劉靖華 劉艷平 陳明皓 張秀花

熱淋清片為貴州苗藥頭花蓼單方制劑，具有清熱解毒、利尿通淋功效，用于濕熱蘊(yùn)結(jié)、小便黃赤、淋漓澀痛之癥，尿路感染、腎盂腎炎見(jiàn)上述證候者[1-4]，頭花蓼提取物具有明顯抗菌活性[5-9]，為治療泌尿系統(tǒng)感染的有效藥物。為消除藥物抑菌性，增加污染菌檢出效率，建立了熱清淋片微生物限度檢查稀釋法。該方法操作簡(jiǎn)單，重現(xiàn)性好，可供其他實(shí)驗(yàn)室參考使用。

1 儀器與材料

1.1 樣品

市售樣品1，批號(hào)：20200501、20200301；市售樣品2，批號(hào)：190801。

1.2 培養(yǎng)基

胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，批號(hào)：210829；胰酪大豆胨液體瓊脂培養(yǎng)基，批號(hào)：210620；沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，批號(hào)：210626；均由北京陸橋技術(shù)股份有限公司提供。

1.3 稀釋液

pH7.0 無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，批號(hào)：210622，由北京陸橋技術(shù)股份有限公司提供。

1.4 菌株

金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]、枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63501]、銅綠假單胞菌[CMCC（B）10104]、白色念珠菌[CMCC（F）98001]、黑曲霉[CMCC（F）98003]、大腸埃希菌[CMCC（B）44102]，均由中國(guó)食品藥品檢定研究院生物制品鑒定所提供。

1.5 儀器設(shè)備

電子天平（JE120，上海浦春計(jì)量?jī)x器有限公司）、立式壓力蒸氣滅菌器（LDZX-50KBS，上海申安醫(yī)療器械廠）、生物安全柜（山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司）、細(xì)菌培養(yǎng)箱（KB240，德國(guó)BINDER）。

2 方法與結(jié)果

2.1 菌液制備

按要求[10-11]將“1.4”項(xiàng)下菌株制成103cfu/ml的菌液備用。

2.2 供試液制備

取“1.1”項(xiàng)下樣品10 g，加稀釋液至100 ml，制成1∶10 供試液備用；取此供試液3 份，每份2 ml，分別加稀釋液2、8、14 ml，制成1∶20、1∶50、1∶80 的供試液備用。

2.3 試驗(yàn)環(huán)境

在D 級(jí)背景下的A 級(jí)單向流空氣的生物安全柜中進(jìn)行。

2.4 微生物計(jì)數(shù)試驗(yàn)

試驗(yàn)組：取“2.2”項(xiàng)下供試液，加入“2.1”項(xiàng)下試驗(yàn)菌液，混勻，使每毫升供試液中含菌量不大于100 cfu；供試品對(duì)照組：取“2.2”項(xiàng)下供試液，以稀釋液代替菌液同試驗(yàn)組操作；菌液對(duì)照組：以稀釋液代替供試液，按試驗(yàn)組操作加入試驗(yàn)菌。

以上3 組分別取1 ml 注皿，照《中華人民共和國(guó)藥典》2020年版四部通則1105[10]，需氧菌計(jì)數(shù)加入胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，霉菌酵母菌計(jì)數(shù)加入沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)、計(jì)數(shù)，計(jì)算各試驗(yàn)菌回收率。

2.5 結(jié)果判斷

計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)中，平皿法試驗(yàn)組菌落數(shù)減去供試品對(duì)照組菌落數(shù)的值與菌液對(duì)照組菌落數(shù)的比值應(yīng)在0.5～2 范圍內(nèi)。

2.6 微生物計(jì)數(shù)結(jié)果

2.6.1 常規(guī)法熱淋清片對(duì)5 種菌株均具有較強(qiáng)的抑菌作用，除需氧菌計(jì)數(shù)中黑曲霉外，其他各試驗(yàn)菌回收比均小于0.5，常規(guī)法不能消除樣品中抑菌成分，需要進(jìn)行進(jìn)一步試驗(yàn)。見(jiàn)表1。

表1 常規(guī)法試驗(yàn)結(jié)果(n=3)

2.6.2 稀釋法需氧菌計(jì)數(shù)可采用1∶80 供試液。見(jiàn)表2。霉菌酵母菌計(jì)數(shù)可采用1∶50 供試液。見(jiàn)表3。

表2 需氧菌計(jì)數(shù)試驗(yàn)結(jié)果(n=3)

表3 霉菌酵母菌計(jì)數(shù)試驗(yàn)結(jié)果(n=3)

2.7 控制菌檢查

取胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基100、150、200 ml 共3 份，分別加入1∶10 供試液10 ml，以大腸埃希菌為陽(yáng)性對(duì)照，以稀釋液為陰性對(duì)照，照《中華人民共和國(guó)藥典》2020年版四部通則1107[11]，培養(yǎng)、選擇和分離培養(yǎng)、結(jié)果判斷。常規(guī)法可用于控制菌檢查。見(jiàn)表4。

表4 控制菌檢查結(jié)果(n=3)

2.8 微生物限度檢查方法適用性試驗(yàn)

根據(jù)“2.6.1”、“2.6.2”及“2.7”項(xiàng)下確認(rèn)的方法，對(duì)樣品進(jìn)行微生物限度檢驗(yàn)方法適用性試驗(yàn)。3 批樣品5 種菌株回收比均在0.5～2 范圍內(nèi)，陽(yáng)性對(duì)照組檢出陽(yáng)性菌，符合藥典要求。見(jiàn)表5。

表5 方法適用性驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

微生物污染受人、機(jī)、料、法、環(huán)等各個(gè)環(huán)節(jié)的影響，不同生產(chǎn)企業(yè)，因原料產(chǎn)地、生產(chǎn)工藝等不同，應(yīng)分別進(jìn)行微生物限度檢查方法適用性試驗(yàn)[12]。

為確定樣品的抑菌性大小，本試驗(yàn)從常規(guī)法入手，從表1可以看出，熱清淋片具有極強(qiáng)的抑菌性，為確保污染菌的檢出，必須首先消除樣品的抑菌性。稀釋法為經(jīng)典的檢驗(yàn)方法，操作簡(jiǎn)單、二次污染概率低，應(yīng)首選稀釋法進(jìn)行再試驗(yàn)。從表2～3 可以看出，5 種菌株在不同培養(yǎng)基中抑菌性不同，需氧菌計(jì)數(shù)樣品稀釋80 倍，霉菌酵母菌計(jì)數(shù)樣品稀釋50 倍時(shí)，各試驗(yàn)菌回收比均在0.5～2 范圍內(nèi)，表明稀釋法可用于微生物計(jì)數(shù)檢查。

針對(duì)不同菌種，樣品的抑菌性不同。從表4可以看出，熱清淋片對(duì)控制菌并無(wú)抑菌性，常規(guī)法可用于控制菌檢查。

在熱淋清片微生物限度方法驗(yàn)證過(guò)程中，根據(jù)制劑的抑菌特性，建立了有效的驗(yàn)證方法，可保證檢驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確，最大程度確保公眾用藥安全有效。