劉 德，閆卉果，董智玲，羅 輝，2，葉 華，2 ，何文平，2

(1.西南大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，重慶，402460；2.淡水魚(yú)類(lèi)資源與生殖發(fā)育教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶，402460；3.內(nèi)江市東興區(qū)漁業(yè)發(fā)展中心，四川內(nèi)江，641100)

多鱗白甲魚(yú)()屬硬骨魚(yú)綱(Osteichthyes)鯉形目(Cypriniformes)鯉科(Cyprinidae)鲃亞科(Barbinae)突吻魚(yú)屬()，俗稱(chēng)石口魚(yú)、錢(qián)魚(yú)、赤鱗魚(yú)，被稱(chēng)為水中“活化石”。多鱗白甲魚(yú)市場(chǎng)價(jià)格昂貴，是山區(qū)漁業(yè)中頗受青睞的經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)，主要分布在嘉陵江、漢江中上游，淮河、海河上游，是我國(guó)現(xiàn)存鲃亞科魚(yú)類(lèi)中分布記錄緯度最高的魚(yú)類(lèi)。由于受水質(zhì)污染、過(guò)度捕撈、氣候變化等因素的影響，多鱗白甲魚(yú)野生資源匱乏，目前已被列為國(guó)家二級(jí)保護(hù)動(dòng)物。

目前多鱗白甲魚(yú)人工養(yǎng)殖苗種主要來(lái)源于天然水域，而捕撈的苗種無(wú)法滿足大規(guī)模養(yǎng)殖的需求，因此亟待解決多鱗白甲魚(yú)苗種規(guī)?；庇募夹g(shù)難題。本研究通過(guò)觀察多鱗白甲魚(yú)胚胎和仔稚魚(yú)發(fā)育過(guò)程，描述該魚(yú)胚胎和仔稚魚(yú)發(fā)育特征和時(shí)序，以期為其人工繁殖和苗種培育技術(shù)建立提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 親魚(yú)來(lái)源

2015年3月，在重慶市巫山縣大寧河采集多鱗白甲魚(yú)，成功培育至性腺成熟。繁殖用雌性親魚(yú)腹部飽滿，生殖孔紅腫，擠壓腹部時(shí)卵粒從生殖孔流出，在陽(yáng)光照射下，背鰭具五彩色橫斑紋；雄魚(yú)顏色比雌魚(yú)暗淡，吻部有明顯珠星，雄性親魚(yú)腹部被擠壓后，泄殖孔流出乳白色精液。

1.2 授精與孵化

2019年3月，從2 000尾親魚(yú)中篩選出3～5齡雌魚(yú)60尾，雄魚(yú)120尾，通過(guò)人工干法授精得到受精卵。用羽毛將受精卵平鋪在提前清洗、消毒的自制孵化箱內(nèi)，孵化箱用高15 cm的木質(zhì)框架制成，釘在孵化箱底部的篩網(wǎng)規(guī)格為60目，孵化箱規(guī)格為40 cm × 80 cm。之后放在直徑2 m的圓形孵化池中，采用微流水刺激進(jìn)行孵化，水深1.5 m，受精卵孵化水溫為(17.2±0.5)℃，水體溶氧為7.3～8.4 mg/L，pH 7.0～7.5。

1.3 觀察與取樣

從孵化箱中隨機(jī)選擇30～50個(gè)胚胎用ZSA0850體式顯微鏡連續(xù)觀察胚胎發(fā)育，并用Canon PowerShot G11數(shù)碼相機(jī)進(jìn)行顯微拍照，最后利用Photoshop CS5.0對(duì)拍攝的胚胎發(fā)育照片進(jìn)行修剪編排。

從出現(xiàn)初孵仔魚(yú)開(kāi)始，隨機(jī)取樣50尾，使用Olympus sz61解剖鏡和ZSA0850體式顯微鏡連續(xù)觀察仔、稚魚(yú)發(fā)育，并用Canon PowerShot G11數(shù)碼相機(jī)進(jìn)行顯微拍照記錄。

胚胎發(fā)育所需積溫計(jì)算：胚胎發(fā)育各時(shí)期的積溫時(shí)長(zhǎng)=平均水溫(℃)×此階段胚胎發(fā)育所用時(shí)間(h)。

