信號蛋白3A對成肌細胞功能的影響及其轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制

李上，徐子瑛，于子惠，馮韜錦，王中奇，李然，尹鵬濱，張里程，唐佩福*

1解放軍醫(yī)學(xué)院，北京 100853；2解放軍總醫(yī)院第四醫(yī)學(xué)中心骨科醫(yī)學(xué)部，北京 100048；3國家骨科與運動康復(fù)臨床醫(yī)學(xué)研究中心，北京 100853；4首都兒科研究所，北京 100020；5中國科學(xué)院北京基因組研究所(國家生物信息中心)，北京 100101

骨骼肌干細胞又稱衛(wèi)星細胞，貯存于肌纖維基底膜下，在生理條件下多保持靜息狀態(tài)[1]。當骨骼肌受到損傷時，衛(wèi)星細胞被激活，增殖、分化為成肌細胞并向損傷部位遷移，融合形成肌管，進而修復(fù)受損的肌組織[2]。有研究發(fā)現(xiàn)，骨骼肌損傷后衛(wèi)星細胞中信號蛋白3A(semaphorin 3A，Sema3A)自分泌水平明顯上調(diào)[3]。Sema3A是信號蛋白家族的一種分泌型信號蛋白，可作用于微管等細胞骨架結(jié)構(gòu)，從而趨化導(dǎo)向神經(jīng)軸突發(fā)育與再生，同時在腫瘤的發(fā)生發(fā)展、血管生成和通透性改變、免疫系統(tǒng)功能及骨代謝中承擔著重要角色[4-5]。既往研究顯示，Sema3A對于特定肌源性前體細胞亞群可發(fā)揮遷移導(dǎo)向作用，并調(diào)控肌纖維的類型，其表達缺失時成肌細胞功能狀態(tài)受到顯著影響[6-7]。本課題組前期研究表明，Sema3A對骨骼、血管及神經(jīng)肌肉接頭等組織的結(jié)構(gòu)與功能具有協(xié)同調(diào)控能力，是肌、骨損傷修復(fù)中極具潛力的研究對象，但目前外源性Sema3A影響成肌細胞功能的研究鮮見[8-9]。本研究探討Sema3A對成肌細胞功能的影響及其可能的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制，以期為后續(xù)骨骼肌損傷修復(fù)策略及相關(guān)材料學(xué)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 C 2 C 1 2 成肌細胞系(1101MOU-PUMC000099)購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細胞資源中心；胎牛血清、馬血清、DMEM高糖培養(yǎng)基、胰蛋白酶、青-鏈霉素雙抗購自美國Gibco公司；重組Sema3A蛋白購自中國義翹神州公司；RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒HiScript Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis Kit (+gDNA wiper)、實時熒光定量ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix試劑盒、VAHTS Universal V8 RNA-seq Library Prep Kit for Illumina、Ribo-off Globin & rRNA Depletion試劑盒購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司。細胞計數(shù)儀購自美國Millipore Scepter公司；熒光定量PCR儀(CFX-96)購自美國Bio-Rad公司；IncuCyte ZOOM長時程動態(tài)活細胞成像及數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)購自美國森西公司；Qubit 4.0熒光定量儀購自美國Thermo Fisher公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及分組 C2C12成肌細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清(FBS)、1%青-鏈霉素雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基中(增殖培養(yǎng)基)，置于37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中，每24 h進行細胞傳代。根據(jù)文獻[10-12]的方法，各實驗組所用細胞培養(yǎng)基中重組Sema3A蛋白的終濃度分別為1.0 μg/ml、0.1 μg/ml、0.01 μg/ml，并設(shè)置對照組。

