趙志國,張敏敏,李月,王岱杰,楊國紅,王曉,趙恒強(qiáng)*
(齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院) a.山東省分析測試中心;b.藥學(xué)院,山東 濟(jì)南 250014)
西洋參別名花旗參、洋參、美國人參等,是五加科人參屬多年生草本植物,原產(chǎn)于美國和加拿大,為世界名貴藥材[1]。近年來,我國山東、陜西、東北三省等地均已引種成功,為解決西洋參的藥源開辟了新的途徑。西洋參多糖是西洋參中一類具有特殊生物活性的物質(zhì),在西洋參根中含量達(dá)10%左右,具有明確的抗衰老、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫、調(diào)節(jié)血糖、調(diào)控造血、抗微生物、提高免疫力等作用[2-6]。不同的生物學(xué)活性與多糖的結(jié)構(gòu)存在密切聯(lián)系,而各單糖的種類與比例對進(jìn)一步探究多糖的物理化學(xué)性質(zhì)、結(jié)構(gòu)和構(gòu)效關(guān)系至關(guān)重要[7]。多糖的單糖組成是反映多糖結(jié)構(gòu)和活性的重要參數(shù),對于多糖的結(jié)構(gòu)表征及進(jìn)一步開發(fā)利用具有重要意義。Cheong等[8]采用化學(xué)衍生氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)法測定了西洋參、人參和三七多糖的單糖組成,發(fā)現(xiàn)其均由鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖醛酸、甘露糖、葡萄糖和半乳糖組成,西洋參和人參中阿拉伯糖、半乳糖醛酸、葡萄糖和半乳糖含量高于鼠李糖和甘露糖,而三七中含有較多的葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖。另外,西洋參的主要藥用部位是主根,而蘆頭和參須則往往棄之不用。對西洋參不同藥用部位化學(xué)成分進(jìn)行對比分析,對進(jìn)一步提高西洋參資源利用率具有重要意義。目前為止,有關(guān)西洋參不同部位人參皂苷的對比研究報道較多[9-11],而有關(guān)其單糖組成的對比研究未見報道。
液相色譜法是單糖組成分析較常用的方法[12],但由于單糖的極性較強(qiáng),在普通反相色譜柱上難以保留且沒有紫外吸收,電離響應(yīng)弱,一般需要經(jīng)過衍生化之后再接入紫外檢測器或質(zhì)譜進(jìn)行分析[13-15]。而親水色譜法(hydrophilic interaction liquid chromatography,HILIC)則是以強(qiáng)極性材料為固定相,對水溶性和極性成分具有較好的吸附和分離效果,對糖類成分的分離分析表現(xiàn)良好[16-17]。電噴霧式檢測器(charged aerosol detector,CAD)具有靈敏度高、適合梯度洗脫、特別適合沒有紫外吸收成分的檢測等特點[18-20]。本課題組在前期開展了基于HILIC-CAD技術(shù)的單糖組成分析[21],表現(xiàn)出良好的應(yīng)用潛力。
本研究建立了親水色譜-電霧式檢測器-電噴霧-飛行時間質(zhì)譜(HILIC-CAD-ESI-TOF/MS)測定西洋參多糖的單糖組成的方法,并用于西洋參不同部位單糖組成的對比分析,以期為西洋參的單糖組成分析及不同藥用部位的開發(fā)利用提供方法和數(shù)據(jù)參考。
色譜柱為Waters Xbridge Amide柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)(美國沃特世公司);Bruker Impact II ESI-TOF-MS質(zhì)譜儀(德國布魯克公司);賽默飛世爾Ultimate 3000高效液相色譜儀(美國賽默飛世爾公司);SBL-10DT型恒溫超聲波清洗機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司);TG16-WS臺式高速離心機(jī)(湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司);十萬分之一電子分析天平(德國賽多利斯公司)。
對照品:葡萄糖(批號S10S9I69833)、阿拉伯糖(批號AJ0702FA14)、鼠李糖(批號SJ0715GA13)、果糖(批號S05A6G3)、木糖(批號B02M6W1)、巖藻糖(批號TM0312QB14)、甘露糖(批號AJ0603LA14)、葡萄糖醛酸(批號K14J7S9017)、半乳糖醛酸(批號AJ0603LA14),均購于上海源葉生物科技有限公司(純度大于98%)。乙腈、乙酸銨(瑞典歐森巴克化學(xué)公司,色譜純),95%乙醇(山東禹王實業(yè)有限公司化工分公司,分析純),三氟乙酸(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司,分析純),其余試劑均為分析純,實驗用水為娃哈哈純凈水,西洋參樣品均來自山東文登西洋參種植基地,其中,ZG1-10為主根,LT 1-5為蘆頭,SX1-5為參須。
