朱立華，劉召陽，劉 維，張賢玉，黃麗麗，馮 浩

(西北農林科技大學 植物保護學院 旱區(qū)作物逆境生物學國家重點實驗室，陜西 楊陵 712100)

由子囊菌蘋果黑腐皮殼(ValsamaliMiyabe et Yamada)引起的蘋果樹腐爛病是一種嚴重影響蘋果健康生產的重大枝干病害。該病害主要危害果樹枝干皮層部分，造成樹皮腐爛壞死，甚至枝枯樹死[1]。深入解析病菌致病機理，對病害防控新策略制定和新技術研發(fā)具有重要指導意義。

轉錄因子(transcription factor，TFs)是轉錄過程中重要的基因表達調控因子。探究蘋果樹腐爛病菌侵染過程中轉錄因子的表達及功能，有助于深入解析病菌侵染致病機理。前期研究發(fā)現(xiàn)轉錄因子在V.mali生長發(fā)育和侵染致病過程中發(fā)揮重要作用。VmSeb1缺失突變體的生長速率和致病力較野生型顯著降低[2]。而轉錄因子VmPacC廣泛參與各種生物途徑，特別是V.mali酸化其定殖環(huán)境和致病力所必須的[3]。重要的是，Zn(Ⅱ)2Cys6類轉錄因子Vmtf36、Vmtf312、Vmtf1034參與調節(jié)V.mali的生長發(fā)育，而Vmtf81參與調節(jié)病原菌致病力[4]。

鋅指蛋白是指蛋白含有鋅元素且能夠與DNA結合，在轉錄和翻譯過程中發(fā)揮重要作用的轉錄因子，存在于許多真菌生物中，如稻瘟病菌(Magnaportheoryzae)、構巢曲菌(Aspergillusnidulans)、淡紫色擬青霉(Paecilomyceslilacinus)、黃曲霉(Aspergillusflavus)和甲醇酵母(Pichiapastoris)等[5-9]。Macpherson等根據(jù)鋅指結合基序將鋅結合蛋白分為Cys2His2(C2H2)、Cys4(C4)和Cys6(C6)三大類[10]。Zn(Ⅱ)2Cys6鋅指轉錄因子的基序為Cys-X2-Cys-X6-Cys-X5-12-Cys-X2-Cys-X6-8-Cys，是真菌所特有的一類轉錄因子[8]。

本試驗前期通過RNA-seq技術對菌絲體和病菌-蘋果互作24 h的2組樣本進行轉錄組測序分析，發(fā)現(xiàn)屬于Zn(Ⅱ)2Cys6家族的Vmzctf-07在侵染過程中穩(wěn)定上調表達[11]。然而，Vmzctf-07是否參與V.mali的生長發(fā)育、非生物脅迫應答及致病功能目前尚不明確。為此，本研究首先通過酵母單雜交和亞細胞定位對Vmzctf-07的轉錄激活功能和亞細胞定位進行解析，并通過構建其基因缺失和回補突變體探究該基因在病原菌生長、脅迫應答和致病力方面的功能。研究結果能夠為深入解析蘋果樹腐爛病菌Zn(Ⅱ)2Cys6類轉錄因子的功能奠定重要基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株和質粒 蘋果樹腐爛病菌野生型強致病菌株03-8以及相關質粒pCAMBIA1302-GFP、pGBKT7、pFL2、pDL2等均由西北農林科技大學植物保護學院植物病害綜合治理實驗室提供。

1.1.2 試劑 ChamQTM SYBR?qPCR Master Mix試劑盒，phanta max super-fidelity DNA polymerase，ClonExpress Ⅱ one step cloning kit，購于南京諾唯贊生物科技股份有限公司；QuickCut限制酶購于TAKARA公司；DH5α感受態(tài)細胞購于北京擎科生物科技有限公司；GV3101感受態(tài)細胞購于北京康為世紀生物科技有限公司。

