甘瑞卿，何燕富,2*，李永成,2*，李來(lái)好，趙京菁，申鉉日,2，李川,2

（1.海南大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，海南?？?570100）

（2.南海海洋資源利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南?？?570100）

（3.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，廣東廣州 510300）

近年來(lái)，消費(fèi)者對(duì)保健食品的需求日益增長(zhǎng)，特別是高蛋白食品[1]。水產(chǎn)品加工工業(yè)每年產(chǎn)生許多副產(chǎn)物，其中魚(yú)類在加工過(guò)程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物包括魚(yú)頭、魚(yú)鱗、魚(yú)皮和內(nèi)臟等副產(chǎn)物。這些副產(chǎn)物大約占據(jù)了整條魚(yú)體的40%[2,3]。雖然這些副產(chǎn)物含有潛在生物活性特性的蛋白質(zhì)和一些其他必需營(yíng)養(yǎng)素，對(duì)它們的合理開(kāi)發(fā)利用將為人類提供豐富的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)資源[4]，但是這些副產(chǎn)物少部分制成肥料、飼料等[5]，大部分主要作為廢棄物。因此充分利用這些魚(yú)類副產(chǎn)物，對(duì)于更好的利用水產(chǎn)資源、提高水產(chǎn)魚(yú)類加工的附加值和減少加工污染物排放均具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

蛋白酶水解可以從不同的樣品中提取蛋白質(zhì)和多肽。這種方法不僅簡(jiǎn)單有效、可控制，而且不會(huì)產(chǎn)生有毒有害的物質(zhì)[6]，并且在蛋白水解過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生各種滋味活性物質(zhì)，使蛋白酶解液具有各種各樣的滋味。滋味是由非揮發(fā)性的物質(zhì)構(gòu)成的，是魚(yú)類產(chǎn)品整體風(fēng)味的重要的組成部分，好的滋味能為消費(fèi)者帶來(lái)強(qiáng)烈的消費(fèi)欲望。不同來(lái)源的魚(yú)副產(chǎn)物、不同的酶制劑和不同的水解條件下獲得的魚(yú)蛋白水解物的組分存在差異，因?yàn)椴煌拿钢苿┰趯?duì)蛋白質(zhì)具有不同的酶切位點(diǎn)，產(chǎn)生不同長(zhǎng)度和結(jié)構(gòu)的多肽，因此滋味也存在差異。Yang 等[7]利用復(fù)合蛋白酶水解Takifugu obscurus副產(chǎn)物獲得具有強(qiáng)烈鮮味的多肽，而Fu 等[8]利用木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶水解牛肌肉得到具有苦味的多肽。過(guò)去十年多年，關(guān)于呈味的氨基酸類物質(zhì)的研究較多，特別是禽畜肉類上，但對(duì)于酶促蛋白質(zhì)水解后產(chǎn)生的非揮發(fā)性關(guān)鍵肽及其貢獻(xiàn)蛋白水解產(chǎn)品的典型味道特征的研究相當(dāng)零碎。

將多肽組學(xué)工具與感官分析結(jié)合起來(lái)可能是一種很有前景的研究策略，利用這種方法可以監(jiān)測(cè)蛋白酶解過(guò)程中關(guān)鍵滋味物質(zhì)的演化，從而闡明蛋白水解物中的鮮味、苦味和其他異味物質(zhì)的來(lái)源。本實(shí)驗(yàn)以羅非魚(yú)魚(yú)皮、魚(yú)頭和魚(yú)骨為原料，比較探究中性蛋白酶、菠蘿蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶6 種蛋白酶的水解特性，并應(yīng)用多肽組學(xué)來(lái)研究滋味活性肽的來(lái)源，為改善魚(yú)副產(chǎn)物水解物的滋味提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羅非魚(yú)（Oreochromis niloticus）副產(chǎn)物（魚(yú)頭、魚(yú)皮和魚(yú)骨）獲取于?？谑醒亟袌?chǎng)。

中性蛋白酶、菠蘿蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶河南圣斯德實(shí)業(yè)有限公司。所使用的蛋白酶均為食品級(jí)。

