SLM打印鈦合金片表面含氟納米二氧化鈦薄膜結(jié)構(gòu)的生物相容性及抗菌性能評(píng)價(jià)

吳楠 章晟 葉宸汐 袁振飛 林慧晶 游嘉 徐旭

種植牙技術(shù)已逐漸成為牙列缺損的主流修復(fù)方式之一。純鈦及鈦合金是種植體最常用的金屬，近年來，3D打印技術(shù)越來越多地運(yùn)用于鈦及鈦合金種植體的加工制造[1-2]。選擇性激光熔化技術(shù)（selective laser melting,SLM）是目前發(fā)展最為迅速的金屬3D打印技術(shù)。SLM可以適應(yīng)任意復(fù)雜結(jié)構(gòu)的成型，可用于個(gè)性化設(shè)計(jì)種植體，使之與牙槽窩相匹配。已有體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究顯示，在SLM打印鈦合金種植體表面附著的成骨細(xì)胞表現(xiàn)出良好的黏附、增殖等生物性能，成骨相關(guān)基因顯著表達(dá)，具有良好的骨結(jié)合能力[3-4]，證實(shí)SLM打印鈦合金種植體具有良好的應(yīng)用前景。但是，3D打印種植體表面粗糙度較高，細(xì)菌容易黏附并形成細(xì)菌生物膜，致使發(fā)生種植體周圍炎[5]。而種植體周圍炎一旦發(fā)生，即便采用現(xiàn)有的各種治療措施，也難以達(dá)到令人滿意的效果，最終可能導(dǎo)致種植失敗。近年來，種植體表面改性逐漸受研究者們青睞，即對(duì)種植體表面進(jìn)行功能化的納米二氧化鈦結(jié)構(gòu)改性，引入氟使其具有穩(wěn)定的表面抑菌效果[6]，這是提高種植體表面抗菌活性的同時(shí)提高骨結(jié)合能力的理想方法。氟已被證明具有良好的抗菌性能，較高的氟含量可以顯著提高材料的抗菌性能、促進(jìn)成骨，沒有明顯的細(xì)胞毒性[7-8]。成骨細(xì)胞在種植體表面的黏附和增殖是其表面生物相容性、生物活性優(yōu)劣的重要體現(xiàn)。相較于單純的納米二氧化鈦改性，摻雜氟的納米二氧化鈦結(jié)構(gòu)可以促進(jìn)成骨細(xì)胞在材料表面的黏附和增殖[7,9-12]。以往研究主要以傳統(tǒng)切割純鈦或者鈦合金片為研究對(duì)象，SLM打印鈦合金片表面含氟納米二氧化鈦薄膜結(jié)構(gòu)的生物相容性及抗菌性能評(píng)價(jià)研究少見?；诖?，本實(shí)驗(yàn)對(duì)SLM打印鈦合金片表面進(jìn)行預(yù)處理獲得含氟納米二氧化鈦薄膜結(jié)構(gòu)，隨后觀察成骨細(xì)胞在其表面的黏附、增殖情況，以及該結(jié)構(gòu)對(duì)其表面大腸桿菌、金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞來源及主要試劑 小鼠胚胎成骨細(xì)胞MC3T3-E1 Subclone 14細(xì)胞（武漢普諾賽生命科技有限公司），細(xì)胞專用培養(yǎng)基（武漢普諾賽生命科技有限公司，型號(hào)：CM0378）；鬼筆環(huán)肽（北京索萊寶科技有限公司，型號(hào)：CA1620）；4',6-二脒基-2-苯基吲哚（4',6-diamidino-2-phenylindole,DAPI）溶液（北京索萊寶科技有限公司，型號(hào)：C0065）；抗熒光衰減封片劑（北京索萊寶科技有限公司，型號(hào)：S2100）；CCK-8試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，型號(hào)：CA1210）；4%多聚甲醛（上海源葉生物科技有限公司，型號(hào)：R20497）；Triton X-100（上海源葉生物科技有限公司，型號(hào)：S15022）；2.5%戊二醛（上海源葉生物科技有限公司，型號(hào)：R20510）；0.25%胰蛋白酶（上海源葉生物公科技有限公司，型號(hào)：R20107）；PBS（美國(guó)Gibco公司）；大腸桿菌（衢州市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，型號(hào)：ATCC25922）；金黃色葡萄球菌（衢州市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，型號(hào)：ATCC25923）；活/死細(xì)菌染色試劑盒（美國(guó)ThermoFisher公司，型號(hào)：L13152）；30%過氧化氫（上海凌峰化學(xué)試劑有限公司）；無水乙醇、異丙醇（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；六氟鈦酸（阿拉丁生化科技股份有限公司）；鹽酸（永華化學(xué)科技有限公司）；超純水（自制）。