1.1.3 儀器 Tissue lyser-96全自動樣品快速研磨儀，上海凈信科技；Olympus FV1000激光共聚焦顯微鏡，OLYMPUS公司；電轉化儀，美國Bio Rad公司；PCR儀，美國Thermo公司。

1.1.4 引物設計 本試驗所用引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 轉錄激活域驗證 以病健交界處組織的cDNA為模板，利用Vmzctf07-up-F/R、Vmzctf07-between-F/R、Vmzctf07-down-F/R等引物分別進行目的片段的擴增。使用QuickCut限制酶NdeI和SalI雙酶切pGBKT7載體，酶切體系及PCR反應程序參見說明書。使用ClonExpress Ⅱ one step cloning kit進行目的片段與線性化載體的連接。將連接產物熱激轉化至DH5α感受態(tài)細胞中，隨后涂布于含有卡那霉素的LB平板，37 ℃培養(yǎng)16～20 h后挑取單菌落檢測，并將檢測正確的單菌落搖菌并提取質粒，送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。

參考YeastmakerTMYeast transformation system 2 User Manual方案制備AH 109酵母感受態(tài)，并進行熱激轉化，取150 μL酵母菌液涂于SD/Trp培養(yǎng)基平板，3 d后將陽性克隆菌株避光點板于含有X-α-gel的SD-Trp-His-Ade的平板，以pGBKT7空載為對照，30 ℃避光培養(yǎng)3～4 d。

1.2.2 亞細胞定位觀察 以03-8菌株侵染的蘋果枝條cDNA為模板，以Vmzctf07-1302-F/R為引物進行目的片段擴增。使用QuickCut限制酶NcoI和SpeI雙酶切pCAMBIA1302-GFP載體，參考1.2.1方法構建表達載體。將測序正確的重組質粒電擊轉化到農桿菌感受態(tài)GV3101并獲得陽性克隆農桿菌菌液。

利用農桿菌介導的本氏煙瞬時表達系統(tǒng)，以pCAMBIA1302-GFP為對照，在5 mL含有卡那霉素和利福平抗生素的LB液體培養(yǎng)基中加入100 μL pCAMBIA-1302:Vmzctf-07農桿菌菌液，180 r/min，28 ℃過夜培養(yǎng)。菌液搖至OD600為0.6時，6 000 r/min離心5 min，收集菌體，用10 mmol/L的MgCl2溶液洗滌菌體，6 000 r/min離心5 min，重復2次，隨后用含有終濃度為10 mmol/L的MES緩沖液懸浮菌體，調節(jié)OD600為0.2～0.6，黑暗靜置3 h。菌液注射于4～5周齡健康煙草葉片背面，注射48 h后，在激光共聚焦顯微鏡下觀察熒光表達情況。

表1 試驗所用引物Table 1 Primers used in this study

圖1 轉錄因子Vmzctf-07分段Fig.1 Sequence segmentation of Vmzctf-07

1.2.3 基因缺失突變體構建 采用Double-joint PCR技術構建基因敲除載體[12]。以質粒pFL2為模板，以EX-G418-F/R為引物擴增報告基因neo；以03-8菌絲DNA為模板，用引物Vmzctf-07-1F/2R與Vmzctf-07-3F/4R擴增該基因的up與down片段。將up與down片段與neo片段進行連接，構建“up-neo-down”基因敲除盒載體并保存在-20 ℃冰箱備用。

參考宋娜等[13]方法制備原生質。參照高靜等[14]方法進行PEG介導的原生質體遺傳轉化。以G418作為篩選抗生素，將Vmzctf-07敲除載體轉化至03-8的原生質體中。

