王燁明，陳 賡，徐志威，陳 芳，袁漢文，楊代勤,2

(1.長江大學(xué)，湖北荊州 434025；2.湖北省黃鱔工程技術(shù)研究中心，湖北荊州 434025)

幾丁聚糖(chitosan)又名殼聚糖、甲殼質(zhì)、甲殼素等，是幾丁質(zhì)的脫乙?；a(chǎn)物，學(xué)名為β-1，4-聚-葡萄糖胺。幾丁聚糖廣泛分布在蝦、蟹等甲殼類動物的外殼內(nèi)，也是節(jié)肢動物外骨骼的重要組成成分，同時也分布于真菌和藻類等植物的細(xì)胞壁中。從對黃顙魚()、克氏原螯蝦()、俄羅斯鱘()、虹鱒()和凡納濱對蝦()的飼料添加幾丁聚糖研究中可知，適量的添加幾丁聚糖均具有促生長和提高魚體非特異性免疫功能的作用。

黃鱔()，具有高蛋白、低脂肪等特點，深受廣大消費者的喜愛。然而，黃鱔疾病頻發(fā)嚴(yán)重阻礙了我國黃鱔養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。在養(yǎng)殖中如何提高黃鱔的免疫能力，減少疾病的發(fā)生尤為重要。因此，本實驗通過在基礎(chǔ)飼料中添加不同含量的幾丁聚糖，研究其對黃鱔生長性能和非特異性免疫功能的影響，以期為幾丁聚糖在黃鱔養(yǎng)殖中的合理應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗黃鱔全部來自于長江大學(xué)黃鱔養(yǎng)殖試驗基地人工繁育的同批次個體，試驗黃鱔平均體重(15.0 ± 0.5)g/尾?；A(chǔ)飼料為廈門嘉康飼料有限公司生產(chǎn)(飼料配方公司保密)，幾丁聚糖溶液購于江蘇德仁生物科技有限公司，有效濃度為0.6%?；A(chǔ)飼料主要營養(yǎng)組成如表1。實驗飼料按每千克基礎(chǔ)飼料中分別添加1%、2%、3%和4%的幾丁聚料溶液，分別配制10 kg。

表1 基礎(chǔ)飼料的主要營養(yǎng)組成Tab.1 Nutrient composition of basal diets %

1.2 實驗方法

實驗時間為2020年9月22日-11月21日，共60 d。實驗在長江大學(xué)黃鱔養(yǎng)殖試驗基地進(jìn)行。實驗設(shè)置5組，分別為對照組(0添加)、1組(1%)、2組(2%)、3組(3%)、4組(4%)，每個組3個重復(fù)，每個重復(fù)60尾。將實驗黃鱔分別飼養(yǎng)在條件相同的養(yǎng)殖水箱中(長×寬×高：1 m×0.8 m×0.6 m)。實驗期間每天下午18:00投喂一次，投餌量為黃鱔體重2%～5%。每日記錄攝食量，并及時清除殘餌。在試驗結(jié)束禁食24 h后采樣。

1.3 采樣與處理

每組隨機(jī)選取12尾黃鱔，取血液樣品檢測相關(guān)指標(biāo)的變化。4 ℃冰箱中靜置過夜，在4 ℃，4 000 r/min條件下離心10 min制備血清，上清液移置-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 生長性能的測定

實驗結(jié)束以后，統(tǒng)計各個養(yǎng)殖水箱中黃鱔尾數(shù)并稱量總重量。計算增重率、特定生長率、成活率和餌料系數(shù)。計算公式如下:

增重率(WGR)=(-)/×100%

特定生長率(SGR)=(ln-ln)/×100%

存活率(SR)=(/) × 100%

餌料系數(shù)(FCR)=/(-)

式中：為試驗開始時魚體質(zhì)量(g)；為試驗結(jié)束時魚體質(zhì)量(g)；為飼養(yǎng)時間(d)；為初始尾數(shù)；為終末尾數(shù)；為飼料攝入量(g)。

