常莉莉，王 楚，羅美青，趙孟欽，賀 虹

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 林學(xué)院，西部森林生物災(zāi)害治理國家林業(yè)和草原局重點實驗室，陜西 楊陵 712100)

螞蟻是高度進(jìn)化的社會性昆蟲，廣泛分布于陸地生態(tài)系統(tǒng)，是種類和數(shù)量最為豐富的動物類群，對于農(nóng)林害蟲和其他小型動植物類群的種群數(shù)量具有較好的調(diào)節(jié)作用[1]。螞蟻食性較雜，能夠取食固體食物如植物種子及其他小型節(jié)肢動物尸體，又能取食液體食物如花蜜、樹汁及半翅目昆蟲的蜜露[2]。螞蟻口前腔具有一個特殊的結(jié)構(gòu)—頰下囊(infrabuccal pocket)，能夠過濾固體食物顆粒和其他雜質(zhì)并將其定期排出體外[3-4]。頰下囊的過濾作用使得只有液態(tài)食物才能進(jìn)入食道并儲存于嗉囊，然后個體間通過交哺傳遞給蟻巢內(nèi)的其他個體[1]。一些研究表明，螞蟻頰下囊中存在一些特殊的微生物類群，在螞蟻社會生活中發(fā)揮特殊功能[5-6]，尤其在培養(yǎng)真菌的切葉蟻中，其工蟻頰下囊中的鏈霉菌產(chǎn)生抗生素，可殺死致病菌孢子以此來保護(hù)菌圃的安全[7-9]。前期的研究發(fā)現(xiàn)，日本弓背蟻(Camponotusjaponicus)頰下囊中微生物的種類和數(shù)量明顯高于消化道，且放線菌為頰下囊中優(yōu)勢的微生物類群[10-11]，其他研究者發(fā)現(xiàn)日本弓背蟻頭部分離得到的放線菌種類較胸部和腹部多[12]。但目前關(guān)于螞蟻頰下囊微生物組成的研究仍局限于少數(shù)種類，這些微生物的組成及其功能有待更進(jìn)一步的揭示。

爪哇扁頭猛蟻(Ectomomyrmexjavanus)是一種在中國分布較為廣泛的捕食性螞蟻，又被稱為敏捷扁頭猛蟻或敏捷厚結(jié)猛蟻(Pachycondylaastuta)[13-15]。該種螞蟻主要取食節(jié)肢動物的尸體，偶爾采集種子和植物的葉片[16]，其頰下囊的超微結(jié)構(gòu)明顯不同于雜食性的日本弓背蟻[17-18]，那么其內(nèi)部的微生物組成是否也存在差異還是未知。因此，本研究以該種肉食性螞蟻為研究對象，利用傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)與16S rRNA相結(jié)合的方法，分離和鑒定了其頰下囊內(nèi)含物中的放線菌，并對可分離培養(yǎng)放線菌進(jìn)行抗菌活性研究，旨在進(jìn)一步揭示頰下囊在螞蟻食物資源利用、消化和清潔行為等方面可能發(fā)揮的作用，也為發(fā)現(xiàn)具有抑菌活性菌株應(yīng)用于農(nóng)林業(yè)病蟲害防治提供信息。

1 材料與方法

1.1 螞蟻的采集與解剖

在陜西楊凌選取距離>3 km的3個爪哇扁頭猛蟻巢穴，采集外出活動的工蟻，單頭工蟻單獨(dú)裝入滅菌的離心管內(nèi)，放入冰盒帶回實驗室在超凈工作臺中進(jìn)行頰下囊的解剖，用于放線菌的分離培養(yǎng)研究。頰下囊的解剖方法參考張凱旋等[11]的研究方法。

1.2 供試菌株

抑菌活性試驗共涉及到8種植物病原真菌(表1)，試驗菌株來源于西北農(nóng)林科技大學(xué)森林病理實驗室。

表1 抑菌活性試驗菌株信息統(tǒng)計Table 1 The information of the strains used for antimicrobialbioactivity of actinomycetes