1.2 主要儀器 熒光倒置顯微鏡（日本Nikon公司）；恒溫水浴鍋（美國(guó)ThermoFisher公司）；細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國(guó)ThermoFisher公司）；酶標(biāo)儀（美國(guó)BioTek公司）；場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡（日本日立公司，型號(hào)：SU8000）；恒溫?fù)u床（美國(guó)ThermoFisher公司）。

1.3 試樣制備 選用SLM 3D打印鈦合金片（直徑10 mm，厚度1 mm，小圓片形）為基體。SLM 3D打印鈦合金片由雷尼紹AM400打印制造（加工參數(shù)：功率200 W，點(diǎn)間距55 μm，曝光時(shí)間50 s）。將鈦合金片經(jīng)噴砂酸蝕等標(biāo)準(zhǔn)化處理去除表面部分熔化的粉末，用無水乙醇、超純水各自超聲清洗5 min，重復(fù)清洗3次后晾干。將其放入30 ml 30%過氧化氫的溶液里，置于80℃下1 h，然后將樣品取出，用超純水超聲清洗，晾干備用。以六氟鈦酸（0.885 mmol/L）、異丙醇（33 mmol/L）、鹽酸（13 mmol/L）、過氧化氫（13 mmol/L）混合溶液為前驅(qū)液，將備用的鈦合金片浸入盛有18 ml前驅(qū)液的25 ml規(guī)格聚四氟乙烯內(nèi)襯不銹鋼高壓反應(yīng)釜中，在160℃下水熱反應(yīng)2 h。反應(yīng)結(jié)束后，取出樣品并用超純水超聲清洗2 min，即實(shí)驗(yàn)組。未進(jìn)行水熱反應(yīng)的樣品為對(duì)照組。兩組樣品均置于超純水中80℃過夜，晾干后，在120℃高壓蒸汽滅菌30 min后備用。

1.4 試樣的表征 制備的實(shí)驗(yàn)組鈦合金片用掃描電子顯微鏡觀察表面微形貌并使用X線能譜儀（energy dispersive spectrometer,EDS）定量分析表面元素。室溫下，用光學(xué)接觸角測(cè)量?jī)x測(cè)量接觸角，分析兩組鈦合金片的接觸角，液體使用超純水，每組選3個(gè)鈦合金片，每個(gè)鈦合金片表面測(cè)量3個(gè)位點(diǎn)。

1.5 成骨細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)

1.5.1 細(xì)胞培養(yǎng) MC3T3-E1 Subclone 14細(xì)胞培養(yǎng)液為MC3T3-E1 Subclone 14細(xì)胞專用培養(yǎng)基。細(xì)胞置于37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)，常規(guī)換液與傳代。