1.5 血清生化指標(biāo)的測定

本試驗共檢測9個生化、免疫指標(biāo)，分別為：總蛋白(TP)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT )、甘油三酯(TG)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、葡萄糖(GLU)、膽固醇(TC)、堿性磷酸酶(AKP)、超氧化物歧化酶(SOD)、酸性磷酸酶(ACP)，采用南京建成生物工程研究所試劑盒進(jìn)行測定。

1.6 數(shù)據(jù)處理

所有試驗結(jié)果均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。試驗數(shù)據(jù)采用SPSS17.0數(shù)據(jù)統(tǒng)計軟件包中的單因素方差分析(One-way ANOVA)和Duncan氏多重比較，檢驗各組的差異，不同的小寫字母表示各組間差異顯著(<0.05)。

2 實驗結(jié)果與分析

2.1 飼料中添加幾丁聚糖對黃鱔生長性能及存活率的影響

由表2可知，飼料中添加幾丁聚糖的終末均重、增重率、特定生長率都顯著高于對照組，其中幾丁聚糖添加量為3%最高，顯著高于其他組，隨著幾丁聚糖添加量的逐漸增加，呈現(xiàn)出先升高后下降的趨勢。同時，各組的餌料系數(shù)都顯著低于對照組，飼料中幾丁聚糖添加量為3%的餌料系數(shù)著低于其他組，餌料系數(shù)變化趨勢隨飼料中幾丁聚糖添加量的逐漸增加，呈現(xiàn)出先降低后升高的趨勢。在存活率指標(biāo)上各組間無顯著差異。

表2 飼料中添加幾丁聚糖對黃鱔生長及存活率的影響Tab.2 The influence of the feed added different proportion of Chitosan on the growth and survival rate in M.albus

2.2 飼料中添加幾丁聚糖對黃鱔血清生化指標(biāo)的影響

由表3可知，飼料中添加幾丁聚糖時能顯著提高黃鱔血清中的TP水平，各組均顯著高于對照組。當(dāng)飼料中添加幾丁聚糖時，TP含量隨幾丁聚糖添加量的增加呈先升高后降低的趨勢，當(dāng)飼料中添加幾丁聚糖為3%時血清中的TP含量最高，顯著高于其他各組。添加幾丁聚糖時黃鱔血清中TC、TG含量隨幾丁聚糖添加量的增加呈先降低后升高的趨勢，且均顯著低于對照組。當(dāng)飼料中添加幾丁聚糖為3%時，TC、TG含量最低，顯著低于其他試驗組。飼料中添加幾丁聚糖為3%時能顯著提高黃鱔血清中的ALT活性，但是其他各實驗組與對照組之間均無顯著差異。GLU、AST活性各組間無顯著差異。

表3 飼料中添加不同含量幾丁聚糖對黃鱔血清生化指標(biāo)影響Tab.3 The influence of the feed added different proportions of chitosan on the Serum biochemical indexes in M.albus

2.3 飼料中添加幾丁聚糖對黃鱔免疫指標(biāo)的影響

由表4可知，飼料中添加幾丁聚糖時能提高黃鱔血清中AKP、ACP和SOD的活性，且均顯著高于對照組。當(dāng)飼料中添加幾丁聚糖時，AKP和 SOD二者活性隨飼料中幾丁聚糖的添加量增加呈先升高后降低的趨勢，當(dāng)添加量為3%時，黃鱔血清中AKP和SOD活性最高，顯著高于其他各個組。當(dāng)添加量為4%時黃鱔血清中ACP活性最高，顯著高于其他各個組。

表4 飼料中添加幾丁聚糖對黃鱔免疫指標(biāo)的影響Tab.4 The influence of the feed added different proportions of chitosan on the immune indexes in M.albus