1.3 放線菌的分離培養(yǎng)

采用ISP2培養(yǎng)基、高氏一號固體培養(yǎng)基和牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基分別進(jìn)行放線菌的分離培養(yǎng)，同一地點、同種培養(yǎng)基分別解剖10頭工蟻的頰下囊作為重復(fù)。在3種培養(yǎng)基中加入質(zhì)量濃度分別為8.30%，6.25%和6.25%的重鉻酸鉀[12]，抑制其他細(xì)菌生長[19]；采用高氏一號液體培養(yǎng)基和小米培養(yǎng)基用于放線菌菌株的發(fā)酵培養(yǎng)，PDA固體培養(yǎng)基(馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基)用于病原真菌的培養(yǎng)，具體配置方法見文獻(xiàn)[19]。

將單頭工蟻頰下囊的內(nèi)含物單獨(dú)進(jìn)行微生物的分離培養(yǎng)，直接放置于培養(yǎng)基上，加入200 μL無菌水，用滅菌后的三角玻璃棒研磨涂抹均勻。滅菌水200 μL涂抹于培養(yǎng)基上作為陰性對照。將制作好的培養(yǎng)皿用封口膜密封，置于恒溫培養(yǎng)箱中28 ℃培養(yǎng)，定期觀察菌落生長情況。培養(yǎng)21～31 d后進(jìn)行菌落的觀察和統(tǒng)計，記錄每個平板上的菌落形態(tài)及數(shù)量，計算菌株在不同蟻巢的分離頻率，根據(jù)菌落形態(tài)特征挑取單菌落，進(jìn)行劃線培養(yǎng)，分離純化后置于4 ℃冰箱保藏備用。

分離頻率=巢穴中分離到此種菌株的螞蟻數(shù)量/本巢穴解剖的螞蟻數(shù)量×100%

1.4 菌株的DNA提取、PCR擴(kuò)增及測序

采用4種方法對放線菌菌株的DNA進(jìn)行提?。壕銹CR法、CTAB法[20]、細(xì)菌基因組DNA試劑盒(北京天根生化科技有限公司)、Chelex-100法[21]。利用引物27F： 5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′；1492R：5′-ATGGGYTACCTTGTTACGACTT-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增[22]。待PCR產(chǎn)物達(dá)到測序的要求后送上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行雙向測序。

在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST序列比對，下載相似性最高的前5條微生物序列，然后利用ClustalX 2.1軟件進(jìn)行多重比對[23]，利用軟件BioEdit 7.0.9.0對原始序列進(jìn)行拼接和校對，切除首尾亂序，選擇最理想的建樹模型，使用軟件 Mrbayes 3.1.2 構(gòu)建貝葉斯系統(tǒng)發(fā)育樹(Bayesian inference tree)[24]，依據(jù)97%的序列相似性作為判定放線菌種類的標(biāo)準(zhǔn)。

1.5 放線菌抑菌活性研究

1.5.1 平板對峙法對放線菌抑菌活性的初步篩選 參照賀宏偉等[25]的研究方法，用接種針挑取少量分離純化的放線菌菌絲涂布在高氏一號培養(yǎng)基平板上，在28 ℃的恒溫條件下培養(yǎng)3～5 d備用。采用平板對峙培養(yǎng)法研究放線菌對病原菌的抑制作用。病原菌菌餅(d=0.5 cm)取自于培養(yǎng)好的病原菌邊緣，將其置于PDA平板中央，取供試放線菌菌餅(d=0.5 cm)置于PDA平板病原菌的兩側(cè)，每個處理重復(fù)3次。28 ℃恒溫培養(yǎng)3～5 d后測量病原菌直徑和2個放線菌菌餅的距離，計算平均抑菌率。

