呂則佳，陳健鑫，馮 峻，朱 艷，董云祥，羅正平，馬煥成，伍建榕,*

(1.云南省高校森林災(zāi)害預(yù)警控制重點實驗室，西南林業(yè)大學(xué) 生物多樣性保護(hù)學(xué)院，云南 昆明 650224；2.西南地區(qū)生物多樣性保育國家林業(yè)和草原局重點實驗室，西南林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，云南 昆明 650224；3.云南省林木種苗工作總站，云南 昆明 650215；4.楚雄市林業(yè)和草原局國有林場，云南 楚雄 675000)

華山松(Pinusarmandii)是松科(Pinaceae)松屬(Pinus)植物[1]，是我國特有的用材樹種、同時也是高海拔地區(qū)重要的造林樹種之一[2-3]。華山松有較高的價值，針葉可提取芳香油；材質(zhì)經(jīng)軟，耐腐，可做用材樹種；種子飽滿，可作干果供食用[4]；華山松在醫(yī)用方面有著極高的價值，例如它的松塔提取物對HIV病毒活性有一定的抑制作用[5]。

云南楚雄紫溪山華山松無性系種子園位于24°58′58″-25°04′00″N，101°22′29″-101°26′07″E，海拔2 200～2 400 m，年平均氣溫12 ℃，年平均降雨量1 000 mm[6]。紫溪山自然保護(hù)區(qū)是一個重要的生態(tài)旅游景區(qū)，由于氣候環(huán)境條件好，人流量大，加之又連續(xù)干旱，病蟲害時常發(fā)生[7]，尤其華山松葉枯病發(fā)生嚴(yán)重，然而華山松是云南主要造林樹種，在退耕還林、城鄉(xiāng)綠化和用材林等建設(shè)中，發(fā)揮著舉足輕重的作用，隨著林業(yè)建設(shè)發(fā)展及其種植效益的凸顯，社會對華山松的優(yōu)良種子需求會越來越多。近年來對葉枯病的研究較多，例如，張凡等[8]對落羽杉赤枯病的病原進(jìn)行了分離鑒定并分析了生物學(xué)特性。王忠民等[9]對油松的落針病、赤枯病病害進(jìn)行了調(diào)查，總結(jié)了發(fā)病的癥狀及規(guī)律。目前，對華山松的研究主要集中在其種子的結(jié)實量性狀、地理種群的遺傳變異、種子開花習(xí)性以及與華山松息息相關(guān)的昆蟲等方面[10-11]，對于華山松葉枯病此類病害研究鮮有報道。

準(zhǔn)確鑒定病原菌是研究病害發(fā)生規(guī)律及防治的基礎(chǔ)。林曉民等[12]和張志華等[13]提出了結(jié)合核酸序列在ITS區(qū)對病原菌進(jìn)行鑒定。本研究對楚雄紫溪山華山松種子園葉枯病的發(fā)生情況進(jìn)行調(diào)查，通過分離華山松葉枯病的病原，運(yùn)用形態(tài)學(xué)特征及分子生物學(xué)相結(jié)合的方法鑒定病原，同時在華山松幼苗上接種分離獲得的純培養(yǎng)物，驗證其致病性以初步探索華山松幼苗葉枯病的病原種類，為華山松病害防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試標(biāo)本及種子：2019年9月至2021年6月，在楚雄華山松無性系種子園采集癥狀明顯的病葉，用信封保存帶回實驗室；同時將華山松幼苗采集后用尼龍網(wǎng)袋帶回實驗室備用。

供試培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)(馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂17 g，蒸餾水1 000 mL)。

供試試劑：生工柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒、2× SanTaqPCR Mix、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn) Marker、4S Green Plus核酸染料、基因18SrRNA、β-tubulin(TUB)、glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (gpd)和Alta1引物，上述試劑盒及基因引物均購置于上海生工生物工程股份有限公司。

1.2 華山松幼苗葉枯病的調(diào)查

2019年9月至2021年6月，對華山松無性系種子園葉枯病的發(fā)生情況進(jìn)行調(diào)查，分別調(diào)查5個樣地，每個樣地隨機(jī)調(diào)查40株，每株在東南西北4個方向觀察華山松葉枯的病葉數(shù)，并根據(jù)危害的程度參照楊光道[14]分級標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行病害等級劃分(表1)。統(tǒng)計并整理5個樣地的發(fā)病株數(shù)，計算發(fā)病率及病情指數(shù)。

表1 華山松葉枯病的分級標(biāo)準(zhǔn)Table 1 The classification standard of leaf blight of Pinus armandii