鹽酸、氫氧化鈉、乙醇西隴化工股份有限公司；乙腈、三氟乙酸均為色譜級(jí)上海安普實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；L-亮氨酸上海源葉生物科技有限公司；N-乙酰-l-半胱氨酸（163.19 u），尿苷（224.2 u），抑肽酶（6512 u），細(xì)胞色素（12500 u）和肌紅蛋白（17600 u）標(biāo)準(zhǔn)品上海阿拉丁生化科技股份有限公司；鄰苯二甲醛混合液（50 mmol/L 鄰苯二甲醛（OPA）、50 mmol/L N-乙酰半胱氨酸、20%十二烷基硫酸鈉、0.1 mol/L 無(wú)水四硼酸鈉以體積比2:2:1:15 避光混合并攪拌1 h 后使用）本實(shí)驗(yàn)室自制。

1.2 儀器與設(shè)備

高速組織搗碎機(jī)，美國(guó)waring 商業(yè)公司；手持均質(zhì)機(jī)，上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司；MP511 型實(shí)驗(yàn)室pH 計(jì)，上海三信儀器有限公司；水浴恒溫振蕩器，常州金壇精達(dá)儀器制造有限公司；多功能微孔板檢測(cè)儀，美國(guó)伯騰儀器有限公司；TGL-16M 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；高效液相色譜儀，安捷倫科技有限公司；LC-MS/MS，賽默飛世爾科技公司。

1.3 方法

1.3.1 羅非魚(yú)副產(chǎn)物前處理

將三種副產(chǎn)物分別清洗，置于沸水中煮15 min，滅內(nèi)源酶活；再進(jìn)行攪碎、分裝，置于-20±2 ℃貯藏，待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 羅非魚(yú)副產(chǎn)物蛋白酶解液的制備

在酶解前，分別取適量的三種羅非魚(yú)副產(chǎn)物置于4 ℃冰箱解凍。按固液比1:3（g/mL）加水，冰浴勻漿（8000 r/min，3×30 s），將勻漿好的樣品用1 mol/L 的NaOH 或HCl 溶液調(diào)pH 值至各蛋白酶的最適pH 值，在恒溫水浴震蕩搖床中調(diào)溫度至各蛋白酶的最適溫度，分別按照0.2%、0.4%、0.6%、0.8%和1.0%的酶添加量加入不同副產(chǎn)物中，選出各種副產(chǎn)物中不同蛋白酶中的最佳酶添加量后，以最佳的酶添加量制備不同副產(chǎn)物蛋白酶解液，酶解完畢后于100 ℃水浴煮10 min 滅酶，冷卻到室溫，在6000 r/min，4 ℃下離心15 min，收集上清液備用。根據(jù)表1 的蛋白酶最適酶解條件，按相同操作制備出相應(yīng)的蛋白酶解液。

表1 各種蛋白酶的最適酶解條件Table 1 Hydrolysis conditions of each enzyme

1.3.3 水解度的測(cè)定

1.3.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取24 支試管分三組，分別加入0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.12、0.16、0.24 mL 5 mg/mL 的L-亮氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，用水補(bǔ)足到1 mL，然后從各個(gè)濃度分別取10 μL 于棕色離心管中，分別向其中加入1.2 mL OPA 混合液，震蕩搖勻，靜置10 min 后，于340 nm處測(cè)定吸光度。用未加L-亮氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的第1 支試管作為空白對(duì)照。取三組測(cè)定的平均值，以L-亮氨酸的濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3.2 氨基的測(cè)定

取10 mL 酶解液加入1.2 mL 的OPA 混合液，避光靜置10 min 后，在波長(zhǎng)為340 nm 處測(cè)定其吸光值。總氨基含量是利用6 mol/L HCl 水解蛋白樣品后測(cè)定的。按照下式計(jì)算水解度：

式中：

(NH2)x——樣品水解后的氨基含量，mg/mL；

(NH2)0——樣品未水解前的自由氨基含量，mg/mL；

(NH2)總——樣品含有的總氨基含量，mg/mL。

1.3.4 肽分子量分布

利用尺寸排阻色譜測(cè)定肽分子量的分布。檢測(cè)條件：Agilent 高效液相色譜儀，BioSepSEC-S2000 色譜柱（300×4.6 mm；Phenomenex，USA），洗脫液為20%乙腈水溶液加入0.1%三氟乙酸，流速0.35 mL/min，柱溫30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為214 nm。分子質(zhì)量校正曲線所用標(biāo)準(zhǔn)品為N-乙酰-l-半胱氨酸（163.19 u），尿苷（224.2 u），抑肽酶（6512 u），細(xì)胞色素（12500 u）和肌紅蛋白（17600 u），校正曲線方程為：

