羅哌卡因對宮頸癌細胞C-33A生長、侵襲和間質轉換的影響及裸鼠移植瘤生長的調節(jié)

陳洪霞 葉元梅 何光權 任普圣 康道林 趙蕾 楊玉萍

(1川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院麻醉科，四川 南充 637000；2蘭州大學第一醫(yī)院麻醉科；3南充市中心醫(yī)院麻醉科；4南充市西充縣婦幼保健院婦產(chǎn)科)

宮頸癌是全世界女性中第四大最常見的腫瘤類型，也是癌癥相關死亡的第四大主要原因〔1〕。人乳頭狀瘤病毒(HPV)感染是宮頸癌的主要原因之一，通過細胞學篩查和HPV DNA檢測可以降低宮頸癌的發(fā)病率和死亡率，但宮頸癌許多患者在晚期在才被診斷，這些患者的預后極差，5年生存率不到40%〔2〕。宮頸癌的治療包括手術切除，放射治療及化學療法，但是，沒有標準療法可用于轉移性宮頸癌患者〔3〕。近年來研究〔4，5〕發(fā)現(xiàn)，在手術過程中使用的麻醉藥物可以在一定程度上抑制癌癥的復發(fā)，因此探討麻醉藥對宮頸癌細胞的影響具有重要意義。

羅哌卡因是一種氨基酰胺長效局部麻醉藥，臨床上常用于腹腔內噴灑與切口浸潤可明顯減輕宮頸癌患者術后疼痛〔6〕。越來越來多研究表明，羅哌卡因對腫瘤具有抑制作用，如通過調控Na+通道的開放明顯抑制結腸癌細胞的侵襲和轉移能力〔7〕，抑制乳腺癌細胞株MDA-MB-231增殖能力〔8〕。但羅哌卡因對宮頸癌具體作用機制還未見報道，本文旨在探究羅哌卡因對宮頸癌細胞C-33A生長、侵襲和間質轉換的影響及裸鼠移植瘤生長的影響。

1 材料和方法

1.1試驗藥物和主要試劑 羅哌卡因(S68348)購自上海源葉生物科技有限公司，化學式：C17H26N2O，分子量：274.4 D，純度≥98%；RPMI1640培養(yǎng)基(61870-127)、青霉素-鏈霉素溶液(15140-122)、胎牛血清(26400-036)和胰蛋白酶(25200-056)均購自美國Gibco 公司；細胞計數(shù)試劑(CCK)-8試劑盒(G021-1-1)、脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記(TUNEL)細胞凋亡原位檢測試劑盒(G002-1-2)購自南京建成生物工程研究所；5-乙炔基-2′脫氧尿嘧啶核苷(EDU)細胞增殖檢測試劑盒(C0085L)、二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒(P0012)和辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(A0208)均購自上海碧云天生物技術研究所；Transwell(353090)購自美國BD公司；兔抗單克隆抗體纖維黏連蛋白(Fibronectin,ab2413)、波形蛋白(Vimentin，ab194719)和GAPDH(ab37168)均購自英國Abcam公司。

1.2細胞培養(yǎng) 人子宮頸癌C-33A細胞株來源于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，置于37℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中用高糖RMPI1640培養(yǎng)基(含10 %胎牛血清和1 %青霉素-鏈霉素)培養(yǎng)，每3 d更換1次培養(yǎng)基，收集細胞時用0.25%胰蛋白酶消化，試驗選用對數(shù)生長期細胞。

1.3CCK-8 選用對數(shù)生長期細胞，將宮頸癌C-33A細胞以100 μl/孔接種于96孔板中孵育24 h，加入不同劑量羅哌卡因(0.010、0.025、0.050、0.100、0.250、0.500、1.000、2.500、5.000 mmol/L)繼續(xù)培養(yǎng)24 h，每孔加入10 μl CCK-8溶液避光孵育4 h，用酶標儀在450 nm處測定各孔的OD值并計算細胞存活率，根據(jù)細胞存活率計算IC50值。