1.5.2 DAPI和鬼筆環(huán)肽熒光染色 將鈦合金片置于24孔培養(yǎng)板中，消化細(xì)胞后，鋪于鈦合金片表面，接種密度為2×104個(gè)/ml。分別培養(yǎng)3、6 h后，PBS輕柔漂洗2次，4%多聚甲醛室溫固定20 min，PBS漂洗3次，每次10 min。用0.5%Triton X-100溶液透化處理5 min，PBS漂洗3次，10 min/次。鬼筆環(huán)肽室溫避光孵育30 min，PBS漂洗3次，5 min/次。用DAPI染色液復(fù)染細(xì)胞核，約3 min。吸除DAPI染色液，PBS漂洗3次，5 min/次。滴加適量抗熒光衰減封片劑，置于熒光倒置顯微鏡下觀察成骨細(xì)胞黏附伸展的形態(tài)。實(shí)驗(yàn)均設(shè)置3組平行試驗(yàn)。

1.5.3 細(xì)胞形態(tài)學(xué)分析 將鈦合金片置于24孔培養(yǎng)板中，消化細(xì)胞后，鋪于鈦合金片表面，接種密度為8 000個(gè)/ml。培養(yǎng)3 d后，PBS漂洗3次，2.5%戊二醛在4℃過夜。PBS漂洗3次，10 min/次，餓酸固定30 min，乙醇、叔丁醇梯度脫水：50%、70%、80%、90%依次脫水1次，10 min/次，100%脫水2次，10 min/次，臨界點(diǎn)干燥和噴金后，用場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡觀察細(xì)胞在含氟納米二氧化鈦薄膜結(jié)構(gòu)上的形態(tài)及突觸分布，評(píng)估細(xì)胞生長(zhǎng)分化情況。實(shí)驗(yàn)均設(shè)置3組平行試驗(yàn)。

1.5.4 細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn) 將鈦合金片置于24孔培養(yǎng)板中，消化細(xì)胞后鋪于鈦合金片表面，接種密度為2×104個(gè)/ml。培養(yǎng)30、60和120 min后，用PBS沖洗3遍后至新的培養(yǎng)板中，每孔加入50 μl的CCK-8溶液，再加入500 μl的新鮮培養(yǎng)基，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，吸取100 μl反應(yīng)液放入96孔板中，利用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)條件下檢測(cè)其吸光度A值。實(shí)驗(yàn)均設(shè)置3組平行試驗(yàn)。

1.5.5 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 將鈦合金片置于24孔培養(yǎng)板中，消化細(xì)胞后鋪于鈦合金片表面，接種密度為8 000個(gè)/ml。培養(yǎng)1、3和7 d后，用PBS沖洗3遍后至新的培養(yǎng)板中，每孔加入50 μl的CCK-8溶液，再加入500 μl的新鮮培養(yǎng)基，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，吸取100 μl反應(yīng)液放入96孔板中，利用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)條件下檢測(cè)其吸光度A值。實(shí)驗(yàn)均設(shè)置3組平行試驗(yàn)。

1.6 抗菌性能實(shí)驗(yàn)

1.6.1 菌種活化 將冷凍保存的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌從超低溫冰箱中取出，快速恢復(fù)到室溫。在超凈工作臺(tái)內(nèi)使用75%酒精棉球擦拭細(xì)菌凍存管表面，隨后將菌液倒入無菌瓊脂固體培養(yǎng)基中，放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中復(fù)蘇24 h，用無菌的細(xì)菌接種環(huán)蘸取上述復(fù)蘇所得菌液在無菌瓊脂固體培養(yǎng)皿上按Z字形劃線，繼續(xù)將接種好的培養(yǎng)皿放入37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，可觀察到單個(gè)菌落形成，用封口膜密封后倒置放于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6.2 菌液制備 用滅菌接種環(huán)挑取形態(tài)正常的單菌落置于相應(yīng)液體培養(yǎng)基中，并放入恒溫?fù)u床中，37℃，200 r/min搖菌過夜；以12 000 r/min離心過夜菌液5 min，小心棄上清液，用PBS緩沖液重懸細(xì)菌。利用酶標(biāo)儀檢測(cè)菌液在600 nm處的吸光度A值，根據(jù)測(cè)得的A值估算菌液濃度，并用培養(yǎng)基稀釋數(shù)倍，將最終濃度調(diào)整為1×106CFU/ml（A600nm為1時(shí)，菌液濃度大概為1×109CFU/ml，以此按倍數(shù)稀釋）備用。