2 結(jié)果與分析

2.1 多鱗白甲魚(yú)胚胎發(fā)育

多鱗白甲魚(yú)的發(fā)育過(guò)程分為受精卵形成、卵裂、囊胚、原腸胚、神經(jīng)胚、器官形成和出膜共7個(gè)階段25個(gè)時(shí)期(表1，圖Ⅰ)。在水溫為(17.2±0.5) ℃的條件下，多鱗白甲魚(yú)胚胎耗時(shí)147 h 30 min出膜，有效積溫達(dá)到2 582.56 ℃·h。

表1 多鱗白甲魚(yú)胚胎發(fā)育時(shí)序Tab.1 Time sequence of embryonic development of V.macrolepis

2.1.1 受精卵及胚盤(pán)形成

多鱗白甲魚(yú)的受精卵為卵圓形，呈金黃色或白色，粘性，卵徑為(2.46 ± 0.12 )mm，卵膜吸水后直徑膨脹到(2.87±0.36) mm，見(jiàn)圖1-B。受精1 h48 min后，動(dòng)物極在受精卵的上端，植物極在下端，可見(jiàn)受精卵的細(xì)胞質(zhì)緩慢聚集向動(dòng)物極，動(dòng)物極由此出現(xiàn)明顯的放射狀黑斑，隆起形成胚盤(pán)，此階段為胚盤(pán)形成期，如圖1-C所示。

2.1.2 卵裂期

受精卵第一次分裂開(kāi)始于受精后3 h 38 min，在胚盤(pán)的中心出現(xiàn)了不斷加深的裂溝，最終發(fā)展成縱向溝，將胚盤(pán)分成兩個(gè)同樣大的細(xì)胞，進(jìn)入2細(xì)胞期，如圖1-D所示。受精后4 h 15 min，出現(xiàn)第二次分裂，第二次分裂與第一次分裂面呈垂直的十字形，兩次分裂后，產(chǎn)生4個(gè)大小近似的細(xì)胞，該階段為4細(xì)胞期，如圖1-E所示。第三次分裂發(fā)生在受精后5 h 2 min，分裂溝與第一次分裂面平行，形成了8個(gè)同樣大的細(xì)胞，呈兩排分布，見(jiàn)圖1-F。第四次分裂在受精后5 h 23 min開(kāi)始，有兩條分裂溝出現(xiàn)，形成16個(gè)細(xì)胞，見(jiàn)圖1-G。第五次分裂在受精后6 h 13 min，細(xì)胞大小有著略微的差別，邊緣的細(xì)胞稍大一些且規(guī)則相連，形成32個(gè)細(xì)胞，如圖1-H所示。多細(xì)胞期在受精后7 h 38 min，細(xì)胞經(jīng)過(guò)數(shù)次分裂后，細(xì)胞之間的界限分明但排列并不規(guī)則，如圖1-I所示。

2.1.3 囊胚期

受精后9 h 32 min，胚盤(pán)細(xì)胞體積越變?cè)叫?，受精卵的一端高度隆起，囊胚形成，如圖1-J所示。受精后19 h 20 min，囊胚層較早期底，這一時(shí)期被稱(chēng)為囊胚中期，如圖1-K所示。受精后22 h 2 min，囊胚變得更加扁平，細(xì)胞向下擴(kuò)張，并開(kāi)始向卵黃下包，胚胎進(jìn)入囊胚晚期，如圖1-L所示。

2.1.4 原腸胚期

原腸胚早期在受精后33 h 15 min，囊胚細(xì)胞沿卵黃向下擴(kuò)張至1/2處，如圖1-M所示。原腸胚中期在受精后39 h 7 min，胚層繼續(xù)下包至1/2～2/3處，如圖1-N所示。原腸胚晚期在受精后45 h 19 min，后胚盾開(kāi)始顯現(xiàn)，胚層下包卵黃囊約3/4處，見(jiàn)圖1-O。

2.1.5 神經(jīng)胚期

神經(jīng)胚期在受精后50 h 24 min，胚層繼續(xù)下包，胚體背部變厚并形成一條神經(jīng)索，如圖1-P所示。胚孔封閉期在受精后43 h 37 min，隨著胚盤(pán)下包擴(kuò)張，胚孔漸漸消失，如圖1-Q所示。