1.2.2 動態(tài)活細胞成像檢測細胞增殖能力 取生長狀態(tài)良好的成肌細胞，消化至細胞懸液，離心后重懸并使用Millipore Scepter細胞計數(shù)儀進行細胞計數(shù)，調(diào)整細胞濃度為2.5×103個/ml，接種于96孔板中，每孔200 μl。待細胞均勻貼壁后，依照實驗分組將細胞培養(yǎng)基分別更換為含有重組Sema3A蛋白的增殖培養(yǎng)基。將96孔板置入IncuCyte ZOOM長時程動態(tài)活細胞成像系統(tǒng)培養(yǎng)箱中，每2 h進行1次拍攝，持續(xù)24 h后終止拍攝。所得圖像數(shù)據(jù)使用IncuCyte Software中的Cell-By-Cell算法進行分析處理，對每孔中間區(qū)域進行四等分后計數(shù)并繪制增殖曲線。

1.2.3 劃痕實驗檢測細胞遷移能力 取生長狀態(tài)良好的成肌細胞接種于96孔板中(200 μl/孔，細胞濃度5×104個/ml)。待細胞生長密度達到100%后，使用IncuCyte細胞劃痕器對細胞進行標準化傷口劃痕，棄上清，用PBS清洗，依照實驗分組將細胞培養(yǎng)基更換為含有重組Sema3A蛋白的DMEM高糖培養(yǎng)基。將96孔板置入IncuCyte ZOOM長時程動態(tài)活細胞成像系統(tǒng)培養(yǎng)箱中，每2 h進行1次拍攝，持續(xù)24 h后終止拍攝。所得圖像數(shù)據(jù)使用IncuCyte Software進行分析處理，計算劃痕愈合率并繪制傷口愈合曲線。

1.2.4 RT-qPCR檢測成肌分化因子的表達 取生長狀態(tài)良好的成肌細胞，待細胞融合度達到80%～90%后，更換為含2%馬血清(HS)、1%青-鏈霉素雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基(分化培養(yǎng)基)，誘導(dǎo)各組成肌細胞分化培養(yǎng)72 h。利用Trizol裂解法提取成肌細胞總RNA，使用Qubit 4.0測定RNA濃度，行瓊脂糖凝膠電泳評價RNA的完整度，IQ值達到5即可進行后續(xù)實驗。

取1 μg RNA樣本，使用HiScript Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis Kit (+gDNA wiper)進行g(shù)DNA去除及cDNA合成，取相同cDNA模板量與2× ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix試劑及目標引物混勻進行RT-qPCR。使用Bio-Rad CFX Manager軟件進行處理分析，以2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達水平。使用Primer Premier 6軟件進行引物設(shè)計，引物序列如表1所示。

1.2.5 RNA提取及轉(zhuǎn)錄組測序分析 誘導(dǎo)1.0 μg/ml Sema3A組及對照組成肌細胞分化72 h，利用Trizol裂解法提取細胞總RNA，使用Qubit 4.0測定RNA濃度，行瓊脂糖凝膠電泳評價RNA的完整度，IQ值達到8以上且濃度達到建庫標準即可用于后續(xù)RNA文庫構(gòu)建。

利用Ribo-off rRNA Depletion kit去除rRNA。對剩余RNA進行定量后，利用VAHTS Universal V8 RNA-seq Library Prep Kit for Illumina進行鏈特異文庫構(gòu)建；最終磁珠篩選400 bp左右片段，并進行文庫擴增。最終文庫進行2100及RT-qPCR實際文庫質(zhì)量檢測，合格后借助Illumina測序平臺的Novaseq進行雙端150 bp的RNA測序，每個樣本10G數(shù)據(jù)量。

利用數(shù)據(jù)過濾軟件Trimmomatic對數(shù)據(jù)中的讀段進行處理，主要去除接頭(adapter)序列和低質(zhì)量序列等。其余讀段使用HISAT2的小鼠參考基因組(mm10)進行基因組比對。對于每個樣本，僅保留比對質(zhì)量分數(shù)≥20的唯一讀段用于后續(xù)分析。使用HT Seq Python (0.9.1)計算每個基因的唯一比對讀段?；虮磉_以FPKM(Fragments Per Kilobase per Million)進行量化，并用于相關(guān)性分析。采用R-package DEseq2分析1.0 μg/ml Sema3A組與對照組之間的差異表達基因，fold-change cut-off=1.0，Pvalue cut-off=0.05。利用R-package Cluster Profiler對基因進行GO(Gene Ontology)功能富集分析，保留顯著富集且P<0.05的GO通路。