式中：

Mw——分子量，u；

t——洗脫時(shí)間，min。

1.3.5 感官評(píng)價(jià)

感官評(píng)價(jià)根據(jù)Fu 等[8]提出的方法略作修改。感官評(píng)價(jià)小組由經(jīng)過(guò)篩選和專業(yè)培訓(xùn)的年齡介于20～25 歲之間的8 名感官評(píng)價(jià)員所組成，4 名男性，4 名女性。分別以100 mg/mL 咖啡因、100 mg/mL 谷氨酸鈉、50 mg/mL 乳酸和50 mg/mL 氯化鈉作為苦味、鮮味、酸味和咸味四種味覺(jué)參比液，對(duì)評(píng)價(jià)員提前兩個(gè)月進(jìn)行感官訓(xùn)練。在室溫（25±1 ℃）條件下，采用九分法來(lái)評(píng)價(jià)每種酶解液的苦味、鮮味、酸味和咸味，0～3 表示弱、4～6 表示標(biāo)準(zhǔn)和7～9 表示強(qiáng)烈。

1.3.6 LC-MS/MS

1.3.6.1 LC-MS/MS 檢測(cè)

每個(gè)樣品取1 μL 總肽經(jīng)nano-UPLC 液相系統(tǒng)EASY-nLC1200 進(jìn)行分離后聯(lián)用配備納升離子源的質(zhì)譜儀（Q-Exactive HFX）進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。色譜分離采用100 μm ID×15 cm 反相色譜柱（Reprosil-Pur 120 C18-AQ，1.9 μL，Dr.Math）進(jìn)行。流動(dòng)相采用乙腈-水-甲酸體系，其中流動(dòng)相A 為0.1%甲酸-98%水溶液（乙腈為2%），B 相為0.1%甲酸-80%乙腈溶液（水為20%）。色譜柱以100%的A 相平衡后，樣品由自動(dòng)進(jìn)樣器直接上樣到色譜柱，再經(jīng)色譜柱梯度分離，流速300 nL/min，梯度時(shí)長(zhǎng)120 min。流動(dòng)相B 比例：2%～5%持續(xù)2 min，5%～22%持續(xù)88 min，22%～45%持續(xù)26 min，45%～95%持續(xù)2 min，95%持續(xù)2 min。質(zhì)譜分析使用數(shù)據(jù)依賴性采集模式，總分析時(shí)長(zhǎng)為120 min，采取正離子檢測(cè)模式。一級(jí)掃描范圍350～1600m/z，分辨率為120 k（@ 200m/z），AGC為3e6，最大離子注入時(shí)間（max IT）為50 ms；一級(jí)掃描中強(qiáng)度最高的20 個(gè)離子經(jīng)四極桿篩選后使用HCD 裂解后進(jìn)行碎片離子掃描。四極桿隔離窗口為1.2m/z，標(biāo)準(zhǔn)化碰撞能為27%，AGC 為1e5，max IT為110 ms。二級(jí)掃描分辨率15 k。根據(jù)色譜峰峰寬，動(dòng)態(tài)排除時(shí)間設(shè)為45 s；單電荷及＞6 價(jià)的離子不進(jìn)行二級(jí)掃描[9]。

