薤白皂苷對冠心病模型大鼠心肌細(xì)胞凋亡及炎性因子、NF-κB表達(dá)的影響

溫 亮，韓秀平，謝 燚，曹 建

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病簡稱冠心病(coronary heart disease，CHD)，是臨床較為常見的心血管疾病之一[1]。冠心病是指由于冠狀動脈的粥樣硬化導(dǎo)致其血管管腔發(fā)生狹窄、閉塞后引起的心肌缺血缺氧性病變，急性發(fā)作時可導(dǎo)致心肌壞死[2-3]。隨著歐美發(fā)達(dá)國家二級預(yù)防措施及心臟康復(fù)的廣泛普及，其冠心病的病死率已經(jīng)出現(xiàn)了大幅度的下降，但我國缺血性心臟病正處于上升態(tài)勢，嚴(yán)重影響我國居民的生活質(zhì)量，因此，有效的治療冠心病成為目前臨床研究的重點。炎癥在冠心病的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后過程中起著重要的作用[4]。冠心病病理過程的基礎(chǔ)是動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)，動脈粥樣硬化發(fā)生的過程炎癥貫穿其中，激活炎癥反應(yīng)會導(dǎo)致斑塊不穩(wěn)定，導(dǎo)致急性冠脈綜合征的發(fā)生，通過體內(nèi)炎癥標(biāo)志物水平的變化來反映局部和全身的炎癥[5]。冠心病病人發(fā)生缺血事件時，炎癥標(biāo)志物的變化隨其變化而變化，由此提示炎癥標(biāo)志物介導(dǎo)著冠心病的發(fā)生發(fā)展[6]。隨著研究不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)是各種炎性因子激活、級聯(lián)放大的共同通道[7]。薤白為百合科多年生草本植物小根蒜的干燥鱗莖，現(xiàn)代研究顯示，其治療冠心病的物質(zhì)基礎(chǔ)為含氮化合物、含硫化合物及甾體皂苷，多數(shù)學(xué)者傾向于認(rèn)為甾體皂苷是薤白發(fā)揮心血管作用的主要活性成分，甾體皂苷通過抑制血小板聚集、抗心肌缺血及抗再灌注損傷發(fā)揮作用[8-9]。但薤白皂苷對冠心病大鼠的治療還沒有明確的報道，因此，本研究采用薤白皂苷對冠心病大鼠模型進(jìn)行干預(yù)，觀察其對心肌細(xì)胞、炎癥物質(zhì)和NF-κB的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 本實驗所用動物為清潔級SD大鼠，均購自新疆醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院實驗動物研究部，動物合格證：SYXK(新)2014-0002，共計50只。鼠齡為8周，體質(zhì)量220～240 g，大鼠室內(nèi)環(huán)境保持光照12 h晝夜循環(huán)交替，自由進(jìn)食飲水，大鼠適應(yīng)新環(huán)境1周后用于后續(xù)實驗，本研究經(jīng)動物倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 藥品 將新鮮薤白鱗莖粉碎過16目篩，加入乙醇后經(jīng)浸提、離心，提取上清液抽濾后經(jīng)石油醚、正丁醇萃取，抽濾后得到薤白皂苷。垂體后葉注射液由上海第一生化藥物有限公司生產(chǎn)。

1.3 試劑和儀器 兔抗NF-κB購自上海信裕生物科技有限公司，貨號：bs-2695R；辣根過氧化物酶(DAB)顯色試劑購自北京百奧萊博科技有限公司，貨號：WE0323-HIS；NF-κB的酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測試劑盒購自上海BG生物工程公司；腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司；低溫超速離心機(jī)購自德國Eppendorf公司；倒置顯微鏡購自日本Olympus公司；-20 ℃冰箱購自中國海爾集團(tuán)；恒溫箱購自寧波自動化儀表廠。