1.6.3 平板活菌計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn) 將鈦合金片在紫外燈下滅菌24 h，分別取1 ml濃度為1×106CFU/ml的兩種菌液于24孔板，將鈦合金片用無菌鑷子加至24孔板，使其低于菌液液面，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中震蕩培養(yǎng)4 h，取出鈦合金片用無菌PBS沖洗掉表面浮菌。然后，將各組鈦合金片加入到含有5 ml無菌PBS的離心管中。渦旋振蕩儀震蕩5 min，使鈦合金片表面的細(xì)菌脫落到PBS溶液中，稀釋相同倍數(shù)后，各取10 μl菌懸液均勻涂布在瓊脂固體培養(yǎng)基平板上，在37℃條件下培養(yǎng)24 h，拍照記錄菌落數(shù)量，計(jì)算各組材料表面抑菌率。實(shí)驗(yàn)均設(shè)置3組平行試驗(yàn)。抑菌率由下述公式進(jìn)行計(jì)算。抑菌率（%）=（對(duì)照組菌落數(shù)-實(shí)驗(yàn)組菌落數(shù)）/對(duì)照組菌落數(shù)×100%。

1.6.4 活/死細(xì)菌染色實(shí)驗(yàn) 將鈦合金片在紫外燈下滅菌24 h。分別取1 ml濃度為1×106CFU/ml的兩種菌懸液于24孔板中，將鈦合金片用無菌鑷子加至24孔板，使其低于菌懸液液面，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中震蕩培養(yǎng)4 h，無菌PBS沖洗掉表面浮菌。根據(jù)活/死細(xì)菌染色試劑盒操作說明書，在材料表面滴加SYTO 9綠色熒光核酸染料和碘化丙啶（propidium iodide,PI），避光孵育15 min，無菌水沖洗2次。然后制樣，在熒光倒置顯微鏡下觀察。實(shí)驗(yàn)均設(shè)置3組平行試驗(yàn)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料用表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組鈦合金片的表征結(jié)果比較 掃描電鏡結(jié)果顯示，經(jīng)酸蝕、水熱處理后的實(shí)驗(yàn)組鈦合金片表面有納米二氧化鈦薄膜結(jié)構(gòu)形成，見圖1。實(shí)驗(yàn)組鈦合金片表面EDS能譜元素分析結(jié)果顯示，經(jīng)過水熱處理后該層二氧化鈦薄膜含有氟元素，見表1。對(duì)照組鈦合金片表面接觸角為（94.8±7.4）°，實(shí)驗(yàn)組表面接觸角為（30.6±9.1）°，這可能與實(shí)驗(yàn)組鈦合金片表面納米薄膜片狀結(jié)構(gòu)有關(guān)，增加了鈦合金片表面的比表面積和浸入空間。實(shí)驗(yàn)組鈦合金片接觸角低于對(duì)照組，兩組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖2。而接觸角的大小與材料表面的親水性成反比，因此含氟納米二氧化鈦薄膜結(jié)構(gòu)的SLM打印鈦合金片親水性顯著高于無表面處理的鈦合金片。