1.3 華山松葉枯病病原菌分離及形態(tài)觀察

病原菌分離方法參照方中達(dá)[15]采用組織分離法。將消毒組織塊移至PDA平板中，在恒定的25 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待菌落長出后，接種針經(jīng)酒精燈外焰灼燒冷卻后挑取單菌落菌絲接種至PDA平板上純化2～3次，純菌落接種于試管斜面4 ℃保存。將純菌落重新接種至新的PDA平板上，在生化培養(yǎng)箱中25 ℃培養(yǎng)7 d，在顯微鏡下觀察培養(yǎng)菌株的分生孢子形態(tài)，并測量分生孢子的大小。肉眼觀察純培養(yǎng)物的菌絲顏色及是否分泌色素等性狀并做好記錄。

1.4 華山松葉枯病誘發(fā)性致病性試驗

利用柯赫式法則驗證病原菌的致病性。將獲得的菌株接種至PDA平板上，在25 ℃恒溫條件下培養(yǎng)10 d，用4 mL無菌水洗滌分生孢子后轉(zhuǎn)移至10 mL的離心管中，使用血球計數(shù)板計數(shù)后調(diào)節(jié)孢子懸浮液的濃度至1×107個/mL。把50%的甘油經(jīng)滅菌后與孢子懸浮液依照1∶4(v/v)充分混勻后備用。用75%的酒精將華山松幼苗的針葉進(jìn)行表面消毒自然干燥后，使用無菌的竹簽輕刺針葉至有微傷口，使用移液槍吸取2 mL孢子懸浮液置于噴瓶中，用2 mL孢子懸浮液等量噴5盆華山松幼苗針葉，每盆的體積為400 μL，使其孢子懸浮液均勻的噴霧至整株華山松幼苗針葉上，空白對照組噴霧等量體積的蒸餾水，接種病原菌組與對照組同時都設(shè)置3次重復(fù)。接種處理時先把單一菌株接種至華山松植株上，后將2個菌株相互交叉接種至華山松植株上，7 d后觀察發(fā)病情況，對出現(xiàn)相似癥狀的樣本進(jìn)行分離鑒定。

1.5 病原菌的形態(tài)學(xué)特征鑒定

選擇病癥病狀明顯的有效標(biāo)本，進(jìn)行徒手切片，在光學(xué)顯微鏡(尼康，上海)下觀察病原菌的分生孢子盤和分生孢子形態(tài)，并測量分生孢子的大小，使用手機(jī)拍照記錄。根據(jù)徒手切片所觀察的病原菌形態(tài)特征，結(jié)合文獻(xiàn)及書籍中所描述的病原菌形態(tài)特征，對病原菌種類進(jìn)行識別與鑒定，以確定病原菌的分類地位[16]。

1.6 病原菌的分子生物學(xué)鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

通過生工柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒提取病原菌DNA，以提取的DNA為模板擴(kuò)增18SrRNA、β-tubulin、gpd和Alta1基因。PCR反應(yīng)體系總體積為50 μL，反應(yīng)液為：2×SanTaqPCR Mix 25 μL，引物(10 μmol/L)各1.5 μL，模板DNA 2 μL，ddH2O 20 μL。PCR所用的基因引物、序列和反應(yīng)條件見表2。PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，將有條帶的產(chǎn)物送至昆明碩擎生物科技有限公司測序。將測序公司返回的結(jié)果利用DNAMAN 8拼接在一起并提交至NCBI進(jìn)行比對。從GenBank中選取并下載與菌株相關(guān)的ITS、β-tubulin、gpd和Alta1序列，利用MEGA 6中的鄰接法(Neighbor-Joining，NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，以1 000進(jìn)行bootstrap校驗。

表2 本研究PCR采用的引物及反應(yīng)條件Table 2 Primers and reaction conditions for PCR used in this study

2 結(jié)果與分析

2.1 華山松葉枯病調(diào)查

對華山松種子園及周邊地區(qū)的華山松葉部的發(fā)病情況進(jìn)行了跟蹤調(diào)查。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，該病害主要危害華山松的嫩葉。病原物多數(shù)由葉緣或葉尖開始侵染，發(fā)病時針葉初期呈現(xiàn)黃褐色小斑，后擴(kuò)大變成暗褐色，最后針葉整條枯死掉落(圖1)。對華山松葉枯病進(jìn)行專題調(diào)查，結(jié)果顯示，華山松種子園葉枯病的發(fā)病率為81.54%±0.144，病情指數(shù)為50.51±0.136。