3 討論

3.1 飼料中添加幾丁聚糖對黃鱔生長性能的影響

飼料中添加幾丁聚糖對不同魚類的生長性能有著結(jié)果差異。本實驗研究結(jié)果顯示，飼料中添加幾丁聚糖能夠顯著提高黃鱔的增重率和特定生長率，降低餌料系數(shù)，這與黃顙魚()、虹鱒()和凡納濱對蝦()的結(jié)果相似。張嚴(yán)偉等和LIN等的研究結(jié)果表明飼料中添加25、50、100 mg/kg的低聚殼聚糖和添加0.2%殼聚糖對鯉魚()的生長性能無顯著效果。李麗鵑等研究發(fā)現(xiàn)隨著殼聚糖添加量的增加，其促生長的效果并未有相同的增長效果，反而有所下降。在本次實驗中，黃鱔飼料中幾丁聚糖最適添加量為3%，當(dāng)超過最適添加量后，生長性能并沒有繼續(xù)提升，反而有所下降，這與李麗鵑等的研究結(jié)果相符。推測認(rèn)為添加較低的幾丁聚糖時，可能有顯著的促生長效果，但隨著添加量的增加，促生長效果下降甚至抑制生長。幾丁聚糖能促進(jìn)動物生長可能是其能夠改變腸道結(jié)構(gòu)、提高消化酶的活性，從而提高機(jī)體對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收能力，過量添加會因其具有很強(qiáng)的吸附蛋白質(zhì)或離子的能力，導(dǎo)致必需的營養(yǎng)物質(zhì)被其吸附而降低消化吸收能力，從而降低或抑制魚類的生長。

3.2 飼料中添加幾丁聚糖對黃鱔血清生化指標(biāo)的影響

血清總蛋白(TP)是血清中包含的各種蛋白質(zhì)的總稱，能夠間接反映出血清中各種免疫酶的總體含量，是衡量動物機(jī)體免疫力的一項重要指標(biāo)。本試驗顯示，飼料中添加幾丁聚糖時黃鱔血清中的TP含量均顯著高于對照組，隨幾丁聚糖水平的增加，TP含量先升后降，添加量在3%時TP含量最高。王紅權(quán)等研究表明在飼料中添加0.5%的殼聚糖能顯著增加草魚()血清含量，強(qiáng)俊等和張干等研究在飼料中添加殼聚糖并不影響羅非魚()和中華絨螯蟹()血清中的含量。本實驗結(jié)果與其它水產(chǎn)動物報道存在差異可能是不同水產(chǎn)動物的免疫機(jī)能和消化生理結(jié)構(gòu)不同，對營養(yǎng)物質(zhì)的需求存在差異而導(dǎo)致。

谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)是重要的氨基轉(zhuǎn)移酶，常用來反映氨基酸代謝和指示肝功能狀況，正常情況下血液中ALT和AST活性較低。在本試驗中，各組除了幾丁聚糖添加量為3%的試驗組ALT活性有顯著性上升，其它各組的ALT和AST活性與對照組相比均無顯著差異。黃鱔血清中ALT活性升高，表明黃鱔肝臟可能受到一定的損傷，細(xì)胞膜通透性增大，大量轉(zhuǎn)氨酶進(jìn)入血液，但并不能憑ALT活性顯著升高就判斷黃鱔肝臟損傷。幾丁聚糖添加量為3%的實驗組ALT活性較高，可能是取樣或試驗中操作誤差造成的。

血清中膽固醇(TC)和甘油三酯(TG)是反映機(jī)體的肝臟脂代謝和對脂類吸收狀況的重要指標(biāo)。本試驗中，在飼料中添加幾丁聚糖能顯著降低黃鱔血清中的TC和TG含量，隨添加量的TC和TG含量增加先降后升，添加量為3%時TC和TG含量顯著低于其它各組。強(qiáng)俊等實驗發(fā)現(xiàn)在飼料中添加殼聚糖能降低羅非魚血清中的TC和TG含量。試驗結(jié)果本實驗結(jié)果相似。這說明黃鱔飼料中添加幾丁聚糖能夠降低血清中TC和TG含量，干擾體內(nèi)脂肪代謝生理，降低機(jī)體脂肪的蓄積，過多在飼料中添加幾丁聚糖，會引起魚體脂肪代謝能力下降，引起TC和TG含量上升。