1.4 動物模型的建立及給藥方法 建立冠心病大鼠模型，隨機(jī)取10只大鼠給予正常飼料喂養(yǎng)，設(shè)定為正常組，剩余40只大鼠每只大鼠每天給予30 g高脂飼料(含77.3%普通飼料，10%豬油，10%蛋黃粉，2%膽固醇，0.2%丙硫氧嘧啶，0.5%膽酸鈉)連續(xù)喂養(yǎng)6周，間隔24 h腹腔注射垂體后葉素30 μg/kg，連續(xù)3次。通過心電圖鑒定是否成功建立冠心病大鼠模型，將40只成功構(gòu)建冠心病模型的大鼠分為模型組、薤白皂苷低劑量組、薤白皂苷中劑量組和薤白皂苷高劑量組，每組10只。薤白皂苷低劑量組、中劑量組和高劑量組大鼠分別給予168 mg/kg、337 mg/kg和674 mg/kg的薤白皂苷灌胃，正常組和模型組大鼠分別給予等量的生理鹽水灌胃，連續(xù)灌胃7 d。

1.5 收集標(biāo)本 于大鼠尾靜脈注入10%氯化鉀注射液使心臟停搏于心室舒張期，立即取出大鼠的心臟，將心室分為心尖部和心底部，心尖部立即用液氮速凍后置于-80 ℃冰箱保存，用于蛋白檢測。心底部位用4%多聚甲醛固定12 h后用于心肌細(xì)胞凋亡檢測和組織病理檢測。

1.6 血清炎性因子水平檢測 采用ELISA法檢測各組大鼠血清TNF-α、IL-1β和IL-6水平，實驗操作均按照ELISA試劑盒說明書嚴(yán)格操作。

1.7 脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)檢測心肌細(xì)胞凋亡 取出大鼠的心肌組織，分別切成0.5 cm的塊狀，固定后石蠟包埋，將組織切片。用TUNEL法將石蠟切片進(jìn)行染色，所有的步驟按照試劑盒上的說明嚴(yán)格進(jìn)行。每張石蠟切片選取5個不交叉的視野進(jìn)行觀察，凋亡的心肌細(xì)胞為深棕色。細(xì)胞凋亡率=細(xì)胞凋亡數(shù)量/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.8 心肌組織病理學(xué)形態(tài)觀察 制備心肌組織切片，每個樣本取不連續(xù)3張切片，常規(guī)脫蠟至水，蘇木精液染色、75%鹽酸乙醇分化、氨水處理、酸化伊紅乙醇染色處理后水洗、梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封固，光鏡下觀察。

1.9 蛋白質(zhì)印記法檢測大鼠NF-κB蛋白表達(dá) 分別提取各組大鼠的心肌組織100 mg，進(jìn)行裂解并提取核蛋白，并測量核蛋白濃度，分裝存于-20 ℃的環(huán)境中。蛋白溶液：緩沖溶液為4∶1混合，然后將其煮沸、蛋白質(zhì)變性。取50 μm的注入蛋白樣品電泳板內(nèi)，把電泳后的樣品轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上，加入脫脂奶粉，并進(jìn)行封閉，時長為1 h。加入一抗后進(jìn)行TTBS漂洗，每次漂洗10 min，共進(jìn)行3次漂洗，最后加入二抗對溶液進(jìn)行稀釋，再在常溫環(huán)境中封閉1 h。取出PVDF膜，TTBS漂洗10 min×3次，DAB顯色后采用數(shù)碼相機(jī)照相。

2 結(jié) 果

2.1 各組血清TNF-α、IL-1β和IL-6水平比較 模型組大鼠血清TNF-α、IL-1β和IL-6水平較正常組明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，薤白皂苷低劑量組、薤白皂苷中劑量組和薤白皂苷高劑量組TNF-α、IL-1β和IL-6水平明顯降低，且TNF-α、IL-1β和IL-6水平逐漸遞減，薤白皂苷高劑量組TNF-α、IL-1β和IL-6水平低于薤白皂苷低劑量組、薤白皂苷中劑量組(P<0.05)。詳見表1。

