賈國超，陳曉鳳，張軍，王嵐，職愛民，陳文博，李靖靖

（鄭州工程技術(shù)學(xué)院化工食品學(xué)院，河南鄭州 450044）

益生菌是一類攝入充足的活菌，能維護(hù)宿主機(jī)體微生態(tài)平衡、有益于機(jī)體健康的微生物，主要來源于乳桿菌屬、乳球菌屬、明串珠菌屬、鏈球菌屬、腸球菌屬、雙歧桿菌屬和酵母菌屬等[1]?？萍冀缗c產(chǎn)業(yè)界在益生菌安全性、功效性和生產(chǎn)技術(shù)上開展了大量研究，發(fā)現(xiàn)益生菌能在保證安全性的前提下發(fā)揮多種益生功能，如抑制金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等病原菌的生長或生物膜的形成，維持腸道菌群平衡，降低膽固醇水平，增強(qiáng)機(jī)體免疫功能，緩解便秘，改善骨質(zhì)疏松癥狀等，為益生菌在保健食品領(lǐng)域中應(yīng)用提供了重要科技支撐[2-7]。目前，國內(nèi)外市場上已陸續(xù)出現(xiàn)可緩解或治療口腔疾病、胃腸道疾病、糖尿病、骨質(zhì)疏松等多種疾病的商品化益生菌[8]。此外，益生菌還被廣泛應(yīng)用于巧克力、涂抹醬、糖衣以及烘焙食品中。為了充分發(fā)揮益生菌的優(yōu)越性能并達(dá)到維護(hù)機(jī)體健康效果，益生菌必須能耐受胃的低pH 環(huán)境并保持足夠的數(shù)量和活性并順利到達(dá)腸道（特別是大腸或結(jié)腸），尤其是用于烘焙食品中的益生菌對益生菌的性質(zhì)要求更高，不僅要耐受烤箱高溫，還需在食品貨架期期間保持穩(wěn)定。但是益生菌的生產(chǎn)過程（溫度、氧氣和剪切力等）、儲(chǔ)存過程（水分、氧氣和與溫度等）以及通過胃腸道的過程都會(huì)影響益生菌的活力，因此如何保持益生菌的高活性和穩(wěn)定性顯得非常重要[9]。

具有生物相容性和可降解性的聚合物，可作為益生菌的給藥載體（見表1），能增強(qiáng)益生菌活性、延長儲(chǔ)存時(shí)間、減少益生菌在胃部的損失，甚至實(shí)現(xiàn)結(jié)腸和粘膜的靶向遞送，為高活性益生菌在食品工業(yè)中的應(yīng)用提供了巨大潛力。本文闡述了用于封裝益生菌的聚合物載體類型、評價(jià)方式以及對基于聚合物載體的靶向益生菌遞送系統(tǒng)存在的問題進(jìn)行了分析與展望，以期為靶向益生菌遞送系統(tǒng)在食品領(lǐng)域的相關(guān)研究及應(yīng)用提供參考。

表1 用于遞送益生菌的部分聚合物載體Table 1 Part of polymer carrier for delivery of probiotics

1 封裝益生菌的聚合物載體

隨著益生菌在食物基化合物和非食物基化合物的廣泛應(yīng)用，用于封裝益生菌的各類聚合物因具有生物相容性、可生物降解、可加工且對益生菌中性等特點(diǎn)也受到研究者的普遍關(guān)注。目前這些聚合物主要分為酶敏感聚合物、氧化還原敏感聚合物、pH 敏感聚合物以及其他聚合物。

1.1 酶敏感聚合物

酶敏感聚合物是益生菌靶向遞送的主要載體之一。直鏈淀粉、殼聚糖、硫酸軟骨素、環(huán)糊精、右旋糖酐、菊粉、瓜爾豆膠、果膠和刺槐豆膠等多糖類物質(zhì)均屬于酶敏感聚合物，可用作載體將益生菌靶向遞送至結(jié)腸[19]。其主要機(jī)制是結(jié)腸中分泌了多種水解酶，如β-D-半乳糖苷酶、β-D-葡萄糖苷酶、糖苷酶、淀粉酶、果膠酶、葡聚糖酶和α-D-木糖苷酶，這些酶可切割多糖的糖苷鍵，因此具備這些糖苷鍵的多糖在胃和小腸中保持穩(wěn)定，但在結(jié)腸中降解[19,20]。殼聚糖是由β-D-氨基葡萄糖和N-乙酰基-D-氨基葡萄糖隨機(jī)分布組成的陽離子線性多糖，具有生物相容性、生物可降解性。此外殼聚糖還具有與陰離子聚合物以及帶負(fù)電的粘膜表面相互作用的能力，適合作為載體應(yīng)用于高活性益生菌食品和藥品中。