3.3 飼料中添加幾丁聚糖對黃鱔非特異性免疫的影響

酸性磷酸酶(ACP)與堿性磷酸酶(AKP)是動物體內(nèi)參加免疫防御的重要的水解酶，可以催化正磷酸單酯而為機(jī)體的磷代謝和核酸代謝提供磷酸基團(tuán)，與魚類營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收和分泌有關(guān)。其活性的高低可以用來判斷魚類非特異性免疫功能的強(qiáng)弱。李麗鵑等研究發(fā)現(xiàn)在黃顙魚飼料中添加殼聚糖時，添加 25 mg/kg 殼聚糖的試驗組的酸性磷酸酶和堿性磷酸酶活性均顯著高于其它各組，隨殼聚糖添加量的增加二者活性下降，甚至低于對照組；肖艷翼等研究發(fā)現(xiàn)在俄羅斯鱘()飼料中添加殼聚糖時，添加2.5 g/kg殼聚糖的實驗組的酸磷酸酶和堿性磷酸酶活性達(dá)到最大值，且隨著殼聚糖添加量的增加，二者活性有所下降。本試驗結(jié)果顯示，在飼料中添加幾丁聚糖時能顯著提高黃鱔血清中的AKP與ACP活性，當(dāng)飼料中添加的幾丁聚糖溶液添加量為3%時AKP活性最高，幾丁聚糖添加量為4%時， ACP活性最高。二者活力的提高有助于機(jī)體的代謝，從而黃鱔體質(zhì)，進(jìn)而間接增強(qiáng)其非特異性免疫功能。

超氧化物歧化酶(SOD)是反映機(jī)體抗氧化能力的重要指標(biāo)，其可以清除體內(nèi)多余的自由基，使自由基的形成與消除處于一種動態(tài)平衡中，免除其對生物分子的損傷。本試驗結(jié)果顯示，添加幾丁聚糖的各組黃鱔血清中SOD活性均顯著高于對照組，且添加量3%時活性最大，隨著添加量的增加SOD活性先升后降。這與在羅非魚()、星斑川鰈()、黃顙魚()、克氏原螯蝦()和中華絨螯蟹等水產(chǎn)動物上的研究結(jié)果相似。這說明飼料中添加適量的幾丁聚糖能促使黃鱔免疫器官的發(fā)育，提高血清中SOD的活力，從而增強(qiáng)其抗氧化能力，減少氧化應(yīng)激損傷，增強(qiáng)機(jī)體的非特異免疫能力。王紅權(quán)等和蔣錦坤等實驗表明飼料中添加殼聚糖對草魚和虹鱒血清中的SOD活性沒有顯著性影響。造成這些結(jié)果有所差異除了養(yǎng)殖品種和養(yǎng)殖環(huán)境的不同外，還可能與飼料中維生素C的含量有關(guān)。

本實驗發(fā)現(xiàn)在黃鱔基礎(chǔ)飼料中適宜添加幾丁聚糖能夠提高黃鱔的生長性能和非特異性免疫功能，參考幾丁聚糖3%的添加量為黃鱔的臨界點，過多添加會降低甚至抑制黃鱔的生長和非特異性免疫功能。造成這種情況可能是過多的幾丁聚糖在黃鱔體內(nèi)影響了黃鱔對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收能力，干擾了黃鱔的代謝能力，從而影響黃鱔的生長和免疫功能。

4 結(jié)論

在本實驗中，飼料中添加幾丁聚糖能夠顯著提高黃鱔的生長性能和增強(qiáng)非特異性免疫功能。綜合來看，黃鱔飼料中幾丁聚糖溶液的適宜添加量為3%。