1.3.6.2 搜庫(kù)鑒定和蛋白定量

原始數(shù)據(jù)文件首先使用ProteoWizard（version 3.0.18299）軟件轉(zhuǎn)換為mzML 通用文件格式。質(zhì)譜譜圖數(shù)據(jù)使用MSFragger3 軟件與對(duì)應(yīng)物種水平的數(shù)據(jù)庫(kù)序列（uniprot-Oreochromis+Niloticus-8128-2020-10.fasta）進(jìn)行搜庫(kù)匹配，主要搜庫(kù)參數(shù)采用官方推薦值（詳見(jiàn)philosopher.yaml）。酶切特異性設(shè)為：non-specific；允許多肽長(zhǎng)度范圍：7～25；可變修飾包括：15.994915[M]，42.010565[n-term]；[C]無(wú)烷基化修飾；母離子質(zhì)量精度：+/-20×10-6；碎片離子精度：+/-20 ppm。MSFragger 搜庫(kù)結(jié)果隨后使用Philosopher（v3.3.11）[10]工具集進(jìn)行后續(xù)分析，主要包括PeptideProphet（v5.2.1）用于多肽FDR（1%）控制，ProteinProphet（v5.2.1）用于蛋白FDR（1%）控制，freequant 用于多肽（蛋白）定量分析，IonQuant[11]用于蛋白maxLFQ 定量，最小允許1 對(duì)離子比值。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 23.0 進(jìn)行相關(guān)數(shù)據(jù)的方差分析和顯著性檢驗(yàn)，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次取平均值，采用Origin 2019b 和GraphPad Prism 8.0 制圖；PCA 雙曲線圖由SIMCA 14.1 繪制，從國(guó)際蛋白資源庫(kù)（https://www.uniprot.org）中獲得尼羅羅非魚(yú)參考蛋白質(zhì)組。

2 結(jié)果與分析

2.1 水解度

OPA 法測(cè)定多肽含量的原理是利用氨基與苯二醛之間在340 nm 的波長(zhǎng)下發(fā)生熒光反應(yīng)[12]。六種不同蛋白酶對(duì)羅非魚(yú)的魚(yú)皮、魚(yú)頭和魚(yú)骨的水解程度隨時(shí)間的變化曲線如圖1 所示。由圖可見(jiàn)，三種副產(chǎn)物均在風(fēng)味蛋白酶的酶解作用下獲得最高的水解度（p＜0.05），其中魚(yú)皮為14.29%（圖1a），魚(yú)頭為23.7%（圖1b），魚(yú)骨為31.86%（圖1c）。根據(jù)作用機(jī)制和催化位點(diǎn)，蛋白酶分為內(nèi)切酶和外切酶[13]。內(nèi)切酶主要作用于肽鏈的中間位置，而外切酶則主要作用于肽鏈兩端。風(fēng)味蛋白酶同時(shí)含有內(nèi)切和外切兩種活性酶，作用位點(diǎn)多，酶解速率高于其他蛋白酶，同時(shí)產(chǎn)生較多的游離氨基酸也多于其他蛋白酶[14,15]，這可能解釋了風(fēng)味蛋白酶酶解物水解度顯著高于其他蛋白酶的原因（圖1）；其他五種蛋白酶均為內(nèi)切酶，只作用于肽段中間，缺乏足夠多的端點(diǎn)，而導(dǎo)致酶解物的水解度低。茼玉婷和叢艷君[16]在利用風(fēng)味蛋白酶、木瓜蛋白酶等六種商業(yè)酶水解草魚(yú)內(nèi)臟蛋白的研究中，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)風(fēng)味蛋白酶水解的酶解液中富含氨基酸；而Zahra等[17]采用堿性蛋白酶和風(fēng)味酶對(duì)虹鱒皮進(jìn)行水解，風(fēng)味酶水解物得到較高的水解度，與羅非魚(yú)副產(chǎn)物所得結(jié)果相一致。

2.2 感官評(píng)價(jià)

為了研究蛋白質(zhì)水解物與感官屬性之間的關(guān)系，進(jìn)行了主成分分析（PCA）（圖2）。羅非魚(yú)魚(yú)皮蛋白水解物的PCA 圖表示，第一主成分（PC1）和第二主成分（PC2）貢獻(xiàn)率分別為50.7%和47.1%（圖2a）。經(jīng)過(guò)中性蛋白酶處理的魚(yú)皮蛋白水解液具有標(biāo)準(zhǔn)鮮味（3.88）和弱酸味（2.38），而經(jīng)過(guò)木瓜蛋白酶處理的蛋白酶解液有標(biāo)準(zhǔn)苦味（4.36）。圖2b 顯示了羅非魚(yú)魚(yú)頭蛋白水解度的主成分分析結(jié)果（PC1=65.5%和PC2=34%）。經(jīng)過(guò)堿性蛋白酶處理的蛋白酶解液呈現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)鮮味（3.88），經(jīng)過(guò)中性蛋白酶處理的蛋白酶解液有苦味（4.25）。如圖2c 所示，羅非魚(yú)魚(yú)骨水解物的主成分分析結(jié)果顯示，PC1 和PC2 的貢獻(xiàn)率分別為53.8%和31.5%。菠蘿蛋白酶處理的蛋白水解液的鮮味強(qiáng)度最高（6.88），木瓜蛋白酶處理的水解物有標(biāo)準(zhǔn)苦味（4.88）和弱酸味（2.0）。值得注意的是，木瓜蛋白酶在三種蛋白水解液中產(chǎn)生不良滋味（包括酸味和苦味），堿性蛋白酶和菠蘿蛋白酶分別在魚(yú)頭和魚(yú)骨中產(chǎn)生了鮮味，而中性蛋白酶在魚(yú)皮蛋白水解液中產(chǎn)生了鮮味，但在魚(yú)頭蛋白水解液卻產(chǎn)生了苦味。

