楊旭東 石 杰 楊驕霞 王桂云 宋高臣 張 杰*

隨著生活水平的提高，肥胖的發(fā)病率急劇增高，肥胖導(dǎo)致的代謝紊亂進(jìn)一步引起的冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、糖尿病、動脈粥樣硬化、脂代謝紊亂等疾病增多[1]。脂肪組織不僅是重要的能量儲存庫，也是重要的內(nèi)分泌器官，因此控制脂肪細(xì)胞的數(shù)目，抑制脂肪細(xì)胞過度分化，誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞凋亡成為治療相關(guān)疾病的靶點。食用海藻羊棲菜隸屬于褐藻門、馬尾藻屬。羊棲菜多糖（sargassum fusiforme polysaccha- ride,SFPS）是羊棲菜主要成分之一，研究發(fā)現(xiàn)SFPS具有降血糖、降血脂、抗腫瘤、抗衰老、抗凝血、抗疲勞等作用[2-4]，但SFPS 對脂肪細(xì)胞增殖活性的影響及其機制未見報道。本研究就羊棲菜中多糖成分SFPS 對3T3-L1 前脂肪細(xì)胞的抑制作用進(jìn)行分析，并初步探討其作用機制，為SFPS 進(jìn)一步應(yīng)用提供一定的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

細(xì)胞株：3T3-L1 前脂肪細(xì)胞購買于美國ATCC公司，在液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

藥品及試劑：DMEM 高糖培養(yǎng)液、Trizol 和胰蛋白酶購買于美國Gibco 公司，MTT 試劑盒購買于索萊寶有限公司；核苷酸引物購買于上海生工生物技術(shù)有限公司；Hoechst33258 試劑盒購買于百浩生物科技有限公司。

儀器：CO2恒溫培養(yǎng)箱為德國Thermo 公司，酶標(biāo)儀為美國Biotek 公司，倒置顯微鏡為德國Leica公司，凝膠成像系統(tǒng)為美國Bio-Rad 公司。

1.2 方法

1.2.1SFPS的制備用水煮醇沉法提取羊棲菜粗多糖[5]，200 目粉碎羊棲菜，水煮3 次，95%乙醇沉淀，得到深褐色粗多糖，Sevag 法去除蛋白成分，經(jīng)過SephadexG200 凝膠柱雙蒸水洗脫純化。苯酚-硫酸法測定多糖含量，測得提取的多糖含量為55.13%。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)根據(jù)參考文獻(xiàn)[6]，3T3-L1 前脂肪細(xì)胞37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)于DMEM 高糖培養(yǎng)基（100 mg/L鏈霉素、100 IU/L 青霉素、10%胎牛血清）。

1.2.3MTT實驗對數(shù)生長期3T3-L1 前脂肪細(xì)胞以2×104/ml 的濃度接種于96 孔板，培養(yǎng)12 h 后，將細(xì)胞分為對照組和不同劑量SFPS 組，對照組加入細(xì)胞培養(yǎng)液，不同劑量SFPS 組分別加入400、600、800 mg/L 的SFPS 細(xì)胞培養(yǎng)液，每組6 個平行孔。繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h 后，各組細(xì)胞加入5 g/L MTT（10 μl/孔），培養(yǎng)4 h 后，棄上清，每孔加入150 μl二甲基亞砜（DMSO），輕微振蕩15 min，完全溶解結(jié)晶物。酶標(biāo)儀測定490 nm 處光密度值（OD）值，計算細(xì)胞相對活力。細(xì)胞相對活力（%）＝實驗組 OD 值／對照組OD 值×100%。

1.2.4 細(xì)胞凋亡率的測定3T3-L1 前脂肪細(xì)胞以5×104/ml 的濃度接種于24 孔板，培養(yǎng)24 h 后，每孔加入不同濃度的SFPS，每組6 個復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，各組細(xì)胞吸棄培養(yǎng)液，加入固定液4 ℃固定10 min，吸棄固定液，磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗2 遍，加入5 mg/L Hoechst 33258 染色液37 ℃染色15 min，吸棄染色液，PBS 沖洗2 遍。熒光顯微鏡下觀察凋亡細(xì)胞，熒光標(biāo)記的凋亡細(xì)胞呈藍(lán)色深染。凋亡率（%）=[凋亡細(xì)胞/（凋亡細(xì)胞+正常細(xì)胞）]×100%。