圖1 實(shí)驗(yàn)組鈦合金片表面掃描電鏡觀察所見（×100 000）

表1 實(shí)驗(yàn)組鈦合金表面EDS能譜元素分析

圖2 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組鈦合金片表面接觸角比較

2.2 成骨細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 DAPI和FITC phalloidin熒光染色后的兩組細(xì)胞黏附伸展形態(tài)比較 細(xì)胞熒光染色照片顯示，培養(yǎng)3 h后，在對(duì)照組鈦合金表面，細(xì)胞數(shù)量少，肌動(dòng)蛋白未見明顯拉長(zhǎng)，見圖3a（插頁(yè)）；在實(shí)驗(yàn)組鈦合金表面，細(xì)胞數(shù)量較多，細(xì)胞鋪展面增加，肌動(dòng)蛋白開始拉長(zhǎng)，見圖3b（插頁(yè)）。培養(yǎng)6 h后，在對(duì)照組鈦合金表面，細(xì)胞數(shù)量增加，肌動(dòng)蛋白更加清晰，見圖3c（插頁(yè)）；在實(shí)驗(yàn)組鈦合金表面，細(xì)胞數(shù)量較多，細(xì)胞鋪展面增加，部分細(xì)胞成長(zhǎng)梭形，肌動(dòng)蛋白更加伸展，呈指狀突起，肌動(dòng)蛋白纖維開始清晰，見圖3d（插頁(yè)）。

圖3 熒光倒置顯微鏡觀察兩組細(xì)胞熒光染色后的黏附伸展形態(tài)（a：對(duì)照組培養(yǎng)3 h后；b：實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)3 h后；c：對(duì)照組培養(yǎng)6 h后；d：實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)6 h后；×400）

2.2.2 兩組鈦合金片表面細(xì)胞形態(tài)學(xué)比較 掃描電鏡下觀察MC3T3-E1 Subclone 14細(xì)胞的黏附形態(tài)，培養(yǎng)3 d后，對(duì)照組細(xì)胞數(shù)量較少，伸展較差，細(xì)胞呈短梭形，偽足圓鈍且短，觸角較少；實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞數(shù)量較多，伸展較好，細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，偽足細(xì)長(zhǎng)，觸角較多，見圖4。

圖4 掃描電鏡觀察兩組鈦合金片表面細(xì)胞黏附伸展情況

2.2.3 兩組鈦合金片表面細(xì)胞黏附能力比較 細(xì)胞在鈦合金片表面培養(yǎng)30、60、120 min后，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞黏附能力均高于對(duì)照組（均P＜0.05），見圖5。

圖5 兩組鈦合金片表面細(xì)胞黏附能力比較

2.2.4 兩組鈦合金片表面細(xì)胞增殖能力比較 培養(yǎng)3、7 d后，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖能力高于對(duì)照組（P＜0.05），培養(yǎng)1 d時(shí)兩組細(xì)胞增殖能力比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖6。

圖6 兩組鈦合金片表面細(xì)胞增殖能力比較

2.3 抗菌性能實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 兩組鈦合金片對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)的影響比較 平板活菌計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組鈦合金片共培養(yǎng)4 h后的細(xì)菌在瓊脂固體培養(yǎng)基平板上生長(zhǎng)旺盛，而與實(shí)驗(yàn)組鈦合金片共培養(yǎng)可明顯抑制大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)。經(jīng)過細(xì)菌計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組鈦合金片對(duì)大腸桿菌抑菌率達(dá)61.20%，對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌率達(dá)69.05%。實(shí)驗(yàn)組大腸桿菌、金黃色葡萄球菌菌落數(shù)均低于對(duì)照組（均P＜0.05），見圖7（插頁(yè)）、表2。

圖7 兩組平板活菌計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖

表2 兩組鈦合金片表面細(xì)菌培養(yǎng)4 h后平板活菌計(jì)數(shù)比較（個(gè)）

2.3.2 兩組鈦合金片抗菌性能比較 利用活/死菌染色實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步評(píng)價(jià)兩組鈦合金片表面的抗菌性能，SYTO 9能穿透活細(xì)菌和死細(xì)菌的細(xì)胞膜，顯現(xiàn)出綠色熒光，而PI只能穿透死細(xì)菌的細(xì)胞膜，顯現(xiàn)出紅色熒光。結(jié)果顯示，對(duì)照組鈦合金片表面有較多的綠色熒光，而在培養(yǎng)相同時(shí)間的實(shí)驗(yàn)組鈦合金片表面有較多的紅色熒光，且金黃色葡萄球菌組差異較大腸桿菌組明顯，見圖8（插頁(yè)）。