抑菌率=(放線菌菌餅間距離-病原菌直徑)/放線菌菌餅間距離×100%

1.5.2 生長速率法對放線菌發(fā)酵液抑菌活性的分析 參照賀宏偉等[25]的研究方法，在無菌條件下，挑取初步篩選后具有抑菌活性的放線菌菌株單菌落，在小米發(fā)酵培養(yǎng)基上接種10%活化好的菌株，在臺式恒溫振蕩器中28 ℃、180 r/min搖菌培養(yǎng)7 d，獲得所需發(fā)酵液8 000 r/min離心15 min，取上清保存在4 ℃冰箱備用。采用生長速率法對放線菌發(fā)酵液進(jìn)行抑菌活性研究。在28 ℃恒溫條件下培養(yǎng)3～4 d后，采用十字交叉法分別測量菌落直徑，計算不同發(fā)酵液對病菌的抑制率。

菌落生長直徑(cm)=十字交叉法測量的2次直徑平均值-0.4

抑菌率=(1-試驗組菌落生長直徑/對照組菌落生長直徑)×100%

1.6 高抑菌活性菌株的生理生化特性鑒定

采用插片法進(jìn)行菌株菌絲形態(tài)的觀察[26]和生理生化特性分析，包括淀粉和纖維素水解、硫化氫產(chǎn)生、明膠液化、牛奶凝固和胨化試驗[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 爪哇扁頭猛蟻頰下囊中可培養(yǎng)放線菌種類組成及分子鑒定

利用3種固體培養(yǎng)基對爪哇扁頭猛蟻3個蟻巢90頭工蟻頰下囊內(nèi)含物中的放線菌進(jìn)行分離培養(yǎng)，最終獲得9株不同形態(tài)的放線菌菌株(圖1)；對其進(jìn)行16S rRNA分子鑒定后在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST比對，構(gòu)建BI系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖2)，確定分別屬于鏈霉菌屬(Streptomyces)、微桿菌屬(Microbacterium)、冢村氏菌屬(Tsukamurella)和擬無枝酸菌屬(Amycolatopsis)(表2)。

圖2 爪哇扁頭猛蟻頰下囊中可培養(yǎng)放線菌的系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.2 Phylogenetic analysis of culturable actinomyces isolated from the infrabuccal pocket of E.javanus workers

表2 爪哇扁頭猛蟻頰下囊中放線菌的分離鑒定Table 2 Actinomycetes isolation and identification from the infrabuccal pocket of E.javanus workers

圖1 爪哇扁頭猛蟻頰下囊中可培養(yǎng)的9株放線菌菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphologyof the nine strains of actinomycetes isolated from the infrabuccal pocket of E.javanus workers

利用ISP2培養(yǎng)基分離得到3株放線菌(A1、A2、A3)，利用高氏一號培養(yǎng)基分離得到5株放線菌(B1～B5)，利用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基僅分離得到1株放線菌(C1)。

從分離菌株種類及其在不同蟻巢的分布和分離頻率可以看出，鏈霉菌為優(yōu)勢類群，共有6個菌株(B1、A3、B4、B5、B3、A2)，菌株B1、A3和B5在3個蟻巢中均有分布，其平均分離頻率分別為93.3%、80.0%和53.3%；菌株B4、B3和A2均只出現(xiàn)在其中的2個蟻巢中，分離頻率分別為60.0%、40.0%和26.7%。菌株C1為微桿菌屬，其分離頻率最高，達(dá)到100.0%，在3個蟻巢中均有分布。菌株A1為冢村氏菌屬，其分離頻率為80.0%，也在3個蟻巢中均有分布。菌株B2為擬無枝酸菌屬，僅在巢1和巢2中有分布，分離頻率最低，僅為26.7%。

2.2 放線菌對林木病原菌的抑菌活性

2.2.1 平板對峙法對放線菌抑菌活性的初步篩選結(jié)果 利用分離得到的9株放線菌對8種林木病原真菌進(jìn)行抗菌活性初步篩選，結(jié)果表明，9株放線菌中，只有4株(B4、B3、B2、B5)對病原真菌表現(xiàn)出抑菌活性，其余5株(A1、A2、A3、B1和C1)對測試的病原真菌均無抑菌活性(表3)。