表1 各組血清TNF-α、IL-1β和IL-6水平比較 單位：ng/mL

2.2 各組血漿NF-κB濃度比較 與正常組比較，模型組血漿NF-κB濃度明顯增加(P<0.05)；與模型組比較，薤白皂苷低劑量組、薤白皂苷中劑量組和薤白皂苷高劑量組血漿NF-κB濃度明顯降低(P<0.05)，且隨著薤白皂苷劑量越高NF-κB濃度越低(P<0.05)。詳見表2及圖1。

表2 各組大鼠血漿NF-κB濃度比較 單位：ng/mL

與正常組比較，＊P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與薤白皂苷低劑量組比較，△P<0.05；與薤白皂苷中劑量組比較，☆P<0.05。

2.3 各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率比較 與正常組比較，模型組心肌細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，薤白皂苷低劑量組、薤白皂苷中劑量組和薤白皂苷高劑量組心肌細(xì)胞凋亡率均明顯降低，且薤白皂苷高劑量組心肌細(xì)胞凋亡率低于薤白皂苷低劑量組、薤白皂苷中劑量組(P<0.05)。詳見表3及圖2、圖3。

表3 各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率比較 單位：%

與正常組比較，＊P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與薤白皂苷低劑量組比較，△P<0.05；與薤白皂苷中劑量組比較，☆P<0.05。

圖3 各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡TUNEL染色熒光圖(×400)

2.4 各組大鼠心肌組織病理學(xué)變化 正常組大鼠心肌細(xì)胞排列整齊，大小正常，邊界清楚，胞漿均勻，胞核染色均勻，間質(zhì)成纖維細(xì)胞形態(tài)無異常；血管厚度正常，血管周圍膠原沉積少，無炎癥細(xì)胞浸潤；與正常組比較，模型組大鼠心肌細(xì)胞明顯肥大增厚，細(xì)胞漿呈濃染，增大，細(xì)胞間距增大，單位面積內(nèi)心肌細(xì)胞數(shù)較正常組明顯減少，血管壁增厚，血管周圍有較多膠質(zhì)沉淀，出現(xiàn)大量的炎癥細(xì)胞浸潤。薤白皂苷低劑量組、薤白皂苷中劑量組和薤白皂苷高劑量組血管周圍膠原沉積和心肌炎癥細(xì)胞浸潤均明顯減少，心肌組織得到了明顯的改善，且改善程度呈劑量依賴性，薤白皂苷高劑量組>薤白皂苷中劑量組>薤白皂苷低劑量組。詳見圖4。

圖4 各組大鼠心肌組織HE染色(×400)

2.5 各組大鼠心肌組織中NF-κB蛋白表達(dá)比較 模型組和正常組NF-κB蛋白表達(dá)比較明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，薤白皂苷低劑量組、薤白皂苷中劑量組和薤白皂苷高劑量組大鼠心肌細(xì)胞中NF-κB蛋白表達(dá)明顯降低，且隨著薤白皂苷劑量增加NF-κB蛋白表達(dá)降低(P<0.05)。詳見圖5、圖6。

圖5 各組大鼠心肌組織中NF-κB蛋白表達(dá)條帶圖

與正常組比較，＊P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與薤白皂苷低劑量組比較，△P<0.05；與薤白皂苷中劑量組比較，☆P<0.05。

3 討 論

冠心病是常見的危害人類健康的疾病之一，動脈粥樣硬化、血管再狹窄和心肌缺血再灌注損傷影響著冠心病的發(fā)生發(fā)展[10]。近年來的基礎(chǔ)研究顯示，心肌細(xì)胞凋亡在動脈粥樣硬化、血管再狹窄、急性心肌梗死、心肌缺血、再灌注損傷的發(fā)展中可能起著重要的作用[11]。細(xì)胞凋亡又稱為程序性細(xì)胞壞死，是多細(xì)胞生物體細(xì)胞自我有效消亡過程。細(xì)胞凋亡和細(xì)胞壞死在形態(tài)上大不相同，屬于另外一種細(xì)胞死亡的類型[12]。近年來，隨著對冠心病發(fā)病機(jī)制的深入研究，細(xì)胞凋亡與冠心病的關(guān)系研究成為熱點之一。有研究證實心肌缺血是心肌細(xì)胞壞死和凋亡的重要因素，心肌缺血引起細(xì)胞色素釋放及活化介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡機(jī)制[13]。本研究結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組心肌細(xì)胞凋亡率明顯升高；采用不同劑量的薤白皂苷干預(yù)后發(fā)現(xiàn)，冠心病大鼠心肌細(xì)胞凋亡率得到了明顯的抑制，且隨著薤白皂苷劑量增加，心肌細(xì)胞凋亡率逐漸降低，可見薤白皂苷可有效抑制心肌細(xì)胞凋亡。