圖8 熒光倒置顯微鏡觀察兩組鈦合金片活死菌染色后的情況（×100）

3 討論

良好的骨結(jié)合形成是種植牙成功的基礎(chǔ)[13]。種植體周圍骨結(jié)合的形成是一個(gè)多步驟的過程，它包括了成骨細(xì)胞在種植體材料表面的黏附、增殖、分化。其中成骨細(xì)胞的黏附既是種植體材料表面與成骨細(xì)胞反應(yīng)的第一步，又是骨結(jié)合形成的首要環(huán)節(jié)，因此成骨細(xì)胞在材料表面的早期黏附是評(píng)價(jià)其生物相容性和生物活性的一個(gè)重要指標(biāo)[14]。細(xì)胞的黏附與材料表面的親水性有密切關(guān)系，而親水性可以通過測(cè)量材料表面的與液體之間的接觸角來計(jì)算，材料與水之間的低接觸角表明水在材料表面的擴(kuò)散良好，說明材料具有高親水性[15]。目前大部分學(xué)者認(rèn)為成骨細(xì)胞更容易黏附在高親水性的材料表面。Toffoli等[16]認(rèn)為熱處理改善了鈦表面成骨細(xì)胞的黏附的原因是熱處理提高了鈦表面的親水性，從而提高了纖維連接蛋白的黏附。

本實(shí)驗(yàn)通過接觸角測(cè)量來評(píng)價(jià)具有含氟納米二氧化鈦薄膜結(jié)構(gòu)的SLM打印鈦合金片與無表面處理的鈦合金片的親水性，再通過熒光染色、掃描電鏡觀察、細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)來評(píng)價(jià)成骨細(xì)胞在材料表面的黏附、增殖水平。

掃描電鏡觀察證實(shí)，前驅(qū)液浸泡和水熱法表面處理在鈦合金片表面成功制備了納米二氧化鈦薄膜結(jié)構(gòu)。EDS能譜元素分析結(jié)構(gòu)顯示，經(jīng)過水熱處理后該層二氧化鈦薄膜含有氟元素。接觸角測(cè)量結(jié)果進(jìn)一步提示，含氟納米二氧化鈦薄膜結(jié)構(gòu)可以提高鈦合金片表面的親水性，與以往研究結(jié)果一致[17]，這可能與納米薄膜片狀結(jié)構(gòu)增加了鈦合金片表面的比表面積和浸入空間有關(guān)。細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在體外培養(yǎng)30、60、120 min后，成骨細(xì)胞在含氟納米二氧化鈦薄膜結(jié)構(gòu)的鈦合金片表面的黏附均顯著高于無表面處理的鈦合金片表面。一方面，可能是因?yàn)楹{米二氧化鈦薄膜結(jié)構(gòu)的SLM打印鈦合金片具有較高的親水性。親水性的提高可以促進(jìn)成骨細(xì)胞在鈦合金片表面的早期黏附[18]，與無表面處理的鈦合金片相比，含氟納米二氧化鈦薄膜結(jié)構(gòu)的SLM打印鈦合金片具有更小的接觸角，即更好的親水性。另一方面，含氟納米二氧化鈦薄膜結(jié)構(gòu)可能使得實(shí)驗(yàn)組鈦合金片比無表面處理的鈦合金片具有更適合成骨細(xì)胞黏附的表面粗糙度，骨組織表面的粗糙度大約是32 nm，當(dāng)種植體表面的粗糙度與骨組織表面相似，即達(dá)到納米級(jí)后，可以極大的提升成骨細(xì)胞在其表面的黏附能力，因?yàn)檫m宜的表面粗糙度有利于更多黏附相關(guān)蛋白的吸收，如纖維連接蛋白等[19-20]。