1.2.6 RT-qPCR驗證差異基因的表達 誘導(dǎo)1.0 μg/ml Sema3A組及對照組成肌細胞分化72 h，采用RTqPCR對部分差異表達基因進行驗證，操作步驟同1.2.4。引物序列如表1所示。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用GraphPad Prism 8.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，進一步兩兩比較采用Turkey法。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Sema3A對成肌細胞增殖和遷移能力的影響IncuCyte細胞成像計數(shù)顯示，成肌細胞計數(shù)隨著重組Sema3A蛋白濃度增高而增加，其中1.0 μg/ml Sema3A組細胞計數(shù)較對照組增加17.36%(P<0.001，圖1A)。培養(yǎng)24 h后，1.0 μg/ml Sema3A組成肌細胞計數(shù)[(1464.19±29.72)個]明顯高于0.1 μg/ml Sema3A組[(1397.69±49.50)個，P<0.001]、0.01 μg/ml Sema3A組[(1381.11±35.18)個，P<0.001]和對照組[(1247.58±26.55)個，P<0.001]，0.1 μg/ml Sema3A組與0.01 μg/ml Sema3A組細胞計數(shù)均明顯高于對照組(P<0.001)，但兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

劃痕實驗結(jié)果顯示，成肌細胞劃痕愈合率隨著重組Sema3A蛋白濃度增高而增高，其中1.0 μg/ml Sema3A組劃痕愈合率較對照組升高69.66%(P<0.001，圖1B)。劃痕24 h后，1.0 μg/ml Sema3A組劃痕愈合率(86.46%±3.09%)明顯高于0.1 μg/ml Sema3A組(78.51%±5.32%，P<0.001)、0.01 μg/ml Sema3A組(73.81%±3.54%，P<0.001)和對照組(50.96%±2.50%，P<0.001)，0.1 μg/ml Sema3A組與0.01 μg/ml Sema3A組劃痕愈合率均明顯高于對照組(P<0.001)，同時0.1 μg/ml Sema3A組劃痕愈合率高于0.01 μg/ml Sema3A組(P<0.05)。

圖1 Sema3A對成肌細胞增殖與遷移能力的影響Fig.1 Effects of Sema3A on proliferation and migration of myoblasts

2.2 Sema3A對成肌細胞分化相關(guān)基因表達的影響 RT-qPCR檢測結(jié)果顯示，Sema3A可上調(diào)成肌分化相關(guān)基因Myf5、MyoG的表達(P<0.05，圖2)。與對照組比較，各濃度(0.01、0.1、1.0 μg/ml) Sema3A組Myf5mRNA相對表達量分別升高25.21%±1.89%、34.02%±5.78%、37.47%±11.67%(P<0.05或P<0.01)，1.0 μg/ml Sema3A組MyoGmRNA相對表達量升高26.57%±11.31%(P<0.05)。各濃度(0.01、0.1、1.0 μg/ml)Sema3A組MyoDmRNA相對表達量呈上升趨勢，但與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

圖2 Sema3A對成肌細胞Myf5、MyoG和MyoD基因表達的影響Fig.2 Effects of Sema3A on the expressions of Myf5, MyoG and MyoD of myoblasts

2.3 Sema3A對成肌細胞基因轉(zhuǎn)錄組表達的影響為了進一步探索Sema3A影響成肌細胞功能狀態(tài)的機制，對1.0 μg/ml Sema3A干預(yù)24 h的成肌細胞與對照組細胞進行去核糖體鏈特異轉(zhuǎn)錄組測序(n=3)，結(jié)果顯示，樣本轉(zhuǎn)錄組的組內(nèi)相關(guān)性較好，組間差異較大(圖3A)；與對照組細胞轉(zhuǎn)錄組比較，1.0 μg/ml Sema3A組有1101個基因表達上調(diào)，974個基因表達下調(diào)，兩組間總體表達譜差異較大(圖3B)。1.0 μg/ml Sema3A組上、下調(diào)基因見附加材料。