中藥薤白為蔥科植物小根蒜的鱗莖，具有通陽散結(jié)、行氣止痛的功效，薤白是我國傳統(tǒng)的中藥湯劑瓜蔞薤白白酒湯、瓜蔞薤白半夏湯、枳實薤白桂枝湯的經(jīng)典配伍方藥[14-15]。其次，作為一種藥食同源的植物，薤白因其歷史悠久、具有更高的安全性及較少的毒副作用而受到亞洲國家人民的普遍歡迎和廣泛使用?，F(xiàn)代研究表明，薤白含有多種藥理活性成分，具有抗菌消炎、解痙平喘、抗腫瘤、降血脂、抗動脈粥樣硬化等作用[16]。薛慧文等[15]體外實驗發(fā)現(xiàn)，薤白通過抑制Ca2+超載可對過氧化氫(H2O2)誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷發(fā)揮保護(hù)作用。

動脈粥樣硬化是冠心病的病理基礎(chǔ)，其病灶深處含有脂質(zhì)和壞死成分的脂核，上覆以突出于血管腔面的纖維帽，隨著病程的進(jìn)展，斑塊可有纖維帽潰瘍破裂、斑塊內(nèi)出血、斑塊鈣化等繼發(fā)改變，而炎性因子在高血壓、血脂代謝異常等心血管危險因素作用下影響動脈粥樣硬化的發(fā)生與進(jìn)展[17]。臨床研究表明，冠心病病人血清促炎因子TNF-α、IL-1β和IL-6升高。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組血清TNF-α、IL-1β和IL-6水平高于正常組，薤白皂苷各劑量組血清TNF-α、IL-1β和IL-6水平低于模型組，且隨著薤白皂苷劑量的增加，血清TNF-α、IL-1β和IL-6水平逐漸降低，提示薤白皂苷可減輕冠心病大鼠的炎癥反應(yīng)。劉澤君等[18]研究證實薤白皂苷化合物可能具有抗血小板相關(guān)炎癥的作用。

NF-κB作為一種炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)因子，廣泛存在于血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞內(nèi)，調(diào)控著一系列的有關(guān)炎癥反應(yīng)、免疫答應(yīng)、細(xì)胞生長、發(fā)育等一些細(xì)胞基因的表達(dá)，NF-κB介導(dǎo)著一些心血管疾病的生理過程，如動脈粥樣硬化、冠心病等。在這些疾病致病過程中，均可發(fā)現(xiàn)NF-κB呈過度激活狀態(tài)，大量胞漿內(nèi)的NF-κB復(fù)合物移位進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，誘導(dǎo)前炎癥介質(zhì)和免疫相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)[19]。本研究結(jié)果顯示，模型組血漿NF-κB濃度和蛋白表達(dá)均明顯升高，薤白皂苷低劑量組、薤白皂苷中劑量組和薤白皂苷高劑量組NF-κB濃度和蛋白表達(dá)均明顯低于模型組，提示不同劑量的薤白皂苷可有效抑制NF-κB表達(dá)，且隨著薤白皂苷劑量的增加，NF-κB表達(dá)逐漸降低。崔翔[20]研究證實，心功能指標(biāo)降低，NF-κB的表達(dá)升高，且NF-κB隨著心臟結(jié)構(gòu)指標(biāo)降低而降低，推測NF-κB介導(dǎo)著冠心病心力衰竭的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，薤白皂苷可有效抑制冠心病大鼠心肌細(xì)胞凋亡，減緩炎癥反應(yīng)，同時抑制NF-κB蛋白表達(dá)。