腺苷/A2AR信號通路阻斷在腫瘤治療中的應用

劉佳 石岳泉 劉瀟衍 張東明 白瑜 徐燕 王孟昭

腺苷通路通常是指腺苷及其受體以及腺苷代謝過程涉及的多種酶和代謝產(chǎn)物。對腺苷通路調(diào)節(jié)免疫的研究可以追溯到約半個世紀以前[1]，近十余年來，其在抗腫瘤免疫方面的作用受到廣泛關注。體內(nèi)外試驗發(fā)現(xiàn)，腺苷/腺苷受體可以抑制抗腫瘤免疫反應，尤其腺苷A2A受體（adenosine A2A receptor, A2AR）在免疫細胞上廣泛表達且親和力高，在腫瘤的免疫逃逸和現(xiàn)有的腫瘤治療方案耐藥中起到關鍵作用。因此，腺苷/A2AR通路阻斷成為腫瘤免疫治療的重要方向。在這篇綜述中，我們將梳理阻斷腺苷通路治療腫瘤的理論機制，總結腺苷/A2AR通路阻斷在腫瘤治療中已有的研究結果，并對其在未來的應用前景進行展望。

1 腫瘤微環(huán)境中胞外腺苷水平升高

腺苷代謝在正常組織和腫瘤組織中廣泛存在，在細胞內(nèi)外都可代謝產(chǎn)生腺苷（圖1）。細胞外腺苷的產(chǎn)生主要有兩條途徑，典型途徑是細胞外三磷酸腺苷（adenosine triphosphate, ATP）在外核苷酶CD39作用下去磷酸化生成一磷酸腺苷（adenosine monophosphate, AMP），AMP在外核苷酶CD73作用下生成腺苷[2]。除上述途徑外，胞外煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide,NAD+）可在CD38和CD203a作用下生成AMP[3]，繼而經(jīng)CD73水解生成腺苷。腺苷在細胞外代謝極快，僅存在數(shù)秒的時間[4]，其去路包括作用于相應的受體調(diào)節(jié)代謝，或被腺苷脫氨酶（adenosine deaminase, ADA）降解生成肌苷[5]，或被位于細胞膜上的核苷轉運體轉運至胞內(nèi)[6]。細胞內(nèi)也可以直接生成腺苷，因為細胞內(nèi)存在可溶性CD73，可將胞內(nèi)AMP水解生成腺苷[7]。胞內(nèi)腺苷可經(jīng)由腺苷激酶（adenosine kinase, ADK）作用生成AMP，或被ADA水解，或被轉運體轉運至胞外[8]。胞外的ATP是潛在的趨化因子和炎癥刺激因子[9]，而胞外腺苷總體而言起到免疫抑制作用，生理狀態(tài)下ATP和腺苷在細胞外的水平很低，且兩者處于動態(tài)平衡中，使免疫反應的強度控制在恰當水平。但在腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment, TME）中，由于低氧、炎癥反應、營養(yǎng)匱乏、細胞毒性藥物的使用等種種因素[9-11]，ATP經(jīng)由通道釋放、囊泡釋放、或細胞壞死直接釋放等多種方式到達胞外，導致細胞外ATP生成增加（圖1）。同時，TME中促進ATP向腺苷轉化的各種酶的表達也是升高的。在TME中腫瘤細胞、免疫細胞、內(nèi)皮細胞、成纖維細胞等都有表達CD39和/或CD73[12,13]，腫瘤細胞還可以產(chǎn)生攜帶CD39和CD73的外分泌體[14]。在這些酶的作用下腺苷生成明顯增多。除CD39和CD73外，CD38依賴的通路也是導致TME中腺苷水平升高的重要途徑。由于腫瘤代謝變異，胞外NAD+濃度升高，同時I型干擾素、全反式維甲酸、免疫檢查點抑制劑等都可以上調(diào)CD38的表達[15]。同時，TME低氧環(huán)境下通過低氧誘導因子1（hypoxia-inducible factor 1, HIF1）途徑，腺苷水解酶ADA的表達受到抑制[16]。綜上，在TME中大量ATP被水解生成腺苷，胞外NAD+在CD38作用下最終代謝生成腺苷，且ADA表達降低，導致胞外腺苷水平升高。