1.2.5 實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）測定Bcl-2、Bax 和Caspase-3 表達(dá)各組細(xì)胞分別加入0、400、600、800 mg/L 的SFPS，每組6 個復(fù)孔，培養(yǎng)24 h 后，吸棄細(xì)胞培養(yǎng)液后清洗細(xì)胞，提取細(xì)胞RNA。按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作，提取各組RNA 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。PCR 反應(yīng)條件，95 ℃預(yù)變性30 s，進(jìn)入PCR 循環(huán)，95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，共35 個循環(huán)。β-actin 為內(nèi)參基因，計算Bcl-2/β-actin、Bax/β-actin 和Caspase-3/β-actin 的灰度比值為目的基因mRNA 相對表達(dá)量。Bcl-2、Bax 和Caspase-3 的引物序列見表1。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 18.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料以±s表示，組間差異比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD 檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SFPS 對3T3-L1 前脂肪細(xì)胞活力的影響

SFPS 分別處理3T3-L1 前脂肪細(xì)胞24 h、48 h和72 h 后，MTT 法測定細(xì)胞活力。與對照組比較，SFPS 處理3T3-L1 細(xì)胞24 h 和48 h，SFPS 600 mg/L組和SFPS 800 mg/L 組細(xì)胞活力顯著降低，且SFPS 800 mg/L 組細(xì)胞活力明顯低于其他各組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與對照組比較，SFPS 處理3T3-L1 前脂肪細(xì)胞72 h 后，SFPS 400 mg/L 組、SFPS 600 mg/L 組和SFPS 800 mg/L 組細(xì)胞活力顯著降低（P＜0.05），且SFPS 800 mg/L 組細(xì)胞活力明顯低于其他各組（P＜0.05）。見表1。

表1 Bcl-2、Bax 和Caspase-3 的引物序列

表1 SFPS 對3T3-L1 前脂肪細(xì)胞活力的影響(n=6,±s)

表1 SFPS 對3T3-L1 前脂肪細(xì)胞活力的影響(n=6,±s)

注：與對照組比較，aP＜0.05；與SFPS 400 mg/L 組比較，bP＜0.05；與SFPS 600 mg/L 組比較，cP＜0.05

組別 細(xì)胞相對活力(%) 24 h 48 h 72 h 對照組 SFPS 400 mg/L 組 SFPS 600 mg/L 組 SFPS 800 mg/L 組 100.00 98.34±3.51 100.00 97.45±3.07 93.58±4.72ab 86.47±3.94abc 91.76±4.43ab 82.16±3.47abc 100.00 84.10±2.83a 78.75±3.68ab 72.34±2.61abc

2.2 SFPS 對3T3-L1 前脂肪細(xì)胞凋亡的影響

不同濃度的SFPS 作用于3T3-L1 前脂肪細(xì)胞48 h 后，熒光顯微鏡下可見藍(lán)色深染體積縮小的凋亡細(xì)胞。SFPS 400、600、800 mg/L 組凋亡率分別為2.92%，6.34%，10.27%；對照組細(xì)胞凋亡率為1.35%。不同劑量SFPS 組與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1～4。

圖1 對照組凋亡情況

圖2 SFPS 400 mg/L 組凋亡情況

圖3 SFPS 600 mg/L 組凋亡情況

圖4 SFPS 800 mg/L 組凋亡情況

2.3 SFPS 對各組細(xì)胞中Bcl-2、Bax 和Caspase-3 mRNA 表達(dá)的影響

與對照組比較，SFPS 400 mg/L 組、SFPS 600 mg/L組和SFPS 800 mg/L 組Bcl-2 mRNA 表達(dá)顯著降低（P＜0.05），且SFPS 800 mg/L 組的Bcl-2 mRNA 表達(dá)明顯低于其他各組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與對照組比較，SFPS 400 mg/L 組、SFPS 600 mg/L組和SFPS 800 mg/L 組Bax 和Caspase-3 mRNA 的表達(dá)顯著增加（P＜0.05），且SFPS 800 mg/L 組的Bax和Caspase-3 mRNA 表達(dá)明顯高于其他各組（P＜0.05）。見表2。

表2 SFPS 對各組細(xì)胞中Bcl-2、Bax 和Caspase-3 mRNA表達(dá)的影響(n=6,±s)

表2 SFPS 對各組細(xì)胞中Bcl-2、Bax 和Caspase-3 mRNA表達(dá)的影響(n=6,±s)