注：a-d:針葉染病癥狀。圖1 華山松葉枯病癥狀Fig.1 Symptoms of leaf blight of P.armandii

2.2 華山松葉枯病致病菌分離鑒定

2.2.1 病原菌的分離 將華山松葉枯病的標(biāo)本在實驗室內(nèi)進(jìn)行病原菌分離。分離試驗共分離了60個平板，獲得5個菌株，分別標(biāo)號為HSS1-HSS5。出現(xiàn)的頻率分別是41.67%、33.33%、11.67%、8.30%和5.00%，其中HSS1號菌株出現(xiàn)頻率最高，HSS2號菌株出現(xiàn)頻率次高，并且明顯多于另外3個分離菌，為優(yōu)勢菌株。

2.2.2 柯赫式法則致病性驗證 將純化獲得的5種分離菌株進(jìn)行了致病性驗證試驗。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在5～7 d時，HSS1號菌株在華山松的葉片上首先表現(xiàn)出病癥，癥狀表現(xiàn)為華山松幼苗先從葉尖或者葉緣枯死，開始時為灰綠色，逐漸會有黃褐色病斑產(chǎn)生，最后針葉變?yōu)槌嗪稚⑶腋煽菥砬l(fā)病癥狀與自然條件下癥狀相同?；亟拥娜A山松幼苗葉枯部位經(jīng)再次分離后能獲得和原培養(yǎng)物一致的菌株，其菌落形態(tài)和菌絲顏色與原接種物HSS1號菌株一致，符合柯赫氏法則條件。該試驗結(jié)果表明，HSS1號真菌為引起華山松葉枯病的致病菌。同樣，對其他4個菌株進(jìn)行致病性驗證，除了HSS2得到和最初分離的純培養(yǎng)物一致，其余均不滿足柯赫式法則，表明HSS2號真菌也是引起華山松葉枯病的致病菌。將HSS1號菌株與HSS2號菌株相互交叉接種,結(jié)果發(fā)現(xiàn)2個菌株的幼苗發(fā)病均比單一接種的幼苗發(fā)病嚴(yán)重，表明HSS1號菌株與HSS2號菌株相互侵染會加重華山松葉枯病的發(fā)病程度(圖2)。

注：a為接種無菌水(對照組)；b為接種HSS1號菌株；c為接種HSS2號菌株；d為先接種HSS1號菌株后接種HSS2號菌株；e為同時接種HSS1和HSS2號菌株；f為先接種HSS2號菌株后接種HSS1號菌株。圖2 華山松幼苗接種分離菌株7 d后的癥狀Fig.2 Symptoms of P.armandii seedlings inoculated with isolated strains for 7 days

2.2.3 華山松葉枯病病原形態(tài)學(xué)鑒定 將HSS1病原菌種接種到PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，7 d時病原菌純菌落正面為白色，背面為淡黃色，有輪紋；10 d 時HSS1病原菌開始產(chǎn)孢，在菌落表面形成黑色濃稠黏液；將HSS2號菌接種到PDA培養(yǎng)基上，7 d時病原菌的純菌落正面中間為灰白色，邊緣灰黑色，菌絲絨毛狀；背面初期為白色，后期逐漸顏色加深變成黑色(圖3)。

注：a、b為HSS1號菌培養(yǎng)7 d菌落；c、d為HSS1號菌培養(yǎng)10 d菌落；e、f為HSS2號菌培養(yǎng)7 d菌落。圖3 病原菌在PDA培養(yǎng)基上純菌落形態(tài)Fig.3 Morphology of pure colony of pathogens on PDA medium

HSS1病原菌的分生孢子盤為黑色。分生孢子為紡錘形，有3～4個隔膜，由5個細(xì)胞組成，分生孢子平均大小為22.1 μm×6.1 μm，中間3個細(xì)胞呈淺褐色，長為13.2～17.9 μm。兩端細(xì)胞圓錐形，無色透明。分生孢子頂端細(xì)胞上著生2～3根無色附屬絲，頂端的附屬絲長9.4～18.2 μm，基部細(xì)胞上著生1根附屬絲，中生，長3.5～13.4 μm。HSS2號菌的分生孢子串生成鏈狀，基部稍鈍圓，有縱橫分隔，分生孢子大小平均為18.9～8.1 μm(圖4)。

注：a為HSS1號菌的分生孢子盤；b為HSS1號菌的分生孢子；c、d為HSS2號菌的分生孢子。圖4 華山松葉枯病病原菌的形態(tài)特征Fig.4 Morphological characteristics of pathogens of leaf blight of P.armandii

2.2.4 華山松葉枯病病原分子鑒定 聯(lián)合ITS和β-tubulin基因片段對HSS1號病原菌構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，菌株HSS1與P.lespedezae聚為一支，結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定和分子生物學(xué)鑒定結(jié)果，初步鑒定引起華山松葉枯病的HSS1號病原菌為胡枝子擬盤多毛孢(P.lespedezae)；聯(lián)合ITS、gpd和Alta1基因片段對HSS2號病原菌構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，菌株HSS2與A.alternata聚為一支，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征將HSS2號病原菌鑒定為互隔鏈格孢(A.alternata)(圖5、圖6)。

