孔思雨，廖慧玲，賈宗昀，周 瑩

(云南大學(xué) 化學(xué)科學(xué)與工程學(xué)院，云南 昆明 650091)

心肌黃酶（DT-diaphorase，DTD）是一種同源二聚體和細(xì)胞質(zhì)黃素蛋白酶，廣泛分布和存在于幾乎所有動物的組織中[1].它利用還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）或還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）作為電子供體，催化各種醌類、醌類環(huán)氧化合物和芳香硝基化合物的雙電子還原[2-3]，阻止醌類自由基和醌類自由基引發(fā)的超氧陰離子的生成[4].DTD 能阻止或減少自由基產(chǎn)生，保護(hù)細(xì)胞免受損傷，因此它通常被認(rèn)為是一種保護(hù)酶[5].另一方面，與正常組織相比，DTD 在許多腫瘤組織中都有過表達(dá)，尤其是在非小細(xì)胞肺癌、直腸癌、肝癌和乳腺癌中[6].由于DTD 在腫瘤和正常組織之間的差異，該酶作為靶向抗癌治療的潛在候選酶而受到了廣泛的關(guān)注[7-11].

傳統(tǒng)的檢測心肌黃酶的方法通常具有前處理繁雜，檢測過程耗時(shí)長，檢測費(fèi)用昂貴等缺點(diǎn).熒光探針作為一種簡便，快速，經(jīng)濟(jì)的檢測方法，其特點(diǎn)可用于彌補(bǔ)傳統(tǒng)方法的不足.熒光探針可用于生物科學(xué)的基礎(chǔ)研究、新藥開發(fā)，食品安全和環(huán)境質(zhì)量保障，疾病的臨床診斷等[12].理想的熒光探針應(yīng)具有靈敏度高、選擇性好、響應(yīng)時(shí)間短等的基本要求.在活體成像中，可見光或近紅外區(qū)域的熒光探針具有對細(xì)胞損傷小、組織穿透性強(qiáng)和自發(fā)熒光背景低等優(yōu)點(diǎn).然而，由于某些生物分子的復(fù)雜結(jié)構(gòu)，如何合理地設(shè)計(jì)出同時(shí)滿足靈敏度和選擇性的熒光探針仍然是一個挑戰(zhàn).

目前，有關(guān)心肌黃酶的探針研究工作并不多見.已有報(bào)道的心肌黃酶探針在實(shí)際檢測過程中表現(xiàn)出靈敏度較低的缺陷，且大多數(shù)探針的發(fā)射波長很短，生物成像信號很容易被生物體內(nèi)的自發(fā)熒光掩蓋，這嚴(yán)重影響了細(xì)胞內(nèi)心肌黃酶活性檢測的準(zhǔn)確性和靈敏度.因此，設(shè)計(jì)合成靈敏度高、檢測限低和具有較長發(fā)射波長的檢測心肌黃酶的近紅外熒光探針具有重要意義[13].本文設(shè)計(jì)的探針以三甲基醌（TLQ）衍生物充當(dāng)敏感的氧化還原反應(yīng)位點(diǎn)[14]，心肌黃酶可以迅速觸發(fā)探針的內(nèi)酯化反應(yīng)，生成二氫香豆素衍生物，熒光團(tuán)被釋放的同時(shí)發(fā)出熒光信號.在體外光譜實(shí)驗(yàn)中，加入心肌黃酶后，MITZ 1最大發(fā)射波長770 nm 處的熒光值不斷增加，熒光強(qiáng)度增加約4.8 倍.后續(xù)實(shí)驗(yàn)證明探針MITZ 1可以在NADH 的存在下對內(nèi)源及外源性心肌黃酶進(jìn)行專一識別，并成功應(yīng)用于細(xì)胞與秀麗隱桿線蟲的生物成像實(shí)驗(yàn)中.系列實(shí)驗(yàn)表明MITZ 1具有高靈敏度、高選擇性、低檢測限（低至0.01 U/mL）等優(yōu)點(diǎn)，是一個良好的心肌黃酶近紅外熒光探針.該探針可以通過直接測量心肌黃酶的含量變化，進(jìn)而間接檢測細(xì)胞內(nèi)的低氧程度，具有較好的臨床應(yīng)用前景.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器本文中所提及到的和所使用的藥品均為市售分析純，購買后不經(jīng)任何處理直接用于實(shí)驗(yàn).心肌黃酶購于上海源葉科技有限公司，S1007-2 KU（20 mg）.