1.2 氧化還原敏感聚合物

結(jié)腸菌群會(huì)產(chǎn)生還原酶，例如硝基還原酶，偶氮還原酶，N 氧化物還原酶，亞砜還原酶和氫化酶。與降解多糖的水解酶類似，這些酶也可以降解帶有特定化學(xué)基團(tuán)的聚合物載體，有效的釋放靶向遞送至結(jié)腸的“聚合物-益生菌”。最常見的還原酶是偶氮還原酶，它可以破壞含偶氮聚合物（如含偶氮的聚氨酯和偶氮聚合物水凝膠）中的偶氮鍵，進(jìn)而控制益生菌從聚合物中釋放的速度[21]。利用硫代透明質(zhì)酸的自交聯(lián)特性成功制備了包被鼠李糖乳桿菌的透明質(zhì)酸水凝膠，該水凝膠對氧化還原敏感，可控釋益生菌，能有效保護(hù)益生菌免受胃腸道胃酸、膽汁酸等脅迫，且對病原菌鼠傷寒沙門氏菌（ST）具備較好的抑制作用；該系統(tǒng)具備可控性好、穩(wěn)定性強(qiáng)、生物相容性高等優(yōu)點(diǎn)，并在腸炎小鼠模型中顯示出較好的治療效果，促進(jìn)了多功能益生菌輸送系統(tǒng)在食品或藥物領(lǐng)域的應(yīng)用[22]。

1.3 pH 敏感聚合物

鑒于胃、小腸和結(jié)腸之間的pH 存在明顯差異，可以使用對pH 敏感的聚合物將益生菌靶向遞送至目標(biāo)部位。這些聚合物可以在胃的酸性pH 環(huán)境中保護(hù)益生菌，并在結(jié)腸和回腸中較高的pH 環(huán)境中遞送、釋放益生菌。合成的pH 敏感聚合物主要有丙烯酸衍生物，纖維素聚合物。Singh 等[23]利用滴制法或噴制法在水介質(zhì)中制備新型的羧甲基纖維素-殼聚糖聚合物顆粒，交聯(lián)后的聚合物孔隙率和機(jī)械穩(wěn)定性更高，在pH 2.40 環(huán)境下穩(wěn)定性強(qiáng)，而在pH 7.40 條件下有效崩解。該壁材封裝鼠李糖乳桿菌LGG 膠囊后活菌存活率提高了61.81%，可用于益生菌膠囊化及腸道遞送系統(tǒng)。

值得注意的是，基于pH 敏感型聚合物的輸送系統(tǒng)有一些局限性。例如，受飲食、疾病等體內(nèi)和體外多因素的影響，胃腸道的pH 值會(huì)發(fā)生不同程度的變化。因此，不同類型遞送聚合物（如pH 敏感聚合物和酶敏感聚合物）的配伍組合是未來靶向益生菌遞送系統(tǒng)的主要研究方向之一。

1.4 其他聚合物

具有兩親性質(zhì)的蛋白質(zhì)（如明膠，乳清蛋白和酪蛋白等）也是一類重要的聚合物，可用于封裝益生菌。聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）、聚丙烯酰胺和聚乙烯醇（PVA）等合成聚合物是也可用于遞送益生菌，但因需要有機(jī)溶劑來溶解聚合物，限制了此類合成聚合物用在靶向益生菌遞送系統(tǒng)中的應(yīng)用。

2 遞送手段的評價(jià)方式

優(yōu)質(zhì)的靶向益生菌遞送系統(tǒng)是能夠在胃和小腸等特殊生理環(huán)境中維持益生菌的完整性和活性，并在結(jié)腸等部位靶向釋放益生菌。目前主要通過各種體外或體內(nèi)釋放效率評估實(shí)驗(yàn)來評估靶向益生菌遞送系統(tǒng)的優(yōu)劣。

2.1 溶出度實(shí)驗(yàn)

溶出度指活性益生菌、藥物等從片劑、膠囊劑或顆粒劑等制劑在規(guī)定條件下溶出速率和溶出程度。溶出度測試是評估靶向益生菌遞送系統(tǒng)使用最廣泛的方法之一，具有重復(fù)性好、精準(zhǔn)度高等特點(diǎn)。最新的Vision 溶出度儀系列可使用轉(zhuǎn)籃法、槳法、槳-碟法、轉(zhuǎn)筒法、小杯法、大杯法等來評估不同聚合物材料制備的靶向益生菌遞送系統(tǒng)[24]。目前常用動(dòng)力學(xué)模型包括零階模型、一階模型、Higuchi 模型、Ritger-Peppas模型和Weibull 模型來研究負(fù)載在不同靶向載體中生物活性物質(zhì)的釋放機(jī)理[24,25]。