1.2.4 缺失突變體檢測 以提取轉化子DNA為模板，以Vmzctf-07-5F/6R為引物進行初篩檢測，將獲得的候選陽性轉化子，再分別以Vmzctf-07-5F/6R(檢測目的基因)、G418-F/R(檢測標記基因neo)、Vmzctf-07-7F/G418-R(檢測上游重組)和G418-F/Vmzctf-07-8R(檢測下游重組)為4對引物進行PCR檢測，若檢測候選轉化子目的基因片段無條帶，但抗性片段和兩翼重組片段處出現(xiàn)正確條帶，則表明Vmzctf-07基因被成功敲除。

1.2.5 突變體回補 以野生型03-8菌絲基因組DNA為模板，以HB-Vmzctf-07-F/R為引物擴增目的基因和目的基因前1.5 kb的回補片段，使用XhoI酶切pDL2載體，并將回補片段鏈接在pDL2質粒上，構建回補載體。以Vmzctf-07突變體菌株制備原生質，以潮霉素B為篩選抗生素，將回補載體轉化進Vmzctf-07突變體的原生質。

1.2.6 生長速率測定 從活化的野生型03-8、敲除突變體及回補突變體菌落邊緣打取菌餅(Φ=5 mm)，分別接種于PDA固體培養(yǎng)基中，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，2 d后觀察并測量菌落直徑，使用SPSS 20.0軟件分析數(shù)據(jù)。試驗設置3次生物學重復。

1.2.7 非生物脅迫(NaCl與H2O2)測定 參考馬晨琛[4]的方法，配置含0.1 mol/L NaCl的PDA固體培養(yǎng)基，用于測定Vmzctf-07的滲透脅迫。測定Vmzctf-07的氧化脅迫時，因H2O2易熱解，需先配置含10 g/L 的PDA培養(yǎng)基，待培養(yǎng)基溫度降至40～50 ℃后再加入H2O2，使H2O2終濃度為12 mmol/L。以PDA為對照，按1.2.1方法活化菌株，將各突變體、回補突變體和野生型菌株分別接種在相對應的培養(yǎng)基上，按1.2.7方法測定生長速率，試驗設置3次生物學重復。用SPSS 20.0分析數(shù)據(jù)，按下列公式計算抑制率：

抑制率={1-[(對照菌落直徑-5)-(處理菌落直徑-5)]/(對照菌落直徑-5)}×100%

1.2.8 敲除突變體致病力測定 參考臧睿等接種方法[15]，將野生型03-8、敲除突變體及回補突變體菌餅(Φ=5 mm)接種于枝條傷口處，黑暗條件下，25 ℃保濕培養(yǎng)，4 d后用手術刀輕輕刮除病部表皮層，記錄枝條病斑長度。試驗設置3次生物學重復。

2 結果與分析

2.1 Vmzctf-07轉錄激活域驗證

利用Vmzctf-07全長、up、between和down片段分別構建pGBKT7重組載體，進而利用酵母單雜交技術檢測轉錄因子Vmzctf-07的激活功能。結果如圖2所示，攜帶Vmzctf-07的down片段和全長total的AH109酵母轉化菌株均能在加有X-α-gel的SD-Trp-His-Ade缺陷培養(yǎng)基上生長并變藍，說明Vmzctf-07具有轉錄激活功能，其轉錄激活域可能存在于down區(qū)段。

圖2 Vmzctf-07轉錄激活域驗證Fig.2 Transcription activation domain verification of Vmzctf-07

2.2 Vmzctf-07亞細胞定位

在488 mm激發(fā)光波下觀察綠色熒光，結果如圖3所示，在本氏煙草葉片瞬時表達48 h后，發(fā)現(xiàn)對照組pCAMBIA-1302:GFP熒光定位在細胞核和細胞膜上，重組載體菌株pCAMBIA-1302:Vmzctf-07熒光定位于細胞核。

圖3 Vmzctf-07定位于植物細胞核Fig.3 Vmzctf-07 is localized in plant cell nucleus

2.3 Vmzctf-07敲除突變體構建

利用PEG介導的原生質體轉化技術構建Vmzctf-07的缺失突變體。經(jīng)G418抗生素進行2次篩選，共獲得1 339個轉化子。如圖4所示，經(jīng)過5F/6R初步篩選后，利用4對引物共同檢測，最終獲得4個Vmzctf-07敲除突變體，分別命名為Vmzctf-07-87、Vmzctf-07-88、Vmzctf-07-89、Vmzctf-07-91。