AB204-N 分析天平（梅特勒托利多）；DF-101加熱型磁力攪拌器（鞏義允華）；DZF-6020 真空干燥箱（上海熠男儀器）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（EYELAN-1100）；高分辨質(zhì)譜儀（Agilent100LC/MSD TOF）；核磁共振儀（Bruker DRX 500）；紫外可見分光光度計(jì)（島津UV-240IPC）；熒光可見分光光度計(jì)（F97XP）；熒光正置顯微鏡（Olympus BX51）；激光共聚焦顯微鏡（Olympus FV-10i）；柱層析分離硅膠 0.054～0.077 mm(200～300 目，青島基億達(dá)硅膠試劑材料公司）.

1.2 化合物的合成與表征

1.2.1 MITZ 1 的合成 合成路線如圖1 所示.

圖1 探針MITZ 1 的合成路線Fig.1 Synthesis routes of MITZ 1

化合物MB 的合成：取一個雙口瓶在冰浴條件下加入11.2 mL N，N-二甲基甲酰胺（DMF）和50 mL三氯甲烷，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下向反應(yīng)體系中緩慢滴加三溴化硼（12.4 mL，130.5 mmol），室溫反應(yīng)45 min 后，向反應(yīng)體系中滴加環(huán)己酮（5 mL，48.4 mmol），室溫反應(yīng)過夜.將反應(yīng)液緩慢倒入50 mL 冰水中淬滅，加入飽和碳酸氫鈉溶液中和反應(yīng)液并用二氯甲烷（DCM） 萃取，真空濃縮得橙紅色油狀化合物 MB.

化合物MC 的合成：取化合物 MB（1.6 g，8.5 mmol）和2-羥基-4-甲氧基苯甲醛（1.1 g，7.2 mmol）溶于30 mL DMF 中，加入催化劑碳酸銫（7.04 g，21.6 mmol），室溫反應(yīng)過夜.將反應(yīng)液用DCM 萃取，層析柱法純化（洗脫劑DCM），得黃色固體MC.

化合物MD 的合成：冰浴條件下，將化合物MC 溶于30 mL 無水DCM 中，氮?dú)獗Ｗo(hù)后緩慢滴加三溴化硼（600 mg，2.4 mmol），反應(yīng)過夜.將反應(yīng)液緩慢倒入50 mL 冰水中淬滅，加入飽和碳酸氫鈉溶液中和反應(yīng)液并用DCM 萃取，層析柱法純化（VDCM∶V甲醇=50∶1），得橙色固體 MD，產(chǎn)率70%.

化合物XD-J2 的合成：取化合物 TCF （200 mg，1 mmol）和化合物 MD （228 mg，1 mmol）溶于30 mL無水乙醇中，向反應(yīng)體系中加入0.5 mL 冰醋酸和1 mL 哌啶，氮?dú)獗Ｗo(hù)下 80 ℃回流4 h，層析柱法純化（VDCM∶V甲醇=100∶1），得綠色固體 XD-J2，產(chǎn)率 88%.

探針MITZ 1的合成：取化合物XD-J2（205 mg，0.5 mmol）和化合物 MH（125 mg，0.5 mmol）在催化劑4-二甲氨基吡啶（DMAP）催化下于30 mL DCM中室溫反應(yīng)1 h 后，向反應(yīng)體系加入1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亞胺（EDC）（145 mg，0.75 mmol），室溫過夜反應(yīng)得到化合物，粗產(chǎn)物層析柱法純化（洗脫劑DCM）得黑色固體MITZ 1，產(chǎn)率80%.