圖3 Sema3A對成肌細胞基因轉(zhuǎn)錄組表達的影響Fig.3 Effect of Sema3A on the transcription profile of myoblasts

GO功能富集分析結(jié)果顯示，1.0 μg/ml Sema3A組成肌細胞的上調(diào)通路顯著富集于調(diào)控肌細胞與肌纖維發(fā)育、細胞與解剖結(jié)構(gòu)成熟等與骨骼肌發(fā)育顯著相關(guān)的功能通路，以及骨與軟骨細胞增殖、成骨分化及骨礦化成熟等骨形成相關(guān)的功能通路(圖4A)；而下調(diào)通路主要富集于調(diào)控脂蛋白、乳糜微粒等脂代謝相關(guān)的功能通路(圖4B)。

圖4 Sema3A刺激成肌細胞后差異表達基因的GO富集通路Fig.4 The GO enrichment pathway of differentially expressed genes stimulated by Sema3A in myoblasts

基于生物信息學(xué)分析獲得的差異表達基因，對其中部分參與多個富集通路的Prox1、Myh11、IHH、LipC、ApoC2基因在轉(zhuǎn)錄水平進行驗證，結(jié)果顯示，與對照組比較，1.0 μg/ml Sema3A組Prox1、Myh11mRNA相對表達量升高22.48%±14.42%(P<0.05)、21.42%±5.81%(P<0.01)，LipC、ApoC2mRNA相對表達量降低23.08%±15.38%(P<0.05)、55.97%±26.51%(P<0.05)，而兩組IHHmRNA相對表達量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05) (圖5)。

圖5 RT-qPCR檢測部分差異基因表達水平Fig.5 Expression levels of partial differentially expressed genes detected by RT-qPCR

3 討 論

骨骼肌承擔著機體運動與能量代謝等多種重要功能，結(jié)構(gòu)表淺且力學(xué)負荷高，易受損傷[13-14]。損傷后骨骼肌纖維的再生修復(fù)主要依賴骨骼肌衛(wèi)星細胞，其功能改變或缺失可使骨骼肌發(fā)生纖維化、脂肪沉積等一系列病理改變，嚴重損害骨骼肌的收縮、代謝等功能，導(dǎo)致肌力下降、衰弱，嚴重時可致殘，導(dǎo)致社會勞動力損失[15-16]。有研究發(fā)現(xiàn)，Sema3A與衛(wèi)星細胞功能和骨骼肌損傷之間存在密切聯(lián)系[6]。Sema3A在成肌細胞早期分化階段表達上調(diào)，且對于特定的衛(wèi)星細胞亞群具有遷移導(dǎo)向作用[7,17-18]；當骨骼肌發(fā)生損傷時，衛(wèi)星細胞受局部微環(huán)境調(diào)控可上調(diào)Sema3A的表達及自分泌水平，并進一步參與再生骨骼肌纖維類型的分布等[3,19]；Sema3A對骨骼與骨骼肌內(nèi)血管、神經(jīng)和免疫細胞等組織均具有調(diào)控能力，可能是促進肌、骨損傷后結(jié)構(gòu)再生與功能恢復(fù)的重要潛在靶點[20-22]。