注:1為5F/6R引物檢測；2為G418-F/R引物檢測；3為7F/G418-R引物檢測；4為G418-F/8R引物檢測。圖4 Vmzctf-07敲除突變體PCR檢測Fig.4 PCR detection of Vmzctf-07 knockout mutant

2.4 Vmzctf-07回補突變體構建

選取Vmzctf-07-89、Vmzctf-07-91 2個敲除突變體進行回補試驗，用潮霉素B和G418抗生素共同進行篩選。檢測結果如圖5所示，以目的基因的5F/6R為引物進行PCR驗證，獲得2個正確的回補菌株，分別為HB-Vmzctf-07-89和HB-Vmzctf-07-91。

圖5 回補突變體PCR檢測Fig.5 PCR detection of gene-replenishing mutants

2.5 Vmzctf-07生長速率測定

分別將野生型03-8菌株、Vmzctf-07缺失突變體和回補突變體菌株接種于PDA平板上并測量各自菌落直徑。結果如圖6所示，與野生型03-8菌株相比，Vmzctf-07敲除突變體的生長速率下降33.79%，缺失突變體菌株的生長速率與野生型差異顯著(P=0.05)，而回補突變體與野生型03-8菌株的生長速率差異不顯著。

圖6 Vmzctf-07突變體生長速率測定Fig.6 Growth rate determination of Vmzctf-07 mutants

2.6 非生物脅迫(NaCl與H2O2)測定

野生型菌株03-8在0.1 mol/L的NaCl脅迫下，生長速率平均下降48.91%，Vmzctf-07基因缺失突變菌株在0.1 mol/L的NaCl脅迫下生長抑制率高達65.86%，相比于野生型，抑制率提高了16.95%，Vmzctf-07基因缺失突變體的抑制率與野生型差異顯著(P=0.05)，基因回補菌株抑制率與野生型差異不顯著(P=0.05)。

野生型菌株03-8在12 mmol/L的H2O2脅迫下，生長速率平均下降7.06%，Vmzctf-07缺失突變菌株的生長速率下降25.92%，基因缺失突變體的抑制率與野生型相比差異顯著(P=0.05)，回補菌株與野生型差異不顯著(P=0.05)。

2.7 致病力測定

通過接種離體枝條法測定Vmzctf-07的敲除突變體、回補突變體和野生型菌株的致病力，結果如圖9所示，Vmzctf-07的4個敲除突變體菌株的致病力與野生型菌株的致病力差異顯著(P<0.05)，敲除突變體致病力平均下降了36.99%，而回補突變體菌株均恢復了致病力，與野生型菌株的致病力差異不顯著。

圖7 Vmzctf-07突變體非生物脅迫響應測定Fig.7 Abiotic stress response of Vmzctf-07 mutants

圖8 非生物脅迫對Vmzctf-07缺失突變體生長速率分析Fig.8 Analysis of abiotic stress on the growth rate of Vmzctf-07 deletion mutants

圖9 Vmzctf-07突變體致病力測定Fig.9 Pathogenicity test of Vmzctf-07 mutants

3 結論與討論

Vmzctf-07具有轉錄激活功能，發(fā)揮轉錄激活功能的區(qū)域可能位于down區(qū)段(aa 1 455～aa 1 644)；Vmzctf-07定位于細胞核具備轉錄因子定位特征；成功構建4個Vmzctf-07缺失突變體(Vmzctf-07-87、Vmzctf-07-88、Vmzctf-07-89、Vmzctf-07-91)和2個回補菌株(HB-Vmzctf-07-89和HB-Vmzctf-07-91)。分析表明，Vmzctf-07參與調控V.mali的菌絲生長、非生物脅迫響應和致病過程。

