n1空載細(xì)胞樣；3為空白TiB細(xì)胞樣

2.4 pIgR過(guò)表達(dá)對(duì)TiLV增殖的影響

圖5結(jié)果顯示，與對(duì)照組細(xì)胞相比，在過(guò)表達(dá)pIgR的細(xì)胞中TiLV感染后48 h和72 h的-8和-10片段的mRNA水平均明顯上調(diào)，病毒拷貝數(shù)也顯著增多，表明pIgR顯著促進(jìn)了TiLV的增殖。

圖5 pIgR過(guò)表達(dá)對(duì)TiLV增殖的影響Fig.5 Effect of pIgR overexpression on TilV proliferation

3 討論

本研究成功克隆了羅非魚(yú)pIgR 完整ORF序列，長(zhǎng)度為1 023 bp，蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)顯示羅非魚(yú)pIgR蛋白具有一個(gè)信號(hào)肽，兩個(gè)Ig樣結(jié)構(gòu)域，同源建模結(jié)果顯示，pIgR蛋白整體呈扭曲的“L”型，主要由反平行β片層和無(wú)規(guī)卷曲組成，與相關(guān)報(bào)道中的魚(yú)類pIgR結(jié)構(gòu)一致，表明羅非魚(yú)的pIgR具備結(jié)合和轉(zhuǎn)運(yùn)多聚免疫球蛋白的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)；系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)結(jié)果顯示，硬骨魚(yú)類pIgR聚為一支，兩棲類和鳥(niǎo)類的聚為一支，哺乳類的聚為一支，且羅非魚(yú)pIgR與同屬于鱸形目的大口黑鱸以及斜帶石斑魚(yú)的pIgR聚為一個(gè)分支，而同屬于鯉科魚(yú)類的草魚(yú)、鯉魚(yú)以及斑馬魚(yú)又聚為一個(gè)分支，表明pIgR具有一定的種屬性差異。RT-qPCR定量結(jié)果顯示，感染TiLV后羅非魚(yú)皮膚、脾臟以及腎臟器官中pIgR的表達(dá)量均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，感染后24 h皮膚中表達(dá)量達(dá)到最高值，隨后開(kāi)始下降；在脾臟和腎臟中則是48 h時(shí)達(dá)到最高值隨后開(kāi)始下降。表明羅非魚(yú)受到外界刺激時(shí)，相對(duì)于中樞免疫器官而言，粘液相關(guān)免疫組織能夠更早地做出免疫反應(yīng)。成功構(gòu)建了羅非魚(yú)pIgR過(guò)表達(dá)受體，并在TiB細(xì)胞中進(jìn)行pIgR過(guò)表達(dá)后顯著促進(jìn)了TiLV的增殖。與NIU等的發(fā)現(xiàn)，WSSV能夠利用pIgR促進(jìn)自身增殖；在LLC-PK1細(xì)胞上過(guò)表達(dá)也能夠促進(jìn)豬流行性腹瀉病毒(PEDV)增殖等研究結(jié)果一致，初步表明TiLV也可能利用pIgR促進(jìn)自身感染。

目前關(guān)于魚(yú)類pIgR 的研究大多涉及對(duì)病原菌的響應(yīng)和表達(dá)模式分析。如pIgR在斜帶石斑魚(yú)、牙鲆()、大菱鲆和鯉魚(yú)等硬骨魚(yú)類組織中均有表達(dá)，且在胃、腸道、鰓和皮膚等粘液相關(guān)組織中的表達(dá)量較高。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)發(fā)現(xiàn)菌液浸泡處理后的鯉魚(yú)腸道中的pIgR表達(dá)量呈先上升后下降的趨勢(shì)。斑馬魚(yú)在感染海豚鏈球菌后，pIgR表達(dá)水平也呈現(xiàn)穩(wěn)定上升趨勢(shì)，但是感染烏鱧彈狀病毒(SHRV)后的斑馬魚(yú)pIgR表達(dá)水平則穩(wěn)定下降。表明病毒刺激引起的pIgR表達(dá)變化與細(xì)菌刺激引起的變化存在著差異，具體原因有待后續(xù)進(jìn)一步研究證明。草魚(yú)浸泡感染柱狀黃桿菌后，pIgR mRNA水平也迅速顯著上升，隨后逐漸下降到對(duì)照水平，并且在草魚(yú)的皮膚中pIgR mRNA的增長(zhǎng)最早，幅度最大，且其在皮膚中的應(yīng)答反應(yīng)比在腸或鰓中更快。除了病原菌，有報(bào)道表明泥鰍在感染了白點(diǎn)蟲(chóng)之后，其脾臟、腎臟、鰓和皮膚中的pIgR表達(dá)量也顯著升高。盡管對(duì)多種不同硬骨魚(yú)類pIgR在應(yīng)對(duì)病原菌或寄生蟲(chóng)感染響應(yīng)的表達(dá)模式有了初步的了解，并提示其在黏膜免疫過(guò)程中發(fā)揮重要的作用，但其潛在的分子機(jī)制仍有待進(jìn)一步闡明。

除了黏膜免疫上的功能，pIgR作為細(xì)胞表面分子受體也常被部分病毒劫持作為入侵的靶點(diǎn)。之前的研究已發(fā)現(xiàn)多種病毒包括RNA 病毒和DNA病毒將pIgR作為病毒入侵的受體進(jìn)入細(xì)胞。如pIgR過(guò)表達(dá)的宿主細(xì)胞感染PEDV之后，PEDV的N蛋白、病毒滴度以及病毒mRNA均顯著增加，表明pIgR促進(jìn)了PEDV在宿主細(xì)胞內(nèi)的增殖。王會(huì)英等發(fā)現(xiàn)，EPC細(xì)胞中干擾素的特異性表達(dá)能夠靶向抑制傳染性造血器官壞死病毒的增殖。而pIgR表達(dá)量的降低能夠?qū)е翴FN-γ表達(dá)水平的上升，從而減低鼠諾如病毒(MNV)的滴度，在pIgR敲降小鼠中，病毒的急性感染也出現(xiàn)減緩。以上研究均表明pIgR在影響病毒入侵過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。而關(guān)于水生動(dòng)物pIgR及病毒的研究，目前較為清晰的是日本囊對(duì)蝦pIgR(MjpIgR)與WSSV之間的互作，該病毒可通過(guò)與MjpIgR結(jié)合后經(jīng)網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞方式進(jìn)入細(xì)胞完成自身增殖。本研究發(fā)現(xiàn)羅非魚(yú)pIgR過(guò)表達(dá)后也促進(jìn)了TiLV的增殖，TiLV是否也是利用pIgR通過(guò)網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞將在后續(xù)的研究中進(jìn)一步闡明。

作為水生動(dòng)物新發(fā)病毒，TiLV的病原學(xué)及致病機(jī)理仍不清楚，本研究對(duì)羅非魚(yú)pIgR的生物學(xué)特性及對(duì)TiLV的增值影響作用進(jìn)行了初步研究，為后續(xù)TiLV致病機(jī)制的研究、抗TiLV藥物的研發(fā)和抗TiLV苗種的培育具有一定的借鑒意義。