2.1.6 器官形成期

肌節(jié)出現(xiàn)期在受精后56 h，在胚胎中心產(chǎn)生2-3對(duì)肌節(jié)，可看到胚體雛形，如圖1-R所示。眼囊期在受精后60 h 39 min，胚體頭兩側(cè)向外凸起，從而形成一對(duì)較大的視泡，如圖1-S所示。尾芽出現(xiàn)在受精后65 h 48 min，此時(shí)卵黃開(kāi)始變小，胚胎的尾部突出，進(jìn)入尾芽期，見(jiàn)圖1-T。肌肉效應(yīng)期在受精后73 h 21 min，此時(shí)胚體繼續(xù)發(fā)育，頭部變大，可觀察到胚體中部，胚體頻繁扭動(dòng)，頻率9～10次/min，見(jiàn)圖1-U。耳石出現(xiàn)期在受精后82 h 42 min，可見(jiàn)眼囊后方有兩個(gè)透明晶體耳石，見(jiàn)圖1-V。心臟跳動(dòng)期在受精后95 h 55 min，心臟開(kāi)始有節(jié)奏地跳動(dòng)，心跳次數(shù)為35～40次/min，如圖1-W所示。出膜前期在受精后103 h 31 min，腦部前、中、后三部分也可清晰分辨，如圖1-X所示。

2.1.7 出膜階段

受精后96 h，胚胎持續(xù)劇烈擺動(dòng)，心臟跳動(dòng)速度變快，在尾巴擺動(dòng)的幫助下，仔魚(yú)開(kāi)始出膜；受精后147 h 30 min，一半仔魚(yú)出膜，至受精后156 h全部仔魚(yú)出膜。魚(yú)苗剛出膜時(shí)沒(méi)有游泳能力，全身透明，背部紋絡(luò)清晰可見(jiàn)，腹部下有一個(gè)橢圓形的卵黃囊，心率114～128次/min，體長(zhǎng)(8.86±0.52)mm，如圖1-Y所示。

圖1 多鱗白甲魚(yú)的胚胎發(fā)育

A.成熟卵；B.受精卵；C.胚盤(pán)隆起；D.2細(xì)胞期；E.4細(xì)胞期；F.8細(xì)胞期；G.16細(xì)胞期；H.32細(xì)胞期；I.多細(xì)胞期；J.囊胚早期；K.囊胚中期；L.囊胚晚期；M.原腸早期；N.原腸中期；O.原腸晚期；P.神經(jīng)胚期；Q.胚孔封閉期；R.體節(jié)出現(xiàn)期；S.眼基出現(xiàn)期；T.尾芽期；U.肌肉效應(yīng)期；V.耳石出現(xiàn)期；W.心臟

跳動(dòng)期；X.出膜前期；Y.出膜

2.2 多鱗白甲魚(yú)仔魚(yú)發(fā)育

多鱗白甲魚(yú)仔魚(yú)的生長(zhǎng)和發(fā)育特征詳見(jiàn)圖2。初孵仔魚(yú)全長(zhǎng)(8.86 ± 0.52)mm。整個(gè)魚(yú)體呈白色或金黃色，全身無(wú)色素。仔魚(yú)頭部與卵黃囊緊密相接的地方可見(jiàn)黑色的耳石，下端為不斷跳動(dòng)的心臟，心率128次/min。魚(yú)體前下方有一個(gè)圓球狀的卵黃囊，約占魚(yú)體整個(gè)長(zhǎng)度的2/5，內(nèi)含有大量卵黃；后端為長(zhǎng)條狀，占總長(zhǎng)度的3/5。2 d仔魚(yú)，眼出現(xiàn)黑色素，頭部上方有少量星狀黑色素斑點(diǎn)，星狀斑點(diǎn)順著蔓延至背部并且逐漸減少；心臟沿卵黃囊下端開(kāi)始變紅形成血液，最后一節(jié)尾椎骨向上微微翹起。3 d仔魚(yú)，眼囊內(nèi)的黑色素增加，圍心腔擴(kuò)大，卵黃囊上有淡紅色的血絡(luò)分布一直蔓延到肛門(mén)處，卵黃囊顯著變小，變成棒槌形。4 d仔魚(yú)，體表和背鰭原基處黑色素增加。5 d仔魚(yú)，黑色素向腹部蔓延，胸鰭舒展開(kāi)來(lái)，為扇形，卵黃減小呈細(xì)條狀，運(yùn)動(dòng)能力變強(qiáng)。尾部出現(xiàn)扇形透明狀的尾鰭原基。6 d仔魚(yú)，卵黃囊消失，進(jìn)入外源性營(yíng)養(yǎng)階段，顯微鏡下可以看到明顯的肛突。7 d仔魚(yú)，體表黑色素增加且變得集中，尾鰭黑色素呈輻射型分布，向鰭條演變。8 d仔魚(yú)，第一鰾室出現(xiàn)，鰾室附近黑色素極多，連成線狀同時(shí)在腹部出現(xiàn)黑色素，卵黃繼續(xù)減少，魚(yú)體分布血管呈網(wǎng)狀；尾椎微上翹，背鰭分化，可短時(shí)平游。10 d仔魚(yú)，出現(xiàn)條雛形尾鰭，腸道已經(jīng)貫通。15 d仔魚(yú)消化系統(tǒng)進(jìn)一步完善。20 d仔魚(yú)，出現(xiàn)背鰭鰭條，腹部鰭?cǎi)扪由熘列伥捄缶?，臀鰭開(kāi)始分化。21 d仔魚(yú)，黑色素遍布整個(gè)魚(yú)體，第二鰾室出現(xiàn)，尾鰭開(kāi)始分叉。34 d魚(yú)體開(kāi)始出現(xiàn)第一枚鱗片，進(jìn)入稚魚(yú)期。70 d魚(yú)體鱗片已發(fā)育完全，各鰭也已長(zhǎng)成，魚(yú)體顏色和體型接近于成魚(yú)，進(jìn)入幼魚(yú)階段。