本研究使用重組Sema3A蛋白在體外刺激成肌細胞，發(fā)現(xiàn)Sema3A蛋白可促進成肌細胞的增殖與遷移，且在0.01～1.0 μg/ml濃度區(qū)間呈濃度依賴性。既往研究發(fā)現(xiàn)，衛(wèi)星細胞微環(huán)境中的肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)、成纖維細胞生長因子2(fibroblast growth factor 2，F(xiàn)GF2)均可促使衛(wèi)星細胞激活后Sema3A表達上調(diào)，而轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)可抑制成肌細胞融合與肌纖維再生，同時下調(diào)衛(wèi)星細胞中Sema3A的表達[23-24]。使用Sema3A-siRNA轉(zhuǎn)染后成肌細胞增殖能力下降，而Sema3A過表達可使Pax7+/MyoD+增殖型成肌細胞增多[25]，與本研究結(jié)果趨勢相符。Sema3A由于可調(diào)控細胞骨架的解聚而影響多種細胞的遷移能力，如腫瘤細胞轉(zhuǎn)移、樹突狀細胞遷移和血管通透性等[26-28]。既往研究發(fā)現(xiàn)，Sema3A對特定骨骼肌前體細胞亞群具有遷移導(dǎo)向作用[7]。Sema3A在Ⅰ、Ⅱa型肌纖維中呈高表達，并可作為排斥因子使扭曲蛋白2陽性(Twist2+)骨骼肌干細胞亞群避免與Ⅰ、Ⅱa型肌纖維相融合，發(fā)揮與在神經(jīng)系統(tǒng)中相似的排斥功能[7]。

為探討Sema3A對成肌細胞分化能力的影響，本研究使用含有梯度濃度重組Sema3A蛋白的分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)成肌細胞，發(fā)現(xiàn)成肌細胞中Myf5、MyoG基因表達較對照組明顯升高，MyoD基因表達呈上升趨勢，但與對照組無明顯差異。Myf5、MyoD及MyoG的基本結(jié)構(gòu)相同，均屬于成肌調(diào)節(jié)因子家族(myogenic regulatory factor family)中的轉(zhuǎn)錄因子成員，在胚胎發(fā)生過程中及出生后協(xié)同調(diào)控骨骼肌的發(fā)育，且各轉(zhuǎn)錄因子間相互調(diào)節(jié)[29]。既往研究顯示，特異性敲除Sema3A可使衛(wèi)星細胞中部分分化相關(guān)基因表達下調(diào)，但不影響成肌細胞的融合；過表達Sema3A可使Myf5表達上調(diào)，但不影響MyoD的表達[19]。在肌細胞分化過程中，成肌調(diào)節(jié)因子可被順序激活，其中MyoD在分化中晚期表達上調(diào)而發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用[30]，因此，本研究在成肌細胞體外培養(yǎng)過程中未發(fā)現(xiàn)Sema3A對其表達水平的顯著影響。

本研究生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，Sema3A可使成肌細胞轉(zhuǎn)錄表達譜發(fā)生明顯改變，其中上調(diào)基因顯著富集于肌細胞與肌纖維發(fā)育、細胞與解剖結(jié)構(gòu)成熟等相關(guān)通路，與細胞增殖實驗結(jié)果相符；下調(diào)基因主要富集于調(diào)控脂蛋白、乳糜微粒等脂代謝相關(guān)通路。有研究發(fā)現(xiàn)，脂肪細胞在肌肉中異位沉積可干擾骨骼肌的再生質(zhì)量并使其功能受損[31]。

本研究對部分富集通路中的差異表達基因在mRNA水平進行驗證，結(jié)果顯示，1.0 μg/ml Sema3A組Prox1、Myh11基因表達上調(diào)。在小鼠及人類骨骼肌中，Prox1基因是成肌細胞分化和Ⅰ型肌纖維形成的重要因子，在衛(wèi)星細胞Sema3A特異性敲除小鼠骨骼肌中Ⅰ型肌纖維比例減少且衛(wèi)星細胞成肌分化受損[32]。由此可見，Prox1可能作為Sema3A干預(yù)成肌細胞后激活的轉(zhuǎn)錄因子，參與調(diào)控成肌細胞的分化及骨骼肌纖維類型的分布。不同于Prox1，Myh11主要在平滑肌中表達，參與血管、尿道等器官中肌組織的形成[33]。MYH家族參與機體所有肌肉組織的形成及再生，但Myh11基因?qū)趋兰」δ艿挠绊戸r見報道，其在1.0 μg/ml Sema3A組中表達升高可能與骨骼肌血管再生存在聯(lián)系。