蛋白酶解液的感官屬性與水解度有關(guān)，尤其與含有疏水氨基酸的低分子量肽的含量有關(guān)[13,18]。而這種低分子量肽的產(chǎn)生取決于所使用的酶和底物[19,20]。木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶均為巰基蛋白酶，這兩者的區(qū)別在于木瓜蛋白酶的活性位點(diǎn)具有廣泛的底物特異性，包括水解蛋白質(zhì)和多肽中精氨酸和賴氨酸的羧基末端，表明它可以釋放苦味氨基酸，如精氨酸、賴氨酸和苯丙氨酸；而菠蘿蛋白酶活性部位不具有特異性，這可能是木瓜蛋白酶產(chǎn)生酸苦味而菠蘿蛋白酶水解的酶解液產(chǎn)生鮮味的原因。同一蛋白酶的不同結(jié)果可能是由于底物特異性[13]。Maehashi 等[20]曾報(bào)道，同一種酶可以在不同水解物中產(chǎn)生不同的味道。這與我們得出中性蛋白酶在不同樣品中產(chǎn)生不同滋味的結(jié)果相同。

2.3 肽分子量分布

圖3 為羅非魚(yú)魚(yú)皮、魚(yú)頭和魚(yú)骨的肽分子量的分布。三種魚(yú)副產(chǎn)物的肽分子量主要分布在1000～5000 u（60%）和500～1000 u（30%），這表明魚(yú)副產(chǎn)物中的大部分蛋白質(zhì)被水解成肽（圖3a～c）。從圖3a 可以看出，三種副產(chǎn)物中魚(yú)皮產(chǎn)生較多的大分子肽，這可能是因?yàn)轸~(yú)皮中含有較多膠原蛋白，使之較難水解[21]。研究表明，苦味肽[22,23]和鮮味肽[8]等滋味肽主要來(lái)源于小分子肽。

三種副產(chǎn)物經(jīng)過(guò)風(fēng)味蛋白酶酶解的蛋白水解液中小于1000 u 的肽含量最多，這與水解度中風(fēng)味蛋白酶獲得最高的水解度的結(jié)果相符合。然而，在風(fēng)味蛋白酶的水解液中，鮮味、酸味和苦味等滋味不突出?？梢越忉屵@個(gè)現(xiàn)象的原因有二：一是可能是因?yàn)轷r味、甜味或咸味等滋味對(duì)苦味有一定的掩蓋作用，如鮮味肽可以通過(guò)苦味受體抑制苦味[24]，導(dǎo)致蛋白酶解液的滋味不顯著；二是因?yàn)檫@些蛋白水解液中含有較少的滋味活性肽，使蛋白酶解液的滋味不突出。因此，對(duì)中性蛋白酶和木瓜蛋白酶在魚(yú)皮水解產(chǎn)生的滋味特性，堿性蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶對(duì)魚(yú)頭水解的滋味特性，菠蘿蛋白酶和木瓜蛋白酶對(duì)魚(yú)骨水解的滋味特性進(jìn)行了進(jìn)一步的探究。