將西洋參置于真空干燥箱中(60 ℃)烘干,將不同部位分開,粉碎,過篩。準(zhǔn)確稱取0.5 g樣品粉末置于帶塞三角瓶中,加入30 mL純凈水,于超聲提取器中(功率300 W,溫度90 ℃)提取40 min,放冷15 min,離心10 min(6 000 r/min),抽濾,濾液定容至30 mL。采用Sevage法除蛋白,反復(fù)萃取直至無蛋白析出。濾液加適量的95%乙醇,使乙醇的最終濃度為80%,放于冰箱中(12 h),用于沉淀粗多糖,離心15 min(6 000 r/min),上清液倒掉,沉淀物依次經(jīng)95%乙醇、無水乙醇、丙酮、乙醚多次洗滌,之后水浴蒸干,熱水復(fù)溶,再次離心15 min(6 000 r/min),取上清液,備用。
參考文獻(xiàn)[21]的方法并作適當(dāng)修改,吸取700 μL的多糖溶液于水解管中,加入5.0 mol/L的三氟乙酸(trifluoroacetic acid,TFA)溶液700 μL,加蓋密封后超聲(溫度90 ℃,功率300 W)酸解2 h。酸解產(chǎn)物用氮氣吹干并用甲醇多次洗滌,以除去TFA殘留。
分別精密稱取木糖、果糖、葡萄糖、甘露糖、巖藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸對照品適量,各置于1 mL容量瓶中,作為對照品溶液。
Waters Xbridge Amide柱(4.6 mm×250 mm,5 μm,美國沃特世公司),流動相A為乙酸銨水溶液,B為乙腈溶液。洗脫梯度0~31 min,90%~75%B。流速0.8 mL/min;進(jìn)樣量10 μL;柱溫40 °C。CAD檢測參數(shù):氣體源為N2,壓力8.8 kPa,F(xiàn)ilter 2.0 sec,霧化器溫度60 °C?;旌蠈φ掌芳皹悠返腢PLC-CAD色譜圖見圖1。
注:1—鼠李糖; 2—巖藻糖; 3—木糖; 4—阿拉伯糖;5—果糖;6—甘露糖;7—葡萄糖;8—葡萄糖醛酸;9—半乳糖醛酸。圖1 混合對照品和樣品的UPLC-CAD色譜圖Fig.1 UPLC-CAD of the standards and sample
高分辨飛行時間質(zhì)譜電噴霧正、負(fù)離子模式;質(zhì)量掃描范圍m/z100~1 500;干燥氣流速8.0 L/min;干燥氣溫度200 °C;毛細(xì)管電壓2.5 kV;噴霧氣壓0.2 MPa;碰撞能量8.0 eV;傳輸時間300 μs。根據(jù)各化合物在負(fù)離子模式下產(chǎn)生的母離子、子離子的精確分子量信息,結(jié)合對照品和參考文獻(xiàn),分別對其進(jìn)行定性鑒別,結(jié)果見表1。
表1 化合物的ESI-TOF/MS精確質(zhì)量測量結(jié)果Table 1 Accurate mass measurements of compounds obtained using ESI-TOF/MS
MS/MS方法數(shù)據(jù)的分析在Bruker Impact II ESI-TOF-MS質(zhì)譜儀軟件上進(jìn)行處理。實驗數(shù)據(jù)分別采用Excel 2010、SPSS 17.0軟件和Origin 7.5軟件進(jìn)行處理和繪圖分析。
2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢出限
分別吸取配好的9種對照品溶液適量至容量瓶中,充分混勻后稀釋至不同濃度,按1.7項下色譜條件進(jìn)樣分析。以各對照品質(zhì)量濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo)(X),以峰面積的對數(shù)為縱坐標(biāo)(Y),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,結(jié)果見表2。由表2可知,9種成分標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)均大于0.999 0,說明其線性關(guān)系良好。檢出限在0.03~0.13 μg/mL之間,定量限在0.10~0.42 μg/mL之間,說明方法靈敏度較高。
表2 線性關(guān)系考察Table 2 The results of calibration
2.1.2 精密度試驗
取同一供試品溶液,按1.7項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次,測得9種成分的保留時間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為0.24%、0.27%、0.19%、0.24%、0.12%、0.14%、0.08%、0.07%、0.28%,均小于1%;峰面積RSD分別為4.08%、3.00%、2.65%、2.73%、2.63%、2.71%、2.21%、2.53%、2.96%,均小于5%。表明儀器精密度良好。
2.1.3 重復(fù)性試驗
取同一批次多糖樣品,按1.6項下方法制成6份供試品溶液,按1.7項下色譜條件進(jìn)行測定,測得9種成分峰的保留時間RSD分別為0.06%、0.32%、0.16%、0.20%、0.10%、0.06%、0.08%、0.06%、0.28%,均小于1%;峰面積RSD分別為4.30%、3.47%、4.00%、3.85%、3.35%、1.76%、1.43%、1.80%、3.76%,均小于5%。表明方法重復(fù)性良好。
2.1.4 穩(wěn)定性試驗