圖1 腺苷代謝通路。腺苷的前體ATP可由細胞裂解/死亡、胞吐、通道釋放或轉運體等多種方式釋放到細胞外。ATP經(jīng)CD39酶解生成AMP，AMP經(jīng)CD73生成腺苷，這是腺苷生成的經(jīng)典途徑。此外，NAD+也可作為底物，在CD38和CD203a作用下生成AMP進而生成腺苷。細胞外腺苷可作用于四種受體（A1R、A2AR、A2BR、A3R）發(fā)揮作用，或被ADA代謝生成肌苷，或被核苷轉運體轉運至胞內(nèi)。在細胞內(nèi)，腺苷和AMP、AMP和ATP可在酶的作用下相互轉化。在腺苷的四種受體中，A1R和A3R抑制AC，下調(diào)cAMP，而A2AR和A2BR激活AC，上調(diào)cAMP，cAMP在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。ATP：三磷酸腺苷；AMP：一磷酸腺苷；ADO：腺苷；NAD+：煙酰胺腺嘌呤二核苷酸；ADA：腺苷脫氨酶；ADK：腺苷激酶；AC: 腺苷酸環(huán)化酶；cAMP：環(huán)磷酸腺苷。Fig 1 Adenosine metabolic pathway. ATP, the precursor of ADO, can be released into extracellular space by cell lysis/death, exocytosis, channels or transporters. Sequential hydrolysis of ATP to AMP by CD39 and AMP to ADO by CD73 is the canonical pathway to produce extracellular ADO. In addition, NAD+ can also act as a substrate to generate AMP and thus adenosine by CD38 and CD203a. Extracellular ADO can act on four receptors(A1R, A2AR, A2BR, and A3R), or be metabolized by ADA to generate inosine or transported into cells by nucleoside transporters. In the intracellular space, ADO and AMP, AMP and ATP can be converted to each other by enzymes. Among the four adenosine receptors, A1R and A3R inhibit AC and down-regulate cAMP while A2AR and A2BR activate AC and up-regulate cAMP, which play an important role in immune regulation. ATP: adenosine triphosphate; AMP: adenosine monophosphate; ADO: adenosine; NAD+: nicotinamide adenine dinucleotide; ADA: adenosine deaminase; ADK:adenosine kinase; AC: adenylate cyclase; cAMP: cyclic adenosine phosphate.

2 腺苷/A2AR通路激活導致腫瘤免疫逃逸

胞外腺苷可作用于4種嘌呤能G蛋白偶聯(lián)受體，即A1受體（A1R）、A2AR、A2B受體（A2BR）和A3受體（A3R）[17]，這4種受體在多種細胞上都有表達，包括免疫細胞。其中A1R和A3R主要表達于中性粒細胞，調(diào)節(jié)中性粒細胞的趨化作用；A2AR在T細胞、自然殺傷T細胞、單核細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞（dendritic cells, DCs）、自然殺傷（natural killer, NK）細胞廣泛表達，起到抗炎和抑制免疫的作用；A2BR主要在巨噬細胞和DCs上表達，其激活能夠促進白細胞介素-6（interleukin-6, IL-6）和血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）的釋放[18]。但A2BR在4種受體中親和力最低，在生理狀態(tài)下極少被激活[18]?？傊珹2AR在免疫細胞上分布最為廣泛，親和力相對較高，其在免疫細胞中的作用得到了較為全面和深入的研究。