2.4 潛在滋味活性肽的鑒定

圖4表示采用LC-MS/MS鑒定從三種魚(yú)副產(chǎn)物的酶解液中挑選出來(lái)具有不同滋味的蛋白酶解液中肽的組成。從魚(yú)皮蛋白酶解中一共鑒定出5833 個(gè)肽，其中在具有鮮味和酸味的酶解液中鑒定出2106 個(gè)肽，而在具有苦味的酶解液中鑒定出3727 個(gè)肽；從魚(yú)頭蛋白酶解液中共鑒定出8952 個(gè)肽，其中具有鮮味的酶解液中鑒定出1828 個(gè)肽，具有酸味的酶解液中鑒定出3050個(gè)肽，具有苦味的酶解液中鑒定出4074 個(gè)肽；從魚(yú)骨蛋白酶解液中共鑒定出6888 個(gè)肽，其中具有鮮味的酶解液中鑒定出2586 個(gè)肽，具有苦味和酸味的酶解液中鑒定出4074 個(gè)肽（圖4a）。分別從這些鑒定出來(lái)的肽中篩選三種副產(chǎn)物中共有的肽為潛在的滋味肽，分別得到66 個(gè)潛在鮮味肽、271 個(gè)潛在酸味肽和308 個(gè)潛在苦味肽（圖4b）。

如圖4c 所示，潛在的鮮味肽的肽段長(zhǎng)度主要集中在9～13 個(gè)氨基酸（68.18%）；潛在的酸味肽和苦味肽主要集中在10～14 個(gè)氨基酸（64.21%和60.06%）。肽段的結(jié)構(gòu)和序列長(zhǎng)度會(huì)影響其滋味特性，肽段序列長(zhǎng)度越長(zhǎng)對(duì)滋味的影響越大。先前有研究報(bào)道，鮮味肽（包括鮮味增強(qiáng)肽）的肽段長(zhǎng)度主要集中在2～15 個(gè)氨基酸[25-27]，然而苦味肽主要集中在2～8 個(gè)氨基酸[22,28,29]。當(dāng)苦味肽中含有8 個(gè)或8 個(gè)以上的氨基酸的苦味效果與8 個(gè)以下氨基酸構(gòu)成的苦味肽相差不大

[30]。這些結(jié)果與以前的研究結(jié)果相一致。

滋味活性肽是一種與滋味有關(guān)的寡肽，其分子量小于3000 u[31]由圖4d 可見(jiàn)，鑒定出來(lái)的潛在滋味活性肽的分子量均在3000 u 以下，而大部分的肽的分子量在1000～1500 u。潛在的鮮味肽的分子量范圍小于1500 u，而潛在的苦味肽和酸味肽的分子量范圍小于2000 u。據(jù)相關(guān)報(bào)道，鮮味肽的分子量均小于或等于1000 u[31,32]；然而，苦味肽與分子量之間的關(guān)系尚不明確[14,15]。Cheung[33]的研究表明蝦酶解液中的肽在3000 u 時(shí)，苦味最大；同樣有研究表明分子量在1900～3300 u 之間的肽是高苦肽段，而較大或較小分子量的肽段則表現(xiàn)出溫和的苦度[34]。至于酸味肽，其分子量與滋味強(qiáng)度之間的關(guān)系尚不明確，仍需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

2.5 蛋白酶酶切特異性

利用LC-MS/MS 確定了三種潛在滋味肽的序列特異性。主要分析四個(gè)位置的酶切位點(diǎn)：N 端第二個(gè)氨基酸（P2’），N 端第一個(gè)氨基酸（P1’），C 端第一個(gè)氨基酸（P1），C 端第二個(gè)氨基酸（P2）。根據(jù)酶的特異性，不同的酶可以產(chǎn)生不同類型的肽[35]。通常認(rèn)為肽段的C端處含有親水性的氨基酸殘基會(huì)產(chǎn)生較好的滋味，而含有疏水性的氨基酸如苯丙氨酸和纈氨酸會(huì)增加苦度[36]。在三種滋味活性肽中，P1 和P1’的位置主要均以異亮氨酸和丙氨酸為主（圖5）。對(duì)比三種滋味活性肽的酶切位點(diǎn)可以發(fā)現(xiàn)，蛋氨酸出現(xiàn)在潛在滋味肽的頻率高于其他兩種。蛋氨酸作為含硫氨基酸雖然本身不會(huì)產(chǎn)生肉味，但對(duì)酶解液風(fēng)味的形成具有重要作用[37]。圖5a 表明，三種內(nèi)肽酶（中性蛋白酶、堿性蛋白酶和菠蘿蛋白酶）在P1 和P1’處有對(duì)不帶電荷的非支鏈殘基有優(yōu)先裂解作用，并且可以發(fā)現(xiàn)潛在苦味肽和酸味肽具有相似的酶切位點(diǎn)（圖5b 和5c）。這與感官評(píng)價(jià)結(jié)果相一致。并且，三種潛在的滋味肽兩端的氨基酸殘基均為疏水性。多肽的苦味與肽中是否存在親水性基團(tuán)和堿性氨基酸殘基有關(guān)，并認(rèn)為親水性基團(tuán)與疏水性基團(tuán)在空間相距0.3 nm 時(shí)便會(huì)產(chǎn)生苦味[34]。有報(bào)道鮮味肽中含有疏水性氨基酸，而這些疏水性氨基酸通常是與苦味肽有關(guān)的[38]。從文蛤中鑒定并合成的鮮味多肽和鮮味增強(qiáng)肽的肽段序列中含有較多疏水性氨基酸[27]；Ruan 等[39]從羅非魚(yú)下顎中提取了五個(gè)鮮味肽，其氨基酸序列中多數(shù)為疏水性氨基酸。因此，羅非魚(yú)副產(chǎn)物蛋白水解滋味肽可能與疏水性氨基酸有關(guān)，并且蛋氨酸可能在有鮮味的酶解液中起到重要作用。