體外溶出度實(shí)驗(yàn)過程中，常采用不同pH 值的緩沖液來模擬胃腸液，然而該實(shí)驗(yàn)無法精準(zhǔn)反映靶向益生菌遞送系統(tǒng)在人類胃腸道的真正釋放性能。近年來，相關(guān)學(xué)者添加胃蛋白酶、胰蛋白酶、和β-葡萄糖苷酶等至模擬胃腸液中，或添加動(dòng)物盲腸內(nèi)容物或人類糞便至釋放介質(zhì)中進(jìn)行遞送系統(tǒng)體外釋放研究，研究發(fā)現(xiàn)改良后釋放介質(zhì)中的包埋成分體外釋放率顯著升高[24,26]。然而胃腸道非常復(fù)雜，即使存在相關(guān)的酶，模擬培養(yǎng)基也無法準(zhǔn)確代表體內(nèi)胃腸道的真實(shí)環(huán)境，因此選擇合適的培養(yǎng)基以準(zhǔn)確評估靶向載體中益生菌的釋放曲線至關(guān)重要。

2.2 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞體外模型實(shí)驗(yàn)也是評價(jià)益生菌遞送系統(tǒng)的重要手段，如評估益生菌遞送系統(tǒng)及釋放的益生菌對正常細(xì)胞或癌細(xì)胞等的殺傷性能、免疫性能[24]。也可通過構(gòu)建細(xì)胞模型，評價(jià)聚合物載體保護(hù)益生菌或藥物等活性物質(zhì)在胃腸道被物理化學(xué)作用破壞的情況、細(xì)胞攝取方式的變化以及對胃腸道上皮緊密連接的作用等[27]。如利用Caco-2 細(xì)胞模型研究載體材料的毒性和及其被細(xì)胞吸收、外排機(jī)制，建立MDCK 細(xì)胞單層跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)模型，綜合分析遞送系統(tǒng)在細(xì)胞表面的吸附，被細(xì)胞內(nèi)吞及跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制[28]。

2.3 成像實(shí)驗(yàn)

活體成像、熒光成像等成像技術(shù)為評價(jià)藥物遞送系統(tǒng)提供了一種高效、實(shí)時(shí)、直觀的新方法，可評估所遞送的生物活性物質(zhì)的部位特異性、生理功效以及其釋放行為[24]。例如，利用多光譜熒光成像可以有效實(shí)現(xiàn)藥物載體材料、負(fù)載藥物、腫瘤細(xì)胞等的實(shí)時(shí)成像及監(jiān)控，并可以實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)揭示藥物釋放與疾病治療效果的相關(guān)性，為更高效的藥物遞送系統(tǒng)設(shè)計(jì)提供研究基礎(chǔ)[29]。基于光學(xué)成像技術(shù)的益生菌體內(nèi)示蹤技術(shù)也可通過同一組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對象在不同的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行記錄檢測，示蹤封裝的益生菌在體內(nèi)胃腸道的變化，避免了體外實(shí)驗(yàn)的繁瑣，效率高且無創(chuàng)傷性[30]。Nandy等[31]通過X 射線成像技術(shù)評價(jià)結(jié)腸靶向遞送系統(tǒng)在胃腸道的耐受性及崩解率，證實(shí)了該成像技術(shù)監(jiān)測結(jié)腸靶向微球變化的可行性。除了上述成像技術(shù)外，還有相關(guān)研究使用熒光圖像分析儀監(jiān)測標(biāo)記有FITC 的微膠囊或藻酸鹽-殼聚糖微球在體內(nèi)的靶向遞送軌跡[32,33]。

2.4 離體實(shí)驗(yàn)