圖2 多鱗白甲魚(yú)仔稚魚(yú)發(fā)育Fig.2 The larvae and juvenile development of V.macrolepis

3 討論

3.1 多鱗白甲魚(yú)胚胎發(fā)育特點(diǎn)

多鱗白甲魚(yú)的卵為粘性、沉性，其成熟卵類(lèi)似于細(xì)鱗裂腹魚(yú)()，與其他魚(yú)類(lèi)胚胎發(fā)育特點(diǎn)比較具體見(jiàn)表2。卵徑比尖裸鯉()、哲羅鮭()小，比黑斑狗魚(yú)()、胭脂魚(yú)()、桂華鯪()和歐洲舌齒鱸()大，多鱗白甲魚(yú)受精卵與同為鲃亞科的厚唇裸唇魚(yú)()和云南光唇魚(yú)()相比，都是大型卵。盡管如此，具有低溫繁殖習(xí)性的多鱗白甲魚(yú)的卵徑較一些棲息于熱帶或亞熱帶的魚(yú)類(lèi)要大，這可能是多鱗白甲魚(yú)適應(yīng)低溫環(huán)境的一種繁殖策略：在較低溫度條件下，孵化期長(zhǎng)、代謝率低，對(duì)大卵有利。同時(shí)，較大卵徑意味著含有更多的能量和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，有利于應(yīng)對(duì)繁殖季節(jié)水溫低、餌料生物匱乏的惡劣條件。成熟受精卵的大小對(duì)早期發(fā)育有重要意義，一般而言卵黃較大，儲(chǔ)存的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)越多，對(duì)器官分化和胚胎發(fā)育越有利，而較小的卵死亡率更高，但卵徑越大，胚胎發(fā)育有效積溫越高，胚胎發(fā)育越慢。與其他魚(yú)類(lèi)相比，多鱗白甲魚(yú)的受精卵偏大，理論上會(huì)導(dǎo)致整個(gè)胚胎發(fā)育過(guò)程時(shí)間偏長(zhǎng)，但由于本實(shí)驗(yàn)中使用的水溫較高，從而使多鱗白甲魚(yú)胚胎發(fā)育時(shí)間甚至低于卵徑較小的魚(yú)類(lèi)。

表2 多鱗白甲魚(yú)與其他魚(yú)類(lèi)胚胎發(fā)育特點(diǎn)比較Tab.2 Comparison of embryonic development characteristics between V.macrolepis and other fishes