1.4細胞處理及分組 根據(jù)方法1.3結果，選擇1 mmol/L劑量羅哌卡因為最高劑量，數(shù)遞減劑量確定給藥梯度為：1.00、0.50、0.25 mmol/L。將細胞隨機分為4組：羅哌卡因0.00 mmol/L組、羅哌卡因0.25 mmol/L組、羅哌卡因0.50 mmol/L組和羅哌卡因1.00 mmol/L組。

1.5EDU染色 取對數(shù)生長期的C-33A細胞以每孔1×105接種于96孔板，培養(yǎng)過夜，在每孔中加入100 μl含50 μmol/L EDU培養(yǎng)基孵育2 h，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次，每次5 min。將細胞進行固定和染色后用熒光顯微鏡進行觀測。

1.6Transwell檢測細胞侵襲 將各組C-33A細胞接種至Transwell上室中，于下室中加入無血清培養(yǎng)基，置于37℃培養(yǎng)箱中孵育24 h，取出Transwell用PBS沖洗2次，5% 戊二醛固定，0.1%結晶紫染色0.5 h后于熒光顯微鏡下觀測，隨機選擇5個視野對細胞進行計數(shù)，侵襲細胞數(shù)為每視野的平均細胞數(shù)。

1.7上皮間質轉化(EMT)形態(tài)學觀察 取對數(shù)生長期各組細胞，將各組細胞置于倒置顯微鏡中以觀察EMT形態(tài)的改變。

1.8Western印跡 取各組對數(shù)生長期C-33A細胞，加入200 μl含0.01 mol/L 苯甲基磺酰氟(PMSF)的放射免疫沉淀試驗(RIPA)裂解液提取總蛋白，并用BCA試劑盒測定蛋白質含量。取等量蛋白質樣品，100℃變性5 min后用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離并轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，在4℃條件下加入Vimentin、Fibronectin(1∶1 000)并孵育過夜，TBST清洗3次，每次5 min，加入辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(1∶10 000)室溫下繼續(xù)孵育2 h，TBST清洗3次，每次5 min，最后加入電化學發(fā)光(ECL)液，曝光處理。ImageJ軟件統(tǒng)計灰度值。以目的條帶灰度值/GAPDH灰度值表示蛋白表達水平。

1.9裸鼠移植瘤模型的建立 10只雄性無特定病原體(SPF)級別Balb/c裸鼠，5周齡，體重(16±2)g購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXK(京)2019-0009。參照周慧等〔9〕方法，建立宮頸癌裸鼠移植瘤模型，取對數(shù)生長期C-33A細胞，調整細胞濃度為1×107，于裸鼠右側腋窩處皮下注射0.2 ml細胞懸液。18 d后瘤體直徑>0.5 cm為造模成功。將裸鼠隨機分為2組：羅哌卡因0.0 mg/kg組和羅哌卡因0.3 mg/kg組〔10〕。分別灌胃給藥羅哌卡因0.0、0.3 mg/kg每天1次，連續(xù)30 d。末次給藥24 h后處死所有大鼠，稱取腫瘤重量。取各組裸鼠腫瘤組織用4%多聚甲醛溶液固定，石蠟包埋切片，切片厚度為5 μm。

1.10TUNEL染色 將裸鼠腫瘤組織切片用二甲苯浸洗2次脫蠟，每次5 min，梯度乙醇脫水。用蛋白酶K工作液在37℃下封閉20 min，PBS清洗2次。在每個切片樣本上加入50 μl TUNEL反應液，37℃避光孵育60 min。用DAPI復染10 min后于熒光顯微鏡下觀察，隨機選取5個視野，每個視野分別計數(shù)凋亡細胞數(shù)和細胞總數(shù)，細胞凋亡率=凋亡細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%。