目標(biāo)探針的表征結(jié)果：1H NMR（400 MHz，氘代氯仿CDCl3）δ：8.54～8.50（d，J=15.6 Hz，1 H），7.20～7.18（d，J=8.4 Hz，1 H），6.88（d，J=1.6 Hz，2 H），6.81～6.19（m，2 H），6.15～6.11（d，J=15.6 Hz，1 H），3.28（s，2 H），2.66～2.63（t，J=5.8 Hz，2 H），2.53～2.50（t，J=6.0 Hz，2 H），2.18（s，3 H），1.94～1.93（d，J=4.0 Hz，6 H），1.87～1.84（m，2 H），1.57（s，2 H），1.71（s，6 H），1.53（s，6 H）.13C NMR（100 MHz，CDCl3）δ：0.04，12.23，12.71，14.48，20.36，23.96，26.76，26.98，29.13，29.49，39.55，47.66，96.69，109.67，109.76，113.41，118.47，119.57，127.36，128.26，129.82，138.85，139.70，141.82，142.75，151.44，152.23，153.21，157.23，171.03，173.84，176.63，187.45，190.75.HEMS（ESI） C39H35N3O6[M+Na]+（m/z）：計(jì)算值664.241 4，實(shí)測值664.241 4.

化合物TCF，MH 的合成詳見文獻(xiàn)[15].

1.3 溶液的配制探針母液的配制：準(zhǔn)確稱取探針MITZ 1（6.41 mg）、探針MITZ 2（5.72 mg）和探針MITZ 3（5.92 mg），分別溶解于5 mL 的二甲基亞砜（DMSO）中，配制成濃度為 2×10-3mol/L 的母液待測液.

心肌黃酶的配制：準(zhǔn)確稱取心肌黃酶凍干粉5 mg，溶解于 1 mL 的超純水中，配制成 500 U/mL的待測液.

酰胺腺嘌呤二核苷酸 NAD（P）H 的配制：準(zhǔn)確稱取NADH 33 mg，溶解于5 mL 的超純水中，配制成 0.01 mol/L 的輔助測試液.

2 結(jié)果與討論

2.1 探針在心肌黃酶不同酶活力單位下的熒光光譜圖取一個 10 mL 的試管，配制5 mL 體積比為5∶5 的DMSO-磷酸鹽緩沖液（PBS）（0.1 mol·L-1，pH=7.4）體系，向其中加入50 mL 2×10-3mol/L 的探針MITZ 1混合均勻，并加入0.5 mmol·L-1NADH輔助測試液.將配制好的不同酶活力單位的心肌黃酶溶液逐次滴加入測試體系孵育15 min 后測試相應(yīng)的熒光光譜，待熒光強(qiáng)度不再變化時(shí)停止測試.（激發(fā)波長：585 nm，狹縫寬度：5 nm×10，電壓900 V）.如圖2（a）所示，隨著不同酶活的心肌黃酶的加入，在最大發(fā)射波長 770 nm 處的熒光值不斷增加，當(dāng)心肌黃酶的酶活力達(dá)到 2 U/mL 時(shí)，熒光強(qiáng)度不再發(fā)生變化，該測試體系中酶活力用量達(dá)到飽和，熒光強(qiáng)度增加了約4.8 倍.因此，在NADH 的存在下，探針MITZ 1與心肌黃酶作用后可以產(chǎn)生較強(qiáng)的熒光響應(yīng).

圖2 探針在心肌黃酶不同酶活力單位下的熒光光譜和紫外光譜Fig.2 Emission spectra and Uv-vis absorbance of probe on different unit of diaphorase enzyme activity

2.2 探針在心肌黃酶不同酶活力單位下的紫外光譜圖我們利用島津UV-240IPC 測定探針的紫外吸收光譜，測試條件為體積比5∶5 的DMSO-PBS（0.1 mol·L-1，pH=7.4）溶液.如圖2（b）所示，隨著心肌黃酶的不斷加入，肉眼可見測試體系由深藍(lán)色變?yōu)樘焖{(lán)色，當(dāng)酶的活力達(dá)到2 U/mL 時(shí)，吸光波長不再發(fā)生改變，測試體系達(dá)到飽和.可以得出在酶活力較低的情況下，探針MITZ 1對心肌黃酶也產(chǎn)生了專一性的識別，心肌黃酶能使探針發(fā)生斷鍵，使得體系呈現(xiàn)了熒光團(tuán)自身的天藍(lán)色.