注：與對照組比較，aP＜0.05；與SFPS 400 mg/L 組比較，bP＜0.05；與SFPS 600 mg/L 組比較，cP＜0.05

組別 Bcl-2/β-actin Bax/β-actin Caspase-3/β-actin對照組 SFPS 400 mg/L 組SFPS 600 mg/L 組SFPS 800 mg/L 組0.58±0.04 0.43±0.05a 0.36±0.03ab 0.21±0.01abc 0.24±0.01 0.12±0.01 0.37±0.03a 0.46±0.03ab 0.27±0.01a 0.36±0.03ab 0.59±0.04abc 0.61±0.05abc

3 討論

SFPS 是從馬尾藻科海藻羊棲菜中提取的水溶性多糖，主要由羊棲菜多糖硫酸酯、褐藻淀粉、褐藻酸和褐藻膠等組成。SFPS 具有抗菌、抑制腫瘤、增強免疫力和降脂等作用，本課題組前期實驗也證實SFPS可降低3T3-L1 前脂肪細(xì)胞中游離脂肪酸和三酰甘油水平[7]。肥胖、糖脂代謝紊亂及脂肪細(xì)胞的過度增殖與一系列慢性疾病密切相關(guān)[8-9]。因此，本實驗進(jìn)一步研究SFPS 對3T3-L1 前脂肪細(xì)胞增殖的抑制作用，并初步探討其作用機制。脂肪細(xì)胞數(shù)量增加是肥胖的原因之一，脂肪細(xì)胞數(shù)量受細(xì)胞凋亡和增殖等多方調(diào)控，在其病理生理過程中，細(xì)胞凋亡發(fā)揮重要的作用。細(xì)胞凋亡又稱為程序性細(xì)胞死亡，是在精密調(diào)節(jié)下細(xì)胞自主有序的死亡過程，是一個主動過程，涉及一系列基因調(diào)控。本研究結(jié)果顯示，與對照組比較，600、800 mg/L SFPS 可顯著降低3T3-L1 前脂肪細(xì)胞增殖活力，顯著升高其凋亡率，表明SFPS 可通過誘導(dǎo)3T3-L1前脂肪細(xì)胞凋亡，從而抑制增殖。

真核細(xì)胞的凋亡分為內(nèi)源性、外源性和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑，Caspase 蛋白酶家族在此過程中發(fā)揮重要作用，活化Caspase 家族，引起級聯(lián)反應(yīng)，從而進(jìn)入凋亡程序。Caspase 家族中的Caspase-3 是激活內(nèi)外源凋亡通路的啟動因子，活化的Caspase-3 激活下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，啟動凋亡。Bcl-2 家族是重要的調(diào)控凋亡基因家族，包括促凋亡基因Bax 和抑凋亡基因bcl-2[10]。Bcl-2 與Bax 是一對作用相互拮抗的同源性蛋白調(diào)控因子，可共同調(diào)控Caspase-3 活性，誘導(dǎo)或抑制細(xì)胞凋亡[11-12]。Bax 過表達(dá)時，通過同源二聚體Bax/Bax 增多，異源二聚體Bax/Bcl-2 比率上升[13-14]，激活Caspase-3 活性，發(fā)揮促凋亡作用，Bax 是活化Caspase-3 的關(guān)鍵蛋白調(diào)節(jié)因子?？沟蛲龌駼cl-2可抑制Bax 的促凋亡作用，Bcl-2 與Bax 的比率決定其作用，如果異源二聚體Bcl-2/Bax 比率上升，則抑制細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示，與對照組比較，SFPS各劑量組能降低3T3-L1 前脂肪細(xì)胞中Bcl-2 的表達(dá)量，升高3T3-L1 前脂肪細(xì)胞中Bax、Caspase-3 的表達(dá)量，提示SFPS 通過改變Bcl-2 和Bax 相對比率，激活Caspase-3，引起級聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)3T3-L1 前脂肪細(xì)胞凋亡。

綜上所述，SFPS 能夠抑制3T3-L1 前脂肪細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡，并可以明顯下調(diào)Bcl-2 基因的表達(dá)，上調(diào)Bax 和Caspase-3 基因的表達(dá)。體外實驗結(jié)果提示，SFPS 抑制3T3-L1 前脂肪細(xì)胞增殖的分子機制可能與通過調(diào)控Bcl-2、Bax 和Caspase-3 表達(dá)，誘導(dǎo)啟動細(xì)胞凋亡有關(guān)，為SFPS 進(jìn)一步開發(fā)提供了理論依據(jù)。