腺苷/A 2 A R激活可活化下游的腺苷酸環(huán)化酶（adenylate cyclase, AC）從而上調(diào)環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate, cAMP）水平[17]，cAMP可通過蛋白激酶A（protein kinase A, PKA）影響免疫細胞和免疫過程。在效應T細胞中，A2AR信號引起的PKA激活具有多種抑制作用，包括：①通過阻斷Zeta鏈相關蛋白激酶的激活來抑制近端T細胞受體信號[19,20]；②抑制多種絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase, MAPK）的活性[19]；③抑制蛋白激酶C（protein kinase C, PKC）的活性，而PKC在效應細胞活化中起重要作用[18]；④引起cAMP應答元件結合蛋白（cAMP-responsive element-binding protein 1, CREB）活化，對核因子κB（nuclear factor-κB, NF-κB）和活化T細胞核因子（nuclear factor of activated T cells, NFAT）起抑制作用[21]；⑤抑制T細胞增殖[18]。A2AR激活還可抑制CD4+T細胞分泌白細胞介素2（interleukin-2, IL-2）并抑制共刺激受體CD28的表達[22]。在效應性CD8+T細胞中，腺苷/A2AR通路對細胞增殖、細胞因子產(chǎn)生及細胞殺傷作用均有抑制作用[18]。無論是效應T細胞還是調(diào)節(jié)T細胞（regulatory T cells, Treg），A2AR可增加程序性死亡受體1（programmed cell death protein 1, PD-1）、細胞毒性T淋巴細胞相關抗原4（cytotoxic T lymphocyte antigen 4,CTLA-4）、淋巴細胞活化基因3蛋白（lymphocyte activation gene 3 protein, LAG-3）、T細胞免疫球蛋白粘蛋白分子3（T cell immunoglobulin and mucin domain-containing protein 3,TIM-3）等免疫檢查點的表達[13,18,23]，并促進CD4+T細胞向Treg細胞分化。最后，A2AR還可通過上調(diào)Foxp3表達來穩(wěn)定Treg細胞[24]。

除T細胞以外，A2AR也對其他免疫細胞進行調(diào)節(jié)。A2AR激活可抑制NK細胞成熟[25]。在NK細胞中，A2AR激活在轉錄水平誘導Foxo-1表達升高，可能是通過此途徑限制NK細胞成熟和功能[26]。在巨噬細胞中，A2AR激活使其分化為抑制免疫的M2樣表型，產(chǎn)生白細胞介素20（interleukin-20, IL-20）、VEGF和精氨酸酶[27,28]，利于腫瘤生長。在DCs中，A2AR信號抑制DCs成熟，誘導DCs分化為免疫抑制的表型，分泌白細胞介素10（interleukin-10,IL-10）、VEGF、轉化生長因子β（transforming growth factor β, TGFβ）、精氨酸酶和免疫調(diào)節(jié)酶吲哚胺2,3-雙加氧酶（indoleamine 2,3-dioxygenase, IDO）、環(huán)氧化酶（cyclooxygenase 2, COX2），抑制IL-2和CD80/CD86共刺激分子[25]。體外實驗中，暴露于腺苷的DCs可讓T細胞失去效應能力[29]。

如前所述，在TME中，由于低氧、營養(yǎng)不足及炎癥狀態(tài)等因素，ATP大量釋放至胞外。ATP本身可作用于免疫細胞上的P2X7受體促進抗腫瘤免疫應答[10]。但TME中大量ATP轉化生成腺苷，這一方面導致了胞外ATP水平降低，另一方面，腺苷通過A2AR等受體發(fā)揮免疫抑制作用，從而限制了炎癥反應的強度和抗腫瘤免疫的力度。此外，腫瘤細胞本身也表達腺苷受體，胞外腺苷可直接作用于腫瘤細胞促進其生長和轉移。例如，在胃癌模型中，A2AR信號作用于腫瘤細胞，激活PI3K-AKT-mTOR信號通路，促進腫瘤生長和轉移[30]。綜上所述，TME中腺苷水平升高和A2AR激活成為腫瘤免疫逃逸的重要途徑。因此，對腺苷/A2AR通路的阻斷有望增強抗腫瘤免疫應答，進而改善腫瘤患者的預后。