2.3 探針MITZ 1 對心肌黃酶的檢出限測試如圖3（a）所示，將探針的濃度降低一個數(shù)量級，取最大發(fā)射波長 770 nm 處的熒光值，以DTD 的濃度為橫坐標(biāo)，對應(yīng)的熒光值為縱坐標(biāo)，得到一條線性相關(guān)的直線，線性方程為y=10.36+188.59x，表明DTD濃度與對應(yīng)的熒光值具有良好的線性關(guān)系（R2=0.989 4）.基于國際純粹與應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會（IUPAC）規(guī)定的檢出限（LOD）公式 LOD=3σ/k[16-17](σ表示空白試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)偏差，k表示熒光強(qiáng)度與心肌黃酶濃度之間校準(zhǔn)曲線的斜率)，計(jì)算可得到該反應(yīng)的檢測限為0.01 U/mL，心肌黃酶的低檢測限表明MITZ 1具有較高的靈敏度.

2.4 探針MITZ 1 的干擾性探究為探究本文所開發(fā)的探針用于生物體內(nèi)心肌黃酶響應(yīng)熒光成像的應(yīng)用潛力，接下來對探針MITZ 1進(jìn)行了干擾實(shí)驗(yàn)探究.用移液槍準(zhǔn)確移取MITZ 1母液50 μL 配制成 5 mL 體積比為5∶5 的 DMSO-PBS （0.1 mol·L-1，pH=7.4）測試體系，平行配制14 個.分別加入50 μL濃度為0.01 mol/L 的干擾物丙氨酸（L-Ala），谷氨酸（L-Glu），谷胱甘肽（GSH），半胱氨酸（Cys），過氧化氫（H2O2），F(xiàn)-，Cl-，Br-，K+，F(xiàn)e3+，NO3-，CO32-，ClO-，NADH+DTD，并在37 ℃的恒溫水浴鍋中孵育15min，測試相應(yīng)的紫外吸收光譜及熒光光譜.如圖3（b）、（c）所示，在探針MITZ 1測試體系中，只有心肌黃酶和NADH 同時(shí)存在時(shí)，熒光才能得以釋放，其他分析物并不會使熒光釋放，可以確定探針MITZ 1具有識別心肌黃酶的專一性并且選擇性較高.如圖3（d）所示，探針MITZ 1測試體系中，只有心肌黃酶和NADH 同時(shí)存在時(shí)紫外吸收才會發(fā)生明顯的變化，其他分析物并不會使紫外吸收明顯發(fā)生紅移，可以確定MITZ 1具有識別心肌黃酶的專一性.

圖3 探針MITZ 1 在測試體系中的線性曲線、熒光光譜、熒光值柱狀圖和紫外吸收光譜Fig.3 Fluorescence linear graph，fluorescence spectra，fluorescence enhancement and Uv-vis absorbance of probe in the test system

2.5 探針的作用機(jī)制MITZ 1以三甲基醌衍生物充當(dāng)敏感的氧化還原反應(yīng)位點(diǎn)，探針分子上的三甲基氫醌在心肌黃酶作用下被還原的同時(shí)電子轉(zhuǎn)移導(dǎo)致熒光團(tuán)與氫醌結(jié)構(gòu)分離，抑制光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移過程，生成二氫香豆素衍生物，最終導(dǎo)致熒光恢復(fù)[18].見圖4.