MC3T3-E1 Subclone 14細(xì)胞體外培養(yǎng)3、6 h的熒光染色結(jié)果顯示：與無表面處理的鈦合金片表面相比，含氟納米二氧化鈦薄膜結(jié)構(gòu)的SLM打印鈦合金片表面成骨細(xì)胞黏附數(shù)量較多，細(xì)胞形態(tài)鋪展較好，肌動(dòng)蛋白更加伸展，呈指狀突起，肌動(dòng)蛋白纖維更加清晰。細(xì)胞體外培養(yǎng)3 d后的掃描電鏡觀察結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)：與無表面處理的鈦合金片表面相比，含氟納米二氧化鈦薄膜結(jié)構(gòu)的SLM打印鈦合金片表面成骨細(xì)胞黏附形態(tài)鋪展較好，呈長(zhǎng)梭形，偽足細(xì)長(zhǎng)，觸角較多。細(xì)胞形態(tài)是細(xì)胞受不同材料表面影響的最直觀的表現(xiàn)形式，細(xì)胞骨架對(duì)細(xì)胞黏附、增殖、分化等生物學(xué)行為非常重要，清晰的細(xì)胞骨架網(wǎng)絡(luò)可能會(huì)使細(xì)胞黏附增強(qiáng)[21-22]。研究表明，成骨細(xì)胞在納米結(jié)構(gòu)的鈦表面會(huì)伸出豐富的絲狀偽足，錨定在納米結(jié)構(gòu)上，有利于細(xì)胞的黏附和增殖[23-24]。細(xì)胞黏附形態(tài)觀察的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與CCK-8法測(cè)得的細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致，即含氟納米二氧化鈦薄膜結(jié)構(gòu)可以促進(jìn)MC3T3-E1 Subclone 14細(xì)胞的伸展，從而促進(jìn)其在材料表面的黏附。

細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：從體外培養(yǎng)第3天開始，細(xì)胞在含氟納米二氧化鈦薄膜結(jié)構(gòu)的鈦合金片表面的增殖能力顯著高于無表面處理的鈦合金片表面，而在第1天兩組鈦合金片表面成骨細(xì)胞的增殖能力無明顯差異。有研究結(jié)果表明，親水性以及粗糙的表面更適合成骨細(xì)胞的增殖[8,25]。培養(yǎng)1 d時(shí)兩組鈦合金片之間無明顯差異可能是由于細(xì)胞密度較低、作用時(shí)間較短，使得兩組鈦合金片表面成骨細(xì)胞的增殖無明顯差異。

種植體周圍炎形成的生物學(xué)原理是多種細(xì)菌附著在種植體表面形成細(xì)菌生物膜，導(dǎo)致種植體周圍感染并產(chǎn)生炎癥。同細(xì)胞的黏附一樣，細(xì)菌的黏附也是一個(gè)復(fù)雜的過程，它取決于許多因素，如細(xì)菌種類與特征、材料表面的化學(xué)成分、表面電荷、潤(rùn)濕性和粗糙度等。眾多研究表明，納米二氧化鈦表面改性以及表面加載氟離子均可提高材料表面的抗菌性能。Lorenzetti等[26]用水熱處理法在鈦表面合成具有納米結(jié)構(gòu)的二氧化鈦涂層，這種涂層可影響蛋白質(zhì)吸附和促進(jìn)骨再生，與無涂層的鈦表面相比，表面黏附的大腸桿菌減少了50%。Bhadra等[27]運(yùn)用水熱法在鈦表面制備了模仿蜻蜓膜翅的納米線陣列結(jié)構(gòu)，這種表面具有高表面自由能和親水性，與細(xì)菌接觸時(shí)會(huì)引起細(xì)菌胞膜的變形、破裂。該表面對(duì)銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌的抑菌率分別為50%和20%。與無涂層材料相比，二氧化鈦涂層顯著促進(jìn)了成骨細(xì)胞的黏附和增殖，并顯示出針對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌的抗菌效能。Arenas等[28]通過陽(yáng)極氧化等方法在鈦表面制備了含氟二氧化鈦屏障，并通過與無氟的二氧化鈦樣品進(jìn)行對(duì)照，結(jié)果表明氟的存在降低了細(xì)菌在其表面的黏附，氟是增強(qiáng)表面抗菌性能的關(guān)鍵。Yan等[29]在鈦上構(gòu)建了多功能含氟鋯金屬有機(jī)框架薄膜結(jié)構(gòu)（Zr-MOF），并證實(shí)由于氟離子的釋放，該結(jié)構(gòu)對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均表現(xiàn)出良好的抗菌性能，且Zr-MOF的抗菌活性隨著氟化物含量的增加而提高。表面加載的氟離子釋放后可以抑制表面細(xì)菌的生長(zhǎng)，在一定范圍內(nèi)，氟的摻入量越高，抗菌能力越強(qiáng)[11]。