取同一供試品溶液分別于0、3、6、12、18、24 h按1.7項下色譜條件進(jìn)樣分析,測得9種成分的保留時間RSD分別為0.20%、0.51%、0.27%、0.19%、0.15%、0.20%、0.15%、0.15%、0.09%,均小于1%;峰面積RSD分別為2.46%、3.38%、2.62%、2.17%、1.58%、2.35%、1.15%、3.23%、2.14%,均小于5%。表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。
2.1.5 加樣回收率試驗
精密稱取已知含量的同一批次多糖樣品3份,分別精密加入不同量的鼠李糖、巖藻糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、果糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸對照品適量,按1.4項下方法進(jìn)行水解,并按1.6項下方法制成供試品溶液后,按1.7項下色譜條件進(jìn)行分析檢測,計算加樣回收率(表3),9種成分的加樣回收率在94.17%~107.15%之間,具有較好的方法準(zhǔn)確性。
表3 加樣回收率試驗(n=3)Table 3 Sample recovery test (n=3)
表3(續(xù))
采用本試驗方法對提取的西洋參多糖樣品經(jīng)1.4項下方法水解后,按1.6項下方法制成供試品溶液,根據(jù)1.7項下色譜條件分別測定20批次樣品中9種成分的含量。西洋參各部位(主根、蘆頭、參須)多糖水解產(chǎn)物均由鼠李糖、巖藻糖、木糖、阿拉伯糖、果糖、甘露糖、葡萄糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸等共同組成(圖2),其中葡萄糖的含量最高,各部位平均含量依次為(2.123±0.070)mg/g、(1.237±0.245)mg/g、(0.805±0.095)mg/g。其次是半乳糖醛酸,各部位平均含量依次為(0.322±0.045)mg/g、(0.376±0.096)mg/g、(0.280±0.030)mg/g。木糖含量最低,各部位平均含量依次為(0.008±0.001)mg/g、(0.008±0.001)mg/g、(0.008±0.002)mg/g。
西洋參不同部位中各單糖含量分布存在一定特征性。主根中葡萄糖含量較高,其平均值為(2.123±0.070)mg/g;蘆頭中鼠李糖、阿拉伯糖、果糖、甘露糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸含量較高,其平均值分別為(0.037±0.006)mg/g、(0.179±0.023)mg/g、(0.158±0.028)mg/g、(0.036±0.006)mg/g、(0.069±0.007)mg/g、(0.376±0.096)mg/g;參須中巖藻糖含量較高,其平均值為(0.120±0.005)mg/g。不同部位中9種單糖含量見圖2所示。
圖2 西洋參不同部位單糖組成Fig.2 Composition of monosaccharides in the different parts of Panacis Quinquefolii Radix
采用SPSS等數(shù)據(jù)分析軟件,以西洋參中9個化合物的含量測定結(jié)果作為變量,對西洋參不同部位進(jìn)行主成分分析(principal component analysis,PCA),以綜合評析這3個不同部位的差異性。
通過SPSS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)對西洋參3個不同部位中的9個成分進(jìn)行PCA處理,以此為依據(jù)對西洋參不同部位進(jìn)行綜合評析。根據(jù)西洋參主成分矩陣結(jié)果,建立西洋參質(zhì)量評價模型,計算每個樣本的綜合評價得分,通過綜合評價得分對比可以看出西洋參的主根、蘆頭、參須不同部位之間可以明顯地區(qū)分。說明西洋參不同部位的單糖組成存在一定的差異,有望作為化學(xué)標(biāo)記物用于其區(qū)分判別,詳見圖3。
圖3 西洋參不同部位的PCA三維圖譜Fig.3 Three-dimensional map of PCA analysis for the different parts of Panax quinquefolii Radix
本研究建立了親水色譜-電霧式檢測器-電噴霧-飛行時間質(zhì)譜法分析測定西洋參多糖單糖組成的方法,結(jié)果表明,該方法樣品處理速度快、靈敏度較高。對西洋參各部位單糖組成的分析檢測,發(fā)現(xiàn)其不同部位多糖均由鼠李糖、巖藻糖、木糖、阿拉伯糖、果糖、甘露糖、葡萄糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸等組成,但不同部位含量卻存在一定的差異,主根中葡萄糖含量較高,蘆頭中鼠李糖、阿拉伯糖、果糖、甘露糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸含量較高,參須中巖藻糖含量較高。采用單糖含量結(jié)合PCA分析可以實現(xiàn)對西洋參不同部位的正確區(qū)分。本研究為西洋參多糖的單糖組成分析提供了方法和技術(shù)支持,并可為不同藥用部位的開發(fā)利用提供依據(jù)。