圖5 聯(lián)合ITS和β-tubulin基因片段對HSS1號病原菌構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree of HSS1 based on the concatenated data of ITS and β-tubulin sequences

圖6 聯(lián)合ITS、gpd和Alt a1基因片段對HSS2號病原菌構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6 Phylogenetic tree of HSS2 based on the concatenated data of ITS、gpd and Alt a1 sequences

3 結(jié)論與討論

對從華山松幼苗病葉上分離得到的真菌進(jìn)行了形態(tài)學(xué)鑒定及分子生物學(xué)鑒定，形態(tài)學(xué)鑒定與分子生物學(xué)鑒定結(jié)果一致，經(jīng)致病性測定，最后確定了引起華山松幼苗葉枯病的病原菌為胡枝子擬盤多毛孢(P.lespedezae)和互隔鏈格孢(A.alternata)。這在國內(nèi)華山松上屬于首次發(fā)現(xiàn)及報道。

近年來隨著華山松在我國種植面積的不斷擴(kuò)大，病害問題也愈發(fā)凸顯。華山松易感染葉枯病，該病引起葉片變黃、變枯，提前落葉，影響了華山松的生長發(fā)育。目前對華山松葉枯病的研究尚屬空白。本研究通過對華山松幼苗葉枯病的癥狀觀察、病原的形態(tài)學(xué)鑒定和分子生物學(xué)鑒定，確定了華山松葉枯病的病原為胡枝子擬盤多毛孢(P.lespedezae)和互隔鏈格孢(A.alternata)2種，這與匙明強(qiáng)等[17]報道的水杉赤枯病兩種病原為同屬的不同種。本研究為了明確P.lespedezae與A.alternata的關(guān)系，將P.lespedezae與A.alternata2個菌株相互接種，發(fā)現(xiàn)接種2個菌株的幼苗發(fā)病均比單一接種的幼苗發(fā)病嚴(yán)重，這也明確了P.lespedezae與A.alternata的關(guān)系：2個菌株均為引起華山松葉枯病的病原，當(dāng)2個菌株相互侵染華山松幼苗時會加重葉枯病的發(fā)病程度。經(jīng)過查閱相關(guān)的文獻(xiàn)資料發(fā)現(xiàn)，前人報道的油松[18]、馬尾松[19]、杉木[20-21]和樟子松[22]的發(fā)病特點及癥狀相似，表現(xiàn)在發(fā)病初期，葉片從葉尖開始發(fā)生干枯逐漸變成褐色，初期顯黃色段斑，病斑和健康組織交界處常有暗紅色的環(huán)圈，后期病葉表面產(chǎn)生黑色的小點，嚴(yán)重時導(dǎo)致華山松提前落葉或幼苗死亡。但不同的是病原是該病原菌同屬下的其他種，如引起油松和馬尾松赤枯病的病原為枯斑盤多毛孢(P.funerea)[18-19]。而引起樟子松赤枯病的病原為檸檬擬盤多毛孢(P.citrina)[22]。

擬盤多毛孢屬Pestalotiopsissp.是一類重要的病原菌，它會引起植物葉斑和葉枯癥狀，嚴(yán)重時導(dǎo)致植物死亡[23-24]。目前，對于擬盤多毛孢屬形態(tài)鑒定有一定的難度，分子鑒定方面基于ITS基因鑒定得較多，但是現(xiàn)階段僅靠ITS基因鑒定無法更好地鑒定屬內(nèi)的親緣種[25]。本研究基于ITS和β-tubulin2個基因聯(lián)合構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征，更加準(zhǔn)確地鑒定了胡枝子擬盤多毛孢(P.lespedezae)是引起華山松葉枯病的病原之一。鏈格孢屬(Alternariasp.)的真菌在形態(tài)上很容易根據(jù)形態(tài)特征鑒定到屬，如若需要準(zhǔn)確鑒定到種的水平較難，這是因為小孢子種間序列相似性高，僅僅依靠ITS基因序列分析不能將小孢子種更好地區(qū)別開[26]。此時便需要結(jié)合多個基因引物來鑒定到種。本研究采用多對引物來擴(kuò)增產(chǎn)物并聯(lián)合ITS、gpd和Alta1多基因構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征準(zhǔn)確鑒定了互隔鏈格孢(A.alternata)是引起華山松葉枯病的另一個病原。本研究通過形態(tài)鑒定與分子鑒定相結(jié)合的方法明確了引起華山松葉枯病的病原菌，這為之后進(jìn)一步研究病原菌的其他特性奠定了基礎(chǔ)，同時也為之后病害的防治提供了理論依據(jù)。