圖4 探針MITZ 1 與心肌黃酶反應(yīng)的機(jī)理圖Fig.4 Mechanism diagram of reaction of probe MITZ 1 with diaphorase

2.6 MITZ 1 的細(xì)胞毒性研究為了實(shí)現(xiàn)探針MITZ 1的生物學(xué)應(yīng)用價(jià)值，對探針進(jìn)行了不同癌細(xì)胞和人正常細(xì)胞的毒性測試.MTT 全稱為（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽，又稱噻唑藍(lán)，是一種黃顏色的染料.活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT 還原為甲臜并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能.使用MTT 對化合物MITZ 1毒性進(jìn)行檢測，如圖5 所示，在探針濃度為40 μmol·L-1時(shí)，探針MITZ 1對肺癌A549、肝癌SMMC-7721、宮頸癌HeLa、乳腺癌MCF-7 和結(jié)腸癌SW480 的體外腫瘤和人正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B 的體外生長均未達(dá)到半數(shù)抑制活性，毒性都不高.以上實(shí)驗(yàn)表明，探針MITZ 1對癌細(xì)胞和人正常細(xì)胞的毒性較小，因此探針MITZ 1有較好的生物相容性，可以適用于進(jìn)一步的生物體內(nèi)的熒光成像.

圖5 探針MITZ 1 對癌細(xì)胞A549，SMMC-7 721，HeLa，SW480，MCF-7 和人正常細(xì)胞BEAS-2B 的毒性測試圖Fig.5 Toxicity tests of MITZ 1 against cancer cells A549,SMMC-7 721,HeLa,SW480,McF-7 and human normal cells BEAS-2B

2.7 探針MITZ 1 的細(xì)胞成像由于探針對細(xì)胞有較低的毒性作用，隨后對探針進(jìn)行了宮頸癌HeLa 細(xì)胞的共聚焦熒光成像實(shí)驗(yàn)，并同時(shí)進(jìn)行了對于細(xì)胞內(nèi)源性和外源性的心肌黃酶檢測.

內(nèi)源性心肌黃酶處理方法：在4 皿細(xì)胞中分別加入抗氧化劑谷胱甘肽乙基酯，使得其質(zhì)量濃度分別為 1.2，0.8，0.4 mg/mL 和 0，在37 ℃ 恒溫的二氧化碳真空干燥箱中孵育 2 h 后，加入10 μmol·L-1探針MITZ 1母液5 μL 后，繼續(xù)在37 ℃恒溫的二氧化碳真空干燥箱中孵育 2 h.分別加入20 μL 的 DAPI（4′，6-二脒基-苯基吲哚）試劑，恒溫孵育 30 min 后用 PBS 緩沖液清洗干凈，在共聚焦顯微鏡上進(jìn)行細(xì)胞成像.在細(xì)胞內(nèi)源性心肌黃酶成像中，通過抗氧化劑谷胱甘肽乙基酯真空孵育下的HeLa 細(xì)胞呈低氧狀態(tài)，可自身產(chǎn)生一定量的心肌黃酶.

外源性心肌黃酶處理方法：在4 皿細(xì)胞中分別加入等體積探針10 μmol·L-1MITZ 1母液和10 μmol·L-1NADH，使探針在細(xì)胞中的濃度為20 μmol·L-1，加入心肌黃酶使細(xì)胞皿中的酶活力單位分別為2.0，1.0，0.5 U/mL 和0，細(xì)胞在37 ℃恒溫的二氧化碳真空干燥箱中孵育2 h 后，分別加入20 μL的DAPI 試劑，恒溫孵育30 min，用 PBS 緩沖液清洗干凈，在共聚焦顯微鏡上進(jìn)行細(xì)胞成像.

如圖6 所示，加入不同量的抗氧化劑后，探針可以在細(xì)胞內(nèi)呈現(xiàn)明顯梯度性的熒光圖像.由此可以得出，探針MITZ 1可以實(shí)現(xiàn)通過熒光成像的方法檢測細(xì)胞內(nèi)源性的心肌黃酶.