1.11免疫組化 取各組裸鼠腫瘤組織，常規(guī)石蠟包埋制成厚度約4 μm的切片，按免疫組化檢測試劑盒說明書進行免疫組化染色，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒顯色，蘇木素復染，鹽酸酒精分色。使用Image-Pro Plus6.0圖像分析系統(tǒng)分析Vimentin陽性細胞占比，陽性細胞率=陽性細胞數(shù)目/總細胞計數(shù)×100%。

1.12統(tǒng)計學分析 使用GraphPad Prism5軟件進行t檢驗、方差分析。

2 結 果

2.1羅哌卡因降低C-33A細胞細胞存活率 通過CCK-8法檢測不同劑量羅哌卡因對C-33A細胞細胞存活率的影響，與0.010 mmol/L劑量〔(100.00±4.34)%〕比較，0.500、1.000、2.500、5.000 mmol/L劑量羅哌卡因細胞存活率顯著降低〔(54.76±7.99)%、(30.03±6.07)%、(17.77±5.16)%、(9.31±8.25)%，均P<0.05〕，0.025、0.050、0.100、0.250 mmol/L劑量羅哌卡因細胞存活率無明顯變化〔(99.11±5.13)%、(94.09±4.22)%、(90.78±5.67)%、(84.22±6.12)%，均P>0.05〕。通過計算得出羅哌卡因對C-33A細胞細胞存活率的IC50值為1.094。

2.2羅哌卡因降低C-33A細胞增殖EDU陽性細胞數(shù) 通過EDU染色檢測各組細胞增殖結果如圖1所示，與羅哌卡因0.00 mmol/L組〔(93.31±7.67)個〕相比較，羅哌卡因0.25 mmol/L組EDU陽性細胞數(shù)差異無統(tǒng)計學意義〔(88.22±9.35)個,P>0.05〕，羅哌卡因0.50、1.00 mmol/L組EDU陽性細胞數(shù)顯著降低〔(34.13±6.73)個、(12.98±8.41)個，均P<0.05〕。

2.3羅哌卡因抑制C-33A細胞侵襲 通過Transwell檢測各組細胞侵襲結果如圖2所示，與羅哌卡因0.00 mmol/L組〔(116.31±17.13)個〕比較，羅哌卡因0.25 mmol/L組侵襲細胞數(shù)差異無統(tǒng)計學意義〔(107.96±12.65)個，P>0.05〕，羅哌卡因0.50、1.00 mmol/L組侵襲細胞數(shù)顯著降低〔(39.77±14.18)個、(16.97±9.56)個，均P<0.05〕。

2.4羅哌卡因抑制C-33A細胞EMT，下調Vimentin、Fibronectin蛋白表達水平 羅哌卡因0.00 mmol/L組較羅哌卡因0.50、1.00 mmol/L組細胞呈連接松散的類圓或紡錘體樣，發(fā)生了典型的EMT，見圖3。與羅哌卡因0.00 mmol/L組比較，羅哌卡因0.25 mmol/L組Vimentin、Fibronectin蛋白水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，羅哌卡因0.50、1.00 mmol/L組Vimentin、Fibronectin蛋白水平顯著降低(均P<0.05)。見圖4，表1。

圖1 各組細胞增殖(EDU染色，×200)

圖2 Transwell檢測各組細胞侵襲(結晶紫染色，×200)

圖3 熒光顯微鏡下觀測各組細胞上皮間質轉化(×200)

1～4：羅哌卡因0.00 mmol/L組、羅哌卡因0.25 mmol/L組、羅哌卡因0.50 mmol/L組、羅哌卡因1.00 mmol/L組圖4 Western印跡檢測Vimentin、Fibronectin蛋白表達水平

表1 羅哌卡因對C-33A細胞EMT和Vimentin、Fibronectin蛋白表達水平的影響

2.5羅哌卡因對裸鼠移植瘤的影響 與羅哌卡因0.0 mg/kg組比較，羅哌卡因0.3 mg/kg組第25、30天腫瘤體積顯著變小(P<0.05)；與羅哌卡因0.0 mg/kg組比較，羅哌卡因0.3 mg/kg組腫瘤重量顯著降低、細胞凋亡率顯著升高、Vimentin陽性細胞數(shù)顯著降低(均P<0.05)。見圖5、圖6、表2、表3。