益生菌具有抑菌、抗炎、調(diào)節(jié)微生態(tài)平衡、分泌細(xì)菌素等多種功能[34]。為了保護(hù)益生菌的活性及生物利用度，相關(guān)學(xué)者利用離體實(shí)驗(yàn)對靶向益生菌遞送系統(tǒng)進(jìn)行了大量研究，主要集中在利用組織切片、胃腸道離體組織培養(yǎng)等技術(shù)評估靶向益生菌遞送系統(tǒng)的粘膜黏附特性及其負(fù)載的益生菌生物活性物質(zhì)對腸道等患病器官的影響等方面[35]。例如，Ramesh 等[36]通過測定果膠和聚合體材料（聚乙烯吡咯烷酮）的離體黏膜黏附強(qiáng)度來研究其粘膜黏附特性。Ivanovska 等[37]利用三硝基苯磺酸（TNBS）誘導(dǎo)的大鼠結(jié)腸炎評估了“殼聚糖-Ca-藻酸鹽”遞送系統(tǒng)裝載的“干酪乳桿菌01+低聚果糖+菊粉”合生素的抗炎活性。病理切片結(jié)果表明裝載在遞送系統(tǒng)中的合生素在改善結(jié)腸粘膜炎性浸潤、緩解結(jié)腸炎疾病方面顯示出更好的療效，MPO 活性值降低了3.5 倍，初步表明遞送系統(tǒng)顯著改善干酪乳桿菌01 的細(xì)胞的活力及其生物利用度。此外，通過離體胃腸道（胃、十二指腸、空腸、回腸和結(jié)腸）組織培養(yǎng)技術(shù)也表明基于乳清蛋白分離物WPI的微膠囊對FITC 標(biāo)記的發(fā)酵乳桿菌39-183 具有出色的保護(hù)作用（成活率高于86%），最大限度的弱化了胃酸的殺菌作用，并使到達(dá)回腸、結(jié)腸中益生菌的數(shù)量達(dá)到最大化[24,38]。

3 益生菌遞送系統(tǒng)新技術(shù)的應(yīng)用

3.1 逐層涂覆技術(shù)

益生菌遞送系統(tǒng)逐層涂覆技術(shù)是指益生菌微囊化之后，將其置于與壁材表面電荷相反的多種聚合物溶液中，在微囊粒子表面進(jìn)行逐層涂覆，減少益生菌在高氧、高pH 值等“惡劣”環(huán)境中的暴露[39,40]。逐層涂覆技術(shù)原理是基于聚合物材料之間的氫鍵和靜電相互作用。離子型水凝膠如藻酸鹽等是封裝益生菌常用的包被材料，但因壁材固有的理化特性容易導(dǎo)致封裝的益生菌泄露，因此利用殼聚糖等基質(zhì)進(jìn)行二次涂覆，有效克服單一離子型水凝膠封裝益生菌存在的缺陷。Cook 等[41]將短雙歧桿菌封裝到藻酸鹽基質(zhì)中，并使用殼聚糖或聚賴氨酸對藻酸鹽進(jìn)行逐層包衣，利用殼聚糖帶正電荷的氨基與藻酸鹽帶負(fù)電荷的羧酸基之間的相互作用形成了更具保護(hù)性的外殼。經(jīng)多層包被、封裝后的短雙歧桿菌的生存率從3.00 lg CFU/mL 提高至8.84 lg CFU/mL。此外多層包被的藻酸鹽基質(zhì)還表現(xiàn)出靶向遞送至腸道的作用。Fareez 等[42]利用藻酸鈉/黃原膠/β-環(huán)糊精/殼聚糖經(jīng)涂層涂覆技術(shù)制備的聚合物表現(xiàn)出理想的益生菌載體的特征，如耐酸（pH 1.80），耐熱（90 ℃）并且能夠在大腸（pH 6.80）定向釋放，可增強(qiáng)對游離乳酸菌如植物乳桿菌LAB12抵抗惡劣環(huán)境；其中β-環(huán)糊精還能增強(qiáng)LAB12 降低膽固醇的能力。此外藻酸鈉/殼聚糖與MgO 等金屬離子制備的益生菌遞送系統(tǒng)還可有效降低微凝膠內(nèi)孔隙率，抑制氧氣對益生菌的侵蝕，增強(qiáng)益生菌的穩(wěn)定性[43,44]。雖然經(jīng)逐層涂覆技術(shù)包埋的益生菌暴露到惡劣的環(huán)境時(shí)具有較高的穩(wěn)定性和存活率，但是按照國標(biāo)GB 4789.35-2016 檢測乳酸菌活菌總數(shù)時(shí)，其前處理方法無法破壁充分釋放活菌，致使部分活菌受損或死亡進(jìn)而影響檢測結(jié)果。

3.2 聚電解質(zhì)絡(luò)合技術(shù)