本實(shí)驗(yàn)選用種植體周圍炎中最常見也最具代表性的革蘭陰性菌（大腸桿菌）和革蘭陽(yáng)性菌（金黃色葡萄球菌），用平板活菌計(jì)數(shù)和活/死菌染色實(shí)驗(yàn)來檢測(cè)SLM打印鈦合金片的抗菌性能。平板活菌計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，與無表面處理的鈦合金片共培養(yǎng)4 h后的細(xì)菌在瓊脂固體培養(yǎng)基平板上生長(zhǎng)旺盛，而與含氟納米二氧化鈦薄膜結(jié)構(gòu)的鈦合金片共培養(yǎng)后大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)可被明顯抑制，材料表面表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗菌能力。經(jīng)過菌落計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn)，與含氟納米二氧化鈦薄膜結(jié)構(gòu)的鈦合金片共培養(yǎng)后大腸桿菌抑菌率達(dá)61.20%，金黃色葡萄球菌抑菌率達(dá)69.05%?；钏谰旧珜?shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，無表面處理的鈦合金片表面有較多的綠色熒光和較少的紅色熒光，而在培養(yǎng)相同時(shí)間的含氟二氧化鈦納米薄膜的鈦合金片表面有較多的紅色熒光和較少的綠色熒光，且金黃色葡萄球菌組的差異較大腸桿菌組明顯，這與平板活菌計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，含氟二氧化鈦納米薄膜結(jié)構(gòu)具有一定的抗菌殺菌的作用。這與其表面二氧化鈦納米結(jié)構(gòu)和加載的氟離子有密切關(guān)系。

盡管已有體內(nèi)外結(jié)果顯示，與不含氟的鈦片表面相比，含氟的鈦片表面具有更高的成骨活性和抗菌性能[12,28-29]。但是本實(shí)驗(yàn)沒有提供有關(guān)的數(shù)據(jù)表明氟離子的釋放可以在納米二氧化鈦薄膜提高鈦合金片生物活性和抗菌活性的基礎(chǔ)上進(jìn)一步提高其生物活性和抗菌活性。后續(xù)會(huì)增加對(duì)照實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步明確該實(shí)驗(yàn)中氟的作用，評(píng)價(jià)氟的釋放量與鈦合金片處理表面生物活性及抗菌活性的關(guān)系。

利用SLM 3D打印個(gè)性化種植體是目前種植體發(fā)展的重要方向，由于種植體表面結(jié)構(gòu)對(duì)其骨結(jié)合性能有重要影響，因此利用表面處理技術(shù)在打印的鈦合金種植體表面構(gòu)建一層含氟的納米二氧化鈦薄膜結(jié)構(gòu)，有利于改善表面的親水性和表面的粗糙度，進(jìn)而促進(jìn)成骨細(xì)胞的黏附、增殖、分化。對(duì)照實(shí)驗(yàn)表明，與無表面處理的鈦合金表面相比，含氟納米二氧化鈦薄膜結(jié)構(gòu)可以促進(jìn)成骨細(xì)胞在SLM打印鈦合金表面的黏附和增殖，較SLM 3D打印鈦合金片常規(guī)表面結(jié)構(gòu)具有更好的生物相容性。同時(shí)，含氟納米二氧化鈦薄膜結(jié)構(gòu)可以抑制大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)，較SLM打印鈦合金片常規(guī)表面結(jié)構(gòu)具有更好的抗菌性能。