3.2 多鱗白甲魚(yú)胚胎發(fā)育對(duì)水溫的要求

魚(yú)類(lèi)在進(jìn)化過(guò)程中，對(duì)生活環(huán)境也表現(xiàn)出適應(yīng)性，一定積溫下才能保證仔魚(yú)正常出膜和成活。在(17.2±0.5)℃下，多鱗白甲魚(yú)胚胎發(fā)育歷時(shí)147 h 30 min，積溫2 537.82 ℃·h時(shí)70%出膜，胚胎發(fā)育的積溫比川陜哲羅鮭()6 292.50 ℃·h、黑斑狗魚(yú)()4 511.50 ℃·h和尖裸鯉2 737.52 ℃·h等冷水性魚(yú)類(lèi)低，但比歐洲舌齒鱸()2 302.00 ℃·h、厚唇裸唇魚(yú)1 962.00 ℃·h和桂華鯪()1 000.00 ℃·h高。這與郭文學(xué)等的研究結(jié)論相同，即較高溫度下繁殖的溫水性魚(yú)類(lèi)的胚胎發(fā)育時(shí)間比較低溫度下繁殖的冷水性和亞冷水性魚(yú)類(lèi)要短。而多鱗白甲魚(yú)作為孵化率較低的亞冷水性魚(yú)類(lèi)，較低溫度雖使其孵化時(shí)間延長(zhǎng)，但同時(shí)也抑制了某些細(xì)菌類(lèi)病害或傳染病的發(fā)生提高了其孵化率。

3.3 多鱗白甲魚(yú)仔稚魚(yú)發(fā)育特征分析

殷名稱(chēng)指出，卵的大小和初孵仔魚(yú)大小密切相關(guān)，個(gè)體大的仔魚(yú)生長(zhǎng)迅速，存活率高。同時(shí)，大卵黃可為仔魚(yú)提供更多的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，延長(zhǎng)內(nèi)外營(yíng)養(yǎng)源轉(zhuǎn)化時(shí)間，以提高野外生存的成活率。多鱗白甲魚(yú)初孵仔魚(yú)全長(zhǎng)(8.86±0.52)mm，大于小裂腹魚(yú)()(7.5 mm)、松潘裸鯉()(8.0 mm)、云南裂腹魚(yú)()(8.0 mm)和塔里木裂腹魚(yú)()(7.0～8.0 mm)，與青海湖裸鯉()(8.9 mm)接近，比尖裸鯉(10.27 mm)和拉薩裂腹魚(yú)()(10.71±0.28) mm小。

營(yíng)養(yǎng)轉(zhuǎn)化是魚(yú)類(lèi)在早期發(fā)育過(guò)程中生命活動(dòng)最敏感的時(shí)期，也稱(chēng)為種苗人工繁育的開(kāi)口期。多鱗白甲魚(yú)6 d時(shí)卵黃囊基本消失，進(jìn)入外源性營(yíng)養(yǎng)階段，比塔里木裂腹魚(yú)(5 d)長(zhǎng)，比尖裸鯉(20 d)和四川裂腹魚(yú)()(18 d)短。魚(yú)類(lèi)仔魚(yú)的營(yíng)養(yǎng)轉(zhuǎn)化有兩種方式，一種為營(yíng)養(yǎng)由內(nèi)源性直接轉(zhuǎn)化為外源性，即在卵黃消失完全之后開(kāi)口攝食；內(nèi)源性營(yíng)養(yǎng)就越充足，仔魚(yú)處于內(nèi)源性營(yíng)養(yǎng)及混合營(yíng)養(yǎng)階段的時(shí)間就越長(zhǎng)，這對(duì)仔魚(yú)建立初次攝食、提高存活率具有重要的意義。另一種是混合性營(yíng)養(yǎng)，即仔魚(yú)在還有剩余的卵黃物質(zhì)即開(kāi)口攝食。仔魚(yú)卵黃囊內(nèi)的卵黃不能滿足多鱗白甲魚(yú)正?；顒?dòng)的能量需求，因此在混合營(yíng)養(yǎng)期階段，也就是孵出3～5 d時(shí)必須及時(shí)補(bǔ)充足夠的營(yíng)養(yǎng)來(lái)源以滿足多鱗白甲魚(yú)生長(zhǎng)發(fā)育需要。

多鱗白甲魚(yú)仔魚(yú)外源性營(yíng)養(yǎng)階段開(kāi)始于6日齡，仔魚(yú)初次攝食的數(shù)量和質(zhì)量也是影響仔魚(yú)存活的關(guān)鍵所在，隨著日齡的增加及消化器官的不斷完善，仔魚(yú)對(duì)營(yíng)養(yǎng)的需求不斷增加，因此，在早期培育過(guò)程中適當(dāng)調(diào)整餌料的投喂次數(shù)、每次投喂量，再加上適時(shí)分池處理將有利于提高魚(yú)苗成活率。