2.6 前體蛋白

圖6a 為鑒定的與潛在滋味活性肽相關(guān)的前體蛋白，圖6b 表示潛在鮮味肽的前19 個(gè)前體蛋白，圖6c和圖6d 分別表示潛在酸味肽和苦味肽的前20 個(gè)前體蛋白。膠原蛋白和肌原纖維蛋白，特別是肌動(dòng)蛋白、肌鈣蛋白和肌球蛋白等是潛在滋味活性肽的主要來(lái)源蛋白。另外，肌漿蛋白，如2-磷酸-D-甘油酸水解酶和L-乳酸脫氫酶等同樣對(duì)對(duì)滋味肽作出貢獻(xiàn)（圖6b～6d）。

先前有研究報(bào)道與滋味有關(guān)的氨基酸或者小肽可能是肌漿蛋白和肌原纖維蛋白的水解產(chǎn)物[29,40]并且由肌鈣蛋白T 產(chǎn)生的多肽可以促進(jìn)牛肉味的產(chǎn)生[41]。然而，肌漿蛋白和肌原纖維蛋白的蛋白水解也會(huì)導(dǎo)致不良的滋味[42]。這說(shuō)明肌漿蛋白和肌原纖維蛋白是蛋白酶解液中各種滋味的主要來(lái)源蛋白。在目前的實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)滋味活性物質(zhì)不僅來(lái)源于肌漿蛋白和肌原纖維蛋白，而且也有可能來(lái)源于膠原蛋白。但是膠原蛋白與滋味活性物質(zhì)之間的關(guān)系還需要進(jìn)一步探究。

3 結(jié)論

采用六種商業(yè)酶來(lái)水解羅非魚(yú)三種副產(chǎn)物（魚(yú)皮、魚(yú)頭和魚(yú)骨）選出具有代表性滋味的酶解液，通過(guò)LC-MS/MS 分析羅非魚(yú)副產(chǎn)物的滋味來(lái)源。結(jié)果表明魚(yú)皮、魚(yú)頭和魚(yú)骨分別經(jīng)過(guò)風(fēng)味蛋白酶酶解的水解度最高，分別為14.29%、23.7%和31.86%。魚(yú)皮經(jīng)過(guò)中性蛋白酶處理的酶解液具有顯著鮮味和弱酸味，經(jīng)過(guò)木瓜蛋白酶處理的酶解液具有苦味；魚(yú)頭經(jīng)過(guò)堿性蛋白酶處理的酶解液具有顯著鮮味，經(jīng)過(guò)中性蛋白酶處理的具有苦味，經(jīng)過(guò)木瓜蛋白酶處理的具有酸味；魚(yú)骨經(jīng)過(guò)菠蘿蛋白酶處理的酶解液具有強(qiáng)顯著鮮味，經(jīng)過(guò)木瓜蛋白酶水解的具有顯著苦味。羅非魚(yú)副產(chǎn)物蛋白酶解液中潛在滋味肽主要是由膠原蛋白、肌漿蛋白和肌原纖維蛋白降解得到，其分子量小于1500 u，疏水性氨基酸在這些潛在滋味肽中起重要作用，其中蛋氨酸對(duì)鮮味酶解液作出重要貢獻(xiàn)。