蘋果黑腐皮殼菌是一種弱寄生真菌，在侵染寄主時通過釋放細胞壁降解酶、毒素、效應蛋白和milRNA等物質協(xié)助入侵[16-21]。此外，轉錄因子也可參與調控病原真菌細胞內多種信號轉導過程。研究發(fā)現(xiàn)，真核生物轉錄因子的蛋白結構組成一般包含轉錄激活或抑制域(activating domain，AD)和DNA結合域(DNA binding domain，BD)2個相對獨立的片段及1個核定位信號(nuclear localization signal，NLS)[22-23]。AD域一般位于蛋白的C端酸性氨基酸區(qū)、谷氨酸富集區(qū)、N端的絲氨酸-蘇氨酸富集區(qū)和脯氨酸富集區(qū)[24]。轉錄因子能與真核生物啟動子區(qū)特定的DNA序列結合，調控靶基因的轉錄，本研究表明Vmzctf-07基因能夠激活下游報告基因的表達，具有轉錄激活活性，且轉錄激活域可能位于蛋白肽鏈的C端(down區(qū)域)，這也為研究該基因的功能和篩選與其互作的蛋白提供了一定基礎。

研究發(fā)現(xiàn)，Zn(Ⅱ)2Cys6類轉錄因子參與真菌的生長發(fā)育、對外界的脅迫應答、致病性等過程。Habig等[25]發(fā)現(xiàn)小麥葉枯病菌(Zymoseptoriatritici)中的轉錄因子Zt107320影響Z.tritici的生長。細葉百合(Liliumpumilum)中轉錄因子LpWRKY20參與調節(jié)百合鱗莖休眠解除進程[26]。本研究通過測定Vmzctf-07的缺失突變體和回補突變體菌株的生長速率，結果發(fā)現(xiàn)Vmzctf-07敲除突變菌株生長速率顯著下降，表明其參與調控V.mali的生長發(fā)育，與前人研究結果一致。蘋果樹腐爛病菌轉錄因子Vmtf28、Vmtf81、Vmtf315、Vmtf544、Vmtf898、Vmtf1034和Vmtf1049參與V.mali鹽離子脅迫應答[4]。姚權等[27]將果生刺盤孢菌(Colletotrichumfructicola)中CfHac1基因敲除后，發(fā)現(xiàn)敲除突變體ΔCfhac1對山梨糖醇和KCl滲透壓脅迫敏感性增加。稻瘟病菌(M.oryzae)中轉錄因子的Moapl，具有YAP1轉錄因子的保守結構域，其敲除突變體會降低對H2O2的耐受性[28]。李雪等[29]發(fā)現(xiàn)小麥條銹菌(Pucciniastriiformisf.sp.tritici) Zn(Ⅱ)2Cys6類轉錄因子PSTG-00514正調控條銹菌耐高溫脅迫。轉錄因子還參與調節(jié)植物的干旱脅迫，干旱可誘導擬南芥rd29A基因的表達[30-31]。本研究發(fā)現(xiàn)，在0.1 mol/L的NaCl和12 mmol/L的H2O2脅迫下，Vmzctf-07基因缺失突變體與回補突變體相比，生長速率均顯著下降。綜上，說明真菌轉錄因子對多種非生物脅迫有一定的影響。Lu等[32]敲除稻瘟病菌(M.oryzae)中Zn(Ⅱ)2Cys6類轉錄因子CNF1和CNF2后，突變體菌株降低了水稻的致病力。此外，Chambers等[33]研究發(fā)現(xiàn)油菜莖基潰瘍病菌(Leptosphaeriamaculan)Zn(Ⅱ)2Cys6類轉錄因子ptf1通過體外傳代過程中發(fā)生的堿基對取代從而導致病原菌的致病性減弱。Vmzctf-07缺失突變體對蘋果枝條的侵染致病減弱，說明其同樣會參與V.mali的致病過程。