3 腺苷/A2AR通路阻斷用于抗腫瘤治療的臨床前研究

早在十余年前，Sitkovsky團隊[31]發(fā)現(xiàn)在A2AR基因敲除的小鼠中，通過CD8+T細胞依賴的途徑，腫瘤的生長被完全抑制，而且特異性敲除T細胞的A2AR和A2BR可抑制腫瘤轉移，延長生存。他們還在肉瘤模型和免疫原性差的LL-LCMV腫瘤模型中證明了藥物阻斷A2AR可以增強T細胞介導的抗腫瘤作用[31]。另有研究[32]表明，在小鼠乳腺癌和黑色素瘤模型中，A2AR阻斷能夠抑制腫瘤的轉移能力。Powell團隊[33]報告了在A2AR缺失小鼠中，EL4腫瘤細胞生長受到抑制，并進一步證明在A2AR基因敲除小鼠模型中應用抗PD-1治療可增強抗腫瘤效應。隨后的研究[34-36]也表明，在多種腫瘤模型中，抑制A2AR和阻斷免疫檢查點（例如PD-1、TIM-3、CTLA-4等）聯(lián)合應用可有效增強免疫介導的腫瘤控制。A2AR阻斷還可以與CD73阻斷聯(lián)用。A2AR和CD73的阻斷都是針對腺苷通路介導的免疫抑制，乍看這種聯(lián)用策略似乎多此一舉。但胞外腺苷可經(jīng)由多種代謝途徑產(chǎn)生（圖1），單一阻斷CD73并不能完全抑制腺苷生成。另一方面，A2AR不是介導免疫抑制的唯一受體，在腺苷濃度較高的腫瘤微環(huán)境中，親和力低的A2BR可能發(fā)揮作用導致腫瘤免疫逃逸的發(fā)生。因此，同時阻斷A2AR和CD73在理論上可以實現(xiàn)增效的抗腫瘤能力。臨床前研究也證實了這種聯(lián)用策略的有效性：在動物模型中，與單藥相比，A2AR和CD73雙阻斷確實可以進一步控制腫瘤生長和轉移[37]?？傊佘?A2AR信號通路阻斷的抗腫瘤效應在臨床前研究中得到廣泛證據(jù)支持，推動了該策略向臨床應用的轉化。

4 腺苷/A2AR通路阻斷在抗腫瘤治療中的初步探索

目前已有多種用于腫瘤治療的A2AR拮抗劑在I期-II期臨床試驗中，包括CPI-444（Ciforadenant）、MK-3814A（Preladenant）、AZD4635、AB928（Etrumadenant）、TT-10、NIR178（Taminadenant）、DZD2269、EOS100850（Inupadenant）、CS3005、PBF-999、INCB106385（表1）。其中AB928和INCB106385為A2AR和A2BR雙阻斷劑。初步試驗結果表明A2AR拮抗劑在腫瘤患者中耐受良好。研究[38-40]報道CPI-444單藥或聯(lián)合Atezolizumab [程序性死亡配體1（programmed cell death ligand 1, PD-L1）單抗] 常見治療相關不良反應（treatment-related adverse events, TRAEs）有疲倦、惡心、皮膚瘙癢等，3級-4級不良反應少見。AZD4635同樣安全性良好[41]。NIR178單藥用于晚期NSCLC的研究中，常見TRAEs為惡心、疲倦、胸悶等；3級不良反應有肺炎（8%）和惡心（3%）[42]。AB928在治療前列腺癌的I期/IB期臨床試驗中，最常見TRAEs為1級疲倦和惡心，44例患者中有1例發(fā)生3級腎損傷[43]。EOS100850的常見不良反應有惡心、疲倦、嘔吐等，沒有觀察到3級及以上TRAEs或劑量限制性毒性[44]。

表1 A2AR拮抗劑臨床試驗概覽Tab 1 Clinical trials related to A2AR antagonists

表1 A2AR拮抗劑臨床試驗概覽（續(xù)表）Tab 1 Clinical trials related to A2AR antagonists (Continued)