圖6 探針 MITZ 1 (2×10-5 mol/L)在 HeLa 細(xì)胞中的內(nèi)源性心肌黃酶的熒光成像[(1) 為明場(白光)通道，(2) 為探針MITZ 1(紅光)通道，(3) 為DAPI 核染色(藍(lán)光)通道，(4) 為前三個通道的疊加圖，下同]Fig.6 Fluorescence imaging of endogenous diaphorase with MITZ 1 (2×10-5 mol/L) in HeLa cells.(1) is the bright field (white light) channel;(2) is the (red light) channel;(3) is the DAPI nuclear staining (blue light) channel;(4) is the superposition of the first three channels.The same below

如圖7 所示，在細(xì)胞外源性心肌黃酶成像中，加入不同酶活的心肌黃酶后，探針可以在細(xì)胞內(nèi)呈現(xiàn)明顯梯度性的熒光圖像.由此可以得出，探針MITZ 1可以實(shí)現(xiàn)通過熒光成像的方法檢測細(xì)胞外源性的心肌黃酶.

圖7 探針 MITZ 1 （2×10-5 mol/L）在 HeLa 細(xì)胞中的外源性心肌黃酶的熒光成像Fig.7 Fluorescence imaging of exogenous diaphorase with MITZ 1 (2×10-5 mol/L) in HeLa cells

2.8 MITZ 1 的線蟲熒光成像以秀麗隱桿線蟲為生物模型，對探針MITZ 1進(jìn)行生物成像以測試其在生命體中成像的可能性.

測試方法：將瓊脂上的線蟲用M9 溶液清洗處理后分裝在1.5 mL 的離心管中，并加入1 mL PBS緩沖液待用.取3 管線蟲，分別加入心肌黃酶使酶活力單位分別為2，1 U/mL 和 0，在37 ℃恒溫的二氧化碳真空干燥箱中孵育2 h 后，加入10 μmol·L-1探針MITZ 1母液5 μL，使探針在線蟲孵育液中的濃度為20 μmol·L-1，然后繼續(xù)在37 ℃恒溫的二氧化碳真空干燥箱中孵育2 h.用 PBS 緩沖液清洗后，在顯微鏡上進(jìn)行生物成像.

如圖8 所示，秀麗隱桿線蟲經(jīng)過外源性心肌黃酶孵育后，在線蟲體內(nèi)呈現(xiàn)梯度性增加的紅色熒光圖像，顯示出線蟲體內(nèi)心肌黃酶含量梯度性增加，由此可以得出，探針MITZ 1 可以通過熒光成像的方法檢測線蟲體內(nèi)的心肌黃酶的含量變化.

圖8 MITZ 1 （2×10-5 mol/L） 在NADH 存在下，經(jīng)過心肌黃酶孵育的線蟲的活體熒光成像圖Fig.8 Fluorescence imaging of nematodes incubated by diaphorase in the presence of NADH;(a1),(b1) and (c1) were bright field(white) channels,and (a2),(b2) and (c2) were (red) channels

3 結(jié)論

本文設(shè)計(jì)合成了一個基于三甲基醌的近紅外熒光探針MITZ 1.紫外及熒光光譜測試結(jié)果表明，探針MITZ 1通過三甲基氫醌在心肌黃酶作用下被還原，電子轉(zhuǎn)移導(dǎo)致熒光團(tuán)與氫醌結(jié)構(gòu)分離，抑制光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移的過程（F/F0=5），實(shí)現(xiàn)了對心肌黃酶的專一性識別.MITZ 1具有選擇性高、細(xì)胞毒性低（細(xì)胞抑制率低于30%）、檢測限低（0.01 U/mL）等特點(diǎn).基于MITZ 1的優(yōu)秀的光學(xué)及生物學(xué)性質(zhì)，該探針實(shí)現(xiàn)了對HeLa 細(xì)胞及線蟲內(nèi)心肌黃酶的在線監(jiān)測和生物成像.綜上所述，探針MITZ 1具有在復(fù)雜生物體系中識別心肌黃酶的能力，具有腫瘤低氧診斷的潛力.