表3 9株放線菌對8種病原真菌的抑菌活性結(jié)果Table 3 Antimicrobial activity of nine actinomycetes stains to eight pathogenic fungi

菌株B4(鏈霉菌屬)對8種病原真菌均表現(xiàn)出明顯的抑菌活性(部分抑菌圖如圖3所示)，尤其對灰霉病菌、蘋果腐爛病菌、核桃黑盤殼菌和楊樹潰瘍病菌的抑制作用十分明顯，抑菌率分別為66.0%、58.2%、57.7%和53.5%；對茶葉炭疽病菌、棗縮病原菌、水稻紋枯病菌和核桃炭疽病菌的抑菌率相對較低，分別為49.3%、47.7%、41.3%和43.0%。菌株B3對其中的7種病原真菌表現(xiàn)出抑菌活性，但抑菌活性均低于52%。菌株B2僅對2種病原真菌表現(xiàn)出抑菌活性，對蘋果腐爛病菌的抑菌率為34.5%，對棗縮病原菌的抑菌率為19.3%。菌株B5僅對棗縮病原菌具有抑菌活性，抑菌率為34.9%。

圖3 放線菌B4對3種病原真菌(F2、F3、F4)的抑菌圖Fig.3 Photos of the antibacterial experiment of actinomycetes B4 against three pathogenic fungi (F2,F3,F4)

因此，通過平板對峙法對放線菌抑菌活性進(jìn)行初篩試驗，確定4株放線菌B2、B3、B4和B5對8種植物病原真菌具有較好的抑菌活性。

2.2.2 生長速率法對放線菌發(fā)酵液抑菌活性的研究結(jié)果 針對前期篩選出的具有較好抑菌活性的4株放線菌(B2、B3、B4、B5)，采用其發(fā)酵液繼續(xù)開展抑菌活性研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，4種放線菌的發(fā)酵液對8種病原菌具有一定抑菌活性(表4)，每組3個重復(fù)，進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析。

表4 4種放線菌菌株發(fā)酵液對8種病原真菌的抑菌率Table 4 Antibacterial rate of four actinomycete fermentation broths against eight pathogenic fungi %

菌株B2的發(fā)酵液只對蘋果腐爛病病菌F8有抑制作用，抑菌率為64.82%；菌株B3的發(fā)酵液僅對2種病原真菌表現(xiàn)出一定的抑菌活性，其中對蘋果腐爛病菌F8的抑菌率最高為71.67%，對核桃枝枯病菌F7的抑菌率僅為27.60%。菌株B4的發(fā)酵液對8種病原真菌都表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑菌活性，對楊樹潰瘍病菌F1、水稻紋枯病菌F5、核桃枝枯病菌F7和蘋果腐爛病F8的抑菌率達(dá)到100%，顯示出極強(qiáng)的抑菌效果。菌株B5的發(fā)酵液基本上沒有抑菌活性。

2.3 菌株B4的鑒定

對篩選出的具有高抑菌活性的1株鏈霉菌菌株B4進(jìn)行理化特性分析。

B4菌株在高氏1號固體培養(yǎng)基上生長良好，菌落生長緊密，氣生菌絲呈白色絨毛狀，基內(nèi)菌絲橙黃色。生理生化鑒定結(jié)果顯示(表5)：B4菌株不能分解利用纖維素，能水解淀粉，可使明膠液化、牛奶凝固和牛奶胨化，但不能產(chǎn)生硫化氫氣體。從圖2各個菌株的系統(tǒng)發(fā)育可以看出，該菌株的序列與極暗黃鏈霉菌Streptomycesfulvissimus(LM999765.1)比較相似，相似度為99%。因此，參照放線菌鑒定標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)合菌落生長特征、理化特性分析和序列的系統(tǒng)發(fā)育分析，將B4菌株初步鑒定為極暗黃鏈霉菌。

表5 B4菌株的生理生化鑒定結(jié)果Table 5 Physiological and biochemical identification results of B4 strain