A2AR拮抗劑的安全性已經(jīng)在臨床試驗初步結果中得到證明，但在腫瘤治療療效方面，A2AR拮抗劑單藥使用療效有限，與其他治療方式聯(lián)合應用似乎效果更優(yōu)（表1）。A2AR拮抗劑的聯(lián)用策略多種多樣，當前多項臨床試驗中，A2AR拮抗劑可與放化療、PD-1/PD-L1單抗、CD73單抗、靶向藥物等聯(lián)用，各聯(lián)用策略的優(yōu)劣有待研究數(shù)據(jù)的進一步發(fā)表。值得注意的是，A2AR拮抗劑有可能逆轉既往免疫治療耐藥的情況。CPI-444單藥或聯(lián)合Atezolizumab治療復發(fā)性腎細胞癌的臨床試驗（NCT02655822）納入的是前線經(jīng)PD-1/PD-L1單抗治療后進展的患者，初步結果報告CPI-444單藥治療組的33例患者中有1例部分緩解（partial response, PR），聯(lián)合治療組35例患者中有4例PR[38]。非小細胞肺癌患者應用AB928聯(lián)合化療/免疫治療的試驗中（NCT03846310），7例患者中有3例確認PR，其中包括1例前線Ipilimumab（CTLA-4單抗）聯(lián)合Nivolumab（PD-1單抗）治療后進展的患者[45]。雖然初步結果的樣本量和有效患者的數(shù)目較少，但A2AR拮抗劑為改善免疫檢查點抑制劑耐藥帶來了希望。

5 腺苷通路相關生物標志物

現(xiàn)有的臨床前及臨床研究已證實了A2AR拮抗劑的安全性和有效性，但在臨床試驗中其療效似乎低于預期。因此，仍需探索相應的生物標志物來識別最可能獲益的人群。例如篩選出TME中腺苷水平較高的患者，有針對性地加用A2AR拮抗劑從而獲得最佳療效。目前而言難以直接對腺苷水平進行測定，因為腺苷代謝快，在血漿中其半衰期僅10 s左右[4]，因此無法通過直接檢測腺苷來作為生物標志物。腺苷相關的基因表達譜與腫瘤中腺苷水平存在一定的相關性，可能作為潛在的檢測指標。有研究[38]發(fā)現(xiàn)與髓系細胞生物學和炎癥相關的一組基因表達情況與腺苷水平呈正相關，并最終鎖定了8個基因（CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL6、CXCL8、PTGS2和IL-1β）作為“腺苷標簽”（adenosine signature,AdenoSig）。在30例應用CPI-444單藥或聯(lián)合Atezolizumab治療的腎細胞癌患者中，AdenoSig高表達與更長的無進展生存期相關[38]。另有一些其他基因系列提示可指導腫瘤免疫治療的預后[47]，但目前尚無統(tǒng)一的結論。

CD39和CD73或許也可作相關的生物標志物。CD39既在浸潤的免疫細胞上表達，也在肺癌、黑色素瘤、胰腺癌、淋巴瘤等多種腫瘤細胞上表達[48-50]。研究[51-53]發(fā)現(xiàn)CD39高表達與不良預后相關。同CD39一樣，CD73也在腫瘤細胞和浸潤的免疫細胞上表達。在乳腺癌、肺癌、卵巢癌、腎癌、胃癌、前列腺癌、膀胱癌、宮頸癌、黑色素瘤、頭頸部腫瘤等多種腫瘤類型中均發(fā)現(xiàn)TME中CD73的表達水平與預后相關[54]。多數(shù)研究一致報道CD73高表達提示腫瘤預后不良，這與腺苷的免疫抑制作用相符合。然而也有部分研究[55-58]報道CD73高表達提示更好的臨床結局，尤其是在疾病早期，這些研究涉及尿路上皮癌、子宮內(nèi)膜癌及乳腺癌。一種可能的解釋是CD73介導生成的腺苷可作為血管內(nèi)皮的屏障從而抑制轉移的發(fā)生[54]。但CD39和CD73能否作為預測A2AR拮抗劑療效的生物標志物，目前尚無充分研究證據(jù)。

6 前景展望

隨著我們對TME的認識越來越深入，腫瘤免疫治療的應用將越來越廣泛和細化。在未來的幾年里，阻斷腺苷途徑以及其他潛在分子途徑的藥物可能單獨使用或與傳統(tǒng)療法聯(lián)合使用，將成為癌癥治療方法的重要組成部分。如何發(fā)掘生物標志物預測治療效果、篩選患者人群，如何實現(xiàn)A2AR拮抗劑的最佳聯(lián)用方式，仍需要進行更多探索工作，以期實現(xiàn)最優(yōu)的診療策略，進一步改善癌癥患者的臨床結局。