圖5 羅哌卡因對裸鼠移植瘤的影響

圖6 TUNEL染色檢測細胞凋亡(×200)及免疫組化檢測Vimentin陽性細胞數(shù)(×200)

表2 羅哌卡因對裸鼠移植瘤腫瘤體積的影響

表3 羅哌卡因對裸鼠移植瘤腫瘤重量、細胞凋亡率和Vimentin陽性細胞數(shù)的影響

3 討 論

宮頸癌是婦科腫瘤中發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一，嚴重威脅著女性生命健康〔11〕。既能有效鎮(zhèn)痛又能抑制腫瘤細胞復發(fā)轉移的藥物是臨床上麻醉與鎮(zhèn)痛所追求的理想目標。羅哌卡因作為長效局麻藥物，因毒性較低，起效快，在宮頸癌手術中的生物安全性已得到認可。本研究結果提示羅哌卡因可抑制宮頸癌裸鼠移植瘤模型腫瘤的生長。

癌細胞過度增殖是宮頸癌病灶內重要的生物學特征，即抑制癌細胞增殖是治療宮頸癌的必要方式。已有研究表明，局部麻醉藥可抑制癌細胞的增殖，誘導癌細胞凋亡，避免全麻藥物對機體免疫功能的損傷〔12〕。夏明等〔13〕研究發(fā)現(xiàn)羅哌卡因通過下調(TCF)-4和beta-catenin蛋白表達抑制人乳腺癌MCF-7細胞增殖。Bundscherer等〔14〕研究發(fā)現(xiàn)高濃度的羅哌卡因對結腸癌細胞顯示出抗增殖能力。本研究發(fā)現(xiàn)，羅哌卡因具有降低C-33A細胞EDU陽性細胞數(shù)的作用。提示羅哌卡因抑制C-33A細胞增殖。

侵襲是所有惡性腫瘤的特征性生物學行為，關系著疾病的發(fā)展和預后。盡管宮頸癌有相對成熟的手術、放療和化療治療方案，但侵襲和轉移仍是中晚期宮頸癌治療失敗的主要原因。Vogelaar等〔15〕研究發(fā)現(xiàn)羅哌卡因可抑制結腸癌細胞侵襲和遷移。Piegeler等〔16〕研究發(fā)現(xiàn)羅哌卡因通過阻斷蛋白激酶B(Akt)和黏著斑激酶的激活來抑制腫瘤壞死因子(TNF)-α誘導的肺腺癌細胞侵襲。本研究發(fā)現(xiàn)，羅哌卡因具有降低C-33A細胞侵襲細胞數(shù)的作用。提示羅哌卡因抑制C-33A細胞侵襲。

EMT是上皮表型細胞轉變?yōu)殚g質表型細胞的過程，EMT通過與基底膜相互作用，使間充質細胞處于更多的運動狀態(tài)，升高間充質細胞的遷移能力、侵襲性和提高對細胞凋亡的抗性〔17〕。已有研究表明EMT可促進宮頸癌細胞的遷移、侵襲，進而促進腫瘤的轉移，影響患者的預后〔18〕。EMT的主要特點是上皮細胞標志蛋白E-Cadherin表達的降低，和間充質細胞標志蛋白N-Cadherin及Vimentin表達的升高〔19〕。Fibronectin是間充質細胞標志物，為細胞外基質糖蛋白，對細胞黏附、遷移和生長具有重要的調控作用，在宮頸癌中表現(xiàn)為表達上調〔20〕。本研究發(fā)現(xiàn)，羅哌卡因具有下調C-33A細胞Vimentin、Fibronectin蛋白表達水平和降低裸鼠移植瘤模型Vimentin陽性細胞數(shù)的作用。提示羅哌卡因抑制宮頸癌細胞EMT。