3 結(jié)論與討論

本研究采用傳統(tǒng)的微生物分離培養(yǎng)方法對爪哇扁頭猛蟻工蟻頰下囊中的放線菌進(jìn)行了分離培養(yǎng)，利用3種培養(yǎng)基從3個蟻巢的90頭工蟻的頰下囊中共分離得到9株菌落形態(tài)不同的放線菌，其中優(yōu)勢類群為鏈霉菌，包括6個菌株(A2、A3、B1、B3、B4、B5)，其他3個菌株屬于微桿菌屬、擬無枝酸菌屬和冢村氏菌屬。菌株B1、A3、C1和A1的分離頻率高達(dá)80%以上，在3個蟻巢的工蟻頰下囊中均有，應(yīng)該是頰下囊中的優(yōu)勢放線菌類群。這與張凱旋等[11]對日本弓背蟻頰下囊中放線菌的研究結(jié)果基本一致，螞蟻的頰下囊中分布著豐富的放線菌，并且鏈霉菌為優(yōu)勢菌群。

國外的一系列研究表明，培養(yǎng)真菌的切葉蟻在整理修飾菌圃的過程中，利用頰下囊收集、壓實一些碎片和致病菌Escovopsis孢子，使其形成小球堆放在菌圃之外的垃圾堆，可阻止微生物和致病菌侵染其菌圃[7-8]。并且Attini螞蟻頰下囊中的鏈霉菌可產(chǎn)生抗生素，能夠殺死菌圃中的致病菌[8]；Allomerus螞蟻體表的鏈霉菌可抑制菌圃中的其他雜菌，以此來維護(hù)菌圃的清潔，進(jìn)而保證蟻巢的穩(wěn)定[8-9]，因此在培養(yǎng)真菌的螞蟻中頰下囊中的微生物具有殺菌消毒的功能。結(jié)合本研究，可以明確頰下囊除了過濾固體食物的功能外，應(yīng)該還具有清潔蟻巢、保護(hù)群體的功能。

放線菌是一類重要的微生物資源，目前已發(fā)現(xiàn)了超過2萬種微生物源生物活性物質(zhì)，其中1/2來自放線菌。而在醫(yī)藥臨床和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中長期使用的150余種抗生素中，70%源于放線菌[27]。一些學(xué)者也從螞蟻身體上分離到一些新的放線菌，如在亮毛蟻(Lasiusfuliginosus)的頭部分離到珊瑚放線菌Actinocorallialasicapitis[28]，在日本弓背蟻的頭部分離到鏈霉菌屬的一個新種Streptomycescamponoticapitis[29]。這些研究表明，螞蟻身體上蘊(yùn)含豐富的放線菌資源，在螞蟻的群體免疫中起著重要的作用，可能為新藥劑和抗生素的開發(fā)提供新途徑。

對分離到的放線菌進(jìn)行抑菌活性研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大部分菌株都對一些林木病原菌具有一定的抑菌活性，具有進(jìn)一步開發(fā)利用的價值。特別是菌株B4對絕大多數(shù)被試林木病原菌都有強(qiáng)烈的抑菌活性，初步將其鑒定為極暗黃鏈霉菌Streptomycesfulvissimus。張貝貝等[30]從海洋放線菌中分離得到極暗黃鏈霉菌，并通過抑菌試驗和抗腫瘤試驗表明其代謝產(chǎn)物抑菌和抗腫瘤作用效果明顯。陳丹等[31]在研究對水稻紋枯病有抑菌活性的放線菌時，從土壤中分離篩選出抑菌活性效果最好的是極暗黃鏈霉菌，其產(chǎn)生的生物活性物質(zhì)具有一定的殺菌活性和穩(wěn)定性。爪哇扁頭猛蟻頰下囊中的放線菌可能來自其棲息的環(huán)境中，螞蟻身體上的放線菌資源將是人類疾病控制和農(nóng)林業(yè)病害防治領(lǐng)域的新方向，具有極大的開發(fā)利用空間。