本研究發(fā)現(xiàn)，ApoC2、LipC基因在1.0 μg/ml Sema3A組中表達下調(diào)。ApoC2基因編碼一種脂質(zhì)結(jié)合蛋白，可促進三酰甘油水解以為細胞提供游離脂肪酸，有研究報道，ApoC2基因表達水平與骨骼肌質(zhì)量呈負相關(guān)[34]；在二甲雙胍促進脂肪酸氧化的過程中，成肌細胞中ApoC2表達呈下調(diào)趨勢[35]。LipC基因編碼肝三酰甘油脂肪酶，在乳糜微粒及脂蛋白代謝中起重要作用，參與骨骼肌脂肪酸的代謝[36]。損傷骨骼肌中脂肪累積可嚴重損害再生骨骼肌的結(jié)構(gòu)與功能[31]。Sema3A下調(diào)成肌細胞中ApoC2、LipC基因的表達或可減少游離脂肪酸的形成，從而避免再生骨骼肌中的脂肪異位沉積[37]。間充質(zhì)干細胞及肌源性前體細胞均具有成脂分化的潛能，脂代謝相關(guān)通路及ApoC2、LipC基因表達下調(diào)是否與再生肌組織中干細胞的成脂分化減少相關(guān)尚有待進一步探索。

IHH是一種重要的骨源性因子，在骨骼代謝穩(wěn)態(tài)中不可或缺。作為骨骼的附著組織，肌肉在其發(fā)生及發(fā)育過程中依賴骨骼，而當IHH過表達時，肌肉質(zhì)量明顯增高而不影響長骨長度，表明IHH可獨立于骨骼長度的變化而調(diào)節(jié)肌肉質(zhì)量[38]。在胚胎發(fā)生過程中，肌肉與骨骼發(fā)育的時間和空間接近，當IHH表達缺失時，骨骼肌發(fā)育在胚胎期約第14天出現(xiàn)異常，至胚胎期約第21天后肢體肌肉發(fā)生明顯缺失[38]。也有研究發(fā)現(xiàn)，IHH在損傷骨骼肌的血管再生中發(fā)揮重要功能，高度參與肌骨運動系統(tǒng)的功能穩(wěn)態(tài)[39]。本研究轉(zhuǎn)錄組測序分析發(fā)現(xiàn)IHH基因表達上調(diào)，這可能是Sema3A參與調(diào)控成肌細胞功能的重要機制，但后續(xù)RT-qPCR檢測未觀察到1.0 μg/ml Sema3A組與對照組間存在轉(zhuǎn)錄水平的差異，需要進一步研究加以驗證。此外，《自然》等雜志多次發(fā)文揭示Sema3A通過調(diào)控感覺神經(jīng)長入、促進成骨細胞趨化及活性、抑制破骨細胞分化與成熟等機制發(fā)揮骨保護作用[40-42]。本研究發(fā)現(xiàn)，Sema3A可上調(diào)成肌細胞中與骨細胞增殖、分化及骨礦化成熟相關(guān)的功能通路，與本課題組前期研究結(jié)果一致[20,43]。既往有研究提出，Sema3A可能通過延遲損傷骨骼肌的早期神經(jīng)再支配而調(diào)節(jié)骨骼肌神經(jīng)、血管等組織的協(xié)調(diào)再生，促進骨骼肌損傷修復(fù)[44]，為Sema3A在骨骼肌中的相關(guān)研究提供了新的思路。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，Sema3A可提高成肌細胞的增殖、遷移能力且呈濃度依賴性，并能上調(diào)部分成肌分化相關(guān)基因的表達。Sema3A可上調(diào)肌、骨細胞發(fā)育及成熟等相關(guān)功能通路，下調(diào)部分脂蛋白代謝相關(guān)通路，表明外源性Sema3A可能通過促進肌纖維修復(fù)，調(diào)節(jié)損傷局部組織結(jié)構(gòu)微環(huán)境，以及減少損傷骨骼肌的脂質(zhì)異位沉積而改善再生骨骼肌的質(zhì)量。但目前Sema3A調(diào)控成肌細胞功能關(guān)鍵基因的具體機制及其在體內(nèi)的具體作用仍有待進一步探索。