利用正、負(fù)電荷聚電解質(zhì)之間的靜電作用建立聚電解質(zhì)絡(luò)合技術(shù)也是構(gòu)建益生菌遞送系統(tǒng)的重要技術(shù)之一。殼聚糖分子鏈上的伯氨基與海藻酸鈉分子鏈上的羧基反應(yīng)而形成的聚電解質(zhì)絡(luò)合物，Zaeim 等[45]將植物乳桿菌PTCC1896 包埋在該絡(luò)合物中制成微膠囊后，活菌數(shù)由6.63 lg CFU/g 增加至8.10 lg CFU/g，結(jié)果表明該微膠囊在儲(chǔ)存和冰淇淋生產(chǎn)過程中顯著提高了益生菌的存活率（p＜0.05）。殼聚糖的氨基和黃原膠的羧基之間的離子相互作用形成的水凝膠網(wǎng)絡(luò)具有pH 敏感溶脹特性，可實(shí)現(xiàn)益生菌的靶向遞送以及和控制釋放功能。Chen 等[46]發(fā)現(xiàn)絡(luò)合條件對黃原膠-殼聚糖聚電解質(zhì)復(fù)合凝膠中嗜酸乳桿菌微膠囊化的影響，優(yōu)化嗜酸乳桿菌微膠囊化過程，可顯著提高嗜酸乳桿菌微囊活菌數(shù)和包封率。聚電解質(zhì)絡(luò)合工藝會(huì)直接影響微膠囊的形狀、尺寸以及均勻度，并影響其物化特性，所以需要根據(jù)微囊材料的具體特性改進(jìn)相應(yīng)的絡(luò)合工藝技術(shù)。

3.3 電流體動(dòng)力學(xué)技術(shù)

利用電流體動(dòng)力學(xué)技術(shù)（如靜電紡絲和電噴霧）制備功能性納米微纖維（或微囊）和封裝益生菌菌體成為近年來的研究熱點(diǎn)。與傳統(tǒng)方法相比，電流體動(dòng)力學(xué)技術(shù)是一種溫和、高效、直接、經(jīng)濟(jì)的方法。據(jù)報(bào)道，通過靜電紡絲方法可封裝敏感的生物活性化合物，如Omega-3 脂肪酸、維生素、天然抗氧化劑和益生菌[47]。與冷凍干燥技術(shù)相比，Ma 等[48]利用靜電紡絲技術(shù)開發(fā)出一種基于阿拉伯樹膠/普魯蘭多糖納米纖維的新型益生菌遞送系統(tǒng)對乳酸桿菌顯示出了優(yōu)越的保護(hù)性能，存活率提高了8.89%。阿拉伯樹膠/普魯蘭多糖具有益生元特性，其分子之間混溶性和氫鍵相互作用致使該納米纖維在用作乳酸桿菌封裝壁材時(shí)具有良好的熱穩(wěn)定性，為提高益生菌的活性提供了新途徑。此外電流體動(dòng)力學(xué)技術(shù)工藝還能夠封裝益生菌共培養(yǎng)物或包含其他功能化合物（例如益生元），滿足益生菌活菌的某些營養(yǎng)需求，提高存活率[49]。雖然電流體動(dòng)力學(xué)技術(shù)在部分食品應(yīng)用中面臨著如何高效降解并釋放包埋物質(zhì)、靜電紡絲液的聯(lián)合配置、紡絲的均勻性與穩(wěn)定性差以及紡絲產(chǎn)量低等問題，但該技術(shù)投資相對較低，安裝維護(hù)方便，有望在益生菌行業(yè)中得到更廣泛的應(yīng)用。

4 展望

益生菌因其作為健康補(bǔ)充劑的巨大潛力而受到越來越多的關(guān)注，也是治療許多胃腸道和非胃腸道疾病的有效選擇?；诰酆衔镙d體的靶向益生菌遞送系統(tǒng)提供了一種物理屏障，保護(hù)了益生菌活菌免受食品加工、儲(chǔ)存以及胃腸道環(huán)境等不利條件的影響，順利的將益生菌靶向遞送至結(jié)腸和/或粘膜環(huán)境。然而不同的候選菌株、制備方法、聚合物的種類和目標(biāo)遞送部位等都可能影響聚合物載體對益生菌的保護(hù)效果，需要針對不同種類益生菌構(gòu)建相應(yīng)適宜的遞送系統(tǒng)，有機(jī)結(jié)合遞送系統(tǒng)新技術(shù)和多樣化評估手段，創(chuàng)新靶向益生菌遞送系統(tǒng)技術(shù)運(yùn)用于益生菌產(chǎn)品的生產(chǎn)，進(jìn)一步促進(jìn)多功能益生菌在食品或藥物領(lǐng)域的應(yīng)用。