郭艷紅，晏慧君，張 婷，王其剛，陳 敏，周寧寧，張 顥，邱顯欽

(1.云南大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，云南 昆明 650091；2.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 花卉研究所，云南 昆明 650205；3.國家觀賞園藝工程技術(shù)研究中心，云南 昆明 650205)

月季（Rosa hybrid）屬薔薇科（Rosaceae）薔薇屬（Rosa）植物，是世界四大鮮切花之一，也是中國十大傳統(tǒng)名花之一，享有“花中皇后”的美譽[1].月季作為切花之王，具有良好觀賞價值，同時經(jīng)濟價值也不可小覷.近年來由于過于追求其觀賞性，月季品種被不斷地改良，導(dǎo)致抗病性降低，一旦發(fā)病，傳染速度極快，極易造成巨大的經(jīng)濟損失[2-5].對于月季品種的研究不僅需要篩選出優(yōu)秀的花型、芳香等外在特征，更應(yīng)該注重抗病害等內(nèi)部特征.當(dāng)前對于月季病害的檢測方法較多，例如人工接種鑒定與田間鑒定等，但這些方法時效性差且易受外界環(huán)境影響，嚴(yán)重影響了病害的防治，造成了花農(nóng)巨大損失.研究表明植物對病害抗性的強弱與葉片形態(tài)結(jié)構(gòu)息息相關(guān)，研究者發(fā)現(xiàn)多作物抗病性與葉表皮覆蓋物，氣孔形態(tài)、大小等相關(guān)，但鮮見月季葉片組織結(jié)構(gòu)與花瓣超微結(jié)構(gòu)抗病性研究的相關(guān)報道[6-8].本研究在對薔薇屬種質(zhì)資源抗性早期鑒定的基礎(chǔ)上，以云南昆明的月季病害高抗及易感種質(zhì)為材料，通過測定6 份月季種質(zhì)資源葉片蠟質(zhì)含量，并采用電鏡掃描對其葉片與花瓣組織結(jié)構(gòu)觀察拍照，分析研究月季主要病害抗性與葉片蠟質(zhì)含量、葉片和花瓣超微結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系，篩選出抗病性強的月季種質(zhì)資源，為新品種的選育提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 實驗材料供試的6 份材料定植于云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究所資源花圃內(nèi).其中，4 份為對月季真菌病害高抗的材料，即木香花R.banksiae、金櫻子R.laevigata、無刺野薔薇R.multiflora‘Innermis’和長尖葉薔薇R.longicuspis；2 份為對月季真菌病害易感的材料，即粉紅香水月季R.odoratavar.erubescens和‘月月粉’R.chinensis‘Pallida’[9-10].

1.2 實驗方法

1.2.1 葉片蠟質(zhì)含量測定 葉片蠟質(zhì)含量采用氣相色譜質(zhì)譜（GC-MS）法測定[11].取健康的月季葉片，清水洗凈后，用次氯酸鈉消毒2 min，然后用無菌蒸餾水沖洗4 次，2 次重復(fù)，吸干表面水分.將葉片壓置于10 cm×5 cm 的玻璃板面下，接著放置于EPSONV700 專業(yè)掃描儀中掃描，得到掃描圖像，再利用Image J 軟件計算葉片總表面積.將掃描后的葉片剪成5 cm×5 cm的小段置于已消毒的燒杯中，加入20 mL 氯仿常溫萃取30 s 后，再用10 mL氯仿漂洗2 次，將萃取液轉(zhuǎn)移至氣相色譜質(zhì)譜（GC）樣品瓶后，加入20 μL 左右正二十四烷烴（C24）作為內(nèi)部參照置于通風(fēng)櫥中風(fēng)干，加入體積比為1∶1 的吡啶與雙三甲基硅基三氟乙酰胺（BSTFA），70 ℃恒溫反應(yīng)25 min 后迅速用氮吹儀吹干，加入GC 瓶標(biāo)注上限體積的氯仿溶解，進(jìn)樣進(jìn)行氣相色譜分析[11]，3 次重復(fù).采用以下公式計算單位葉面積的蠟質(zhì)含量：單位葉面積蠟質(zhì)含量（μg/cm2）=蠟質(zhì)總質(zhì)量（μg）/葉片總表面積（cm2）.

1.2.2 葉片的電鏡掃描 冬季，植株進(jìn)入生長減緩期，選擇健康葉片用蒸餾水沖洗，吸干表面水分.然后用潔凈刀片切取約4 mm×4 mm 的葉片，用電導(dǎo)膠粘于樣品臺上，粘貼時觀察面朝上，放入干燥器中干燥5 min 左右，在ETD-2000 型離子濺射儀中鍍金膜3 min，再置于型號為Quanta-200 的掃描電鏡下觀察并拍照，每種材料各統(tǒng)計30 個視野.

1.2.3 花瓣的電鏡掃描 選取花盤展開一致的花蕾，裁剪健康花蕾所在的枝條，將花枝迅速放入清水中，保證水分，保持自然生長狀態(tài).用蒸餾水清洗花瓣，接著吸干表面水分.在距花瓣頂端10 mm和距邊緣5 mm 處切取4 mm×4 mm 小塊，觀察面朝上，用電導(dǎo)膠粘于樣品臺上，在ETD-2000 型離子濺射儀中鍍金膜3 min，然后置于型號為Quanta-200 的掃描電鏡下觀察并拍照，每種材料各統(tǒng)計30 個視野.

2 結(jié)果與分析

2.1 葉表皮蠟質(zhì)含量分析應(yīng)用GC 法測定的各個材料葉片蠟質(zhì)含量結(jié)果如圖1 所示，結(jié)果表明金櫻子的單位葉面積蠟質(zhì)含量最高（2.10 μg/cm2），其次為長尖葉薔薇（2.01 μg/cm2），粉紅香水月季的單位葉面積蠟質(zhì)含量最低（0.68 μg/cm2）.本實驗結(jié)果表明：高抗月季種質(zhì)資源的單位葉面積蠟質(zhì)含量均高于易感月季種質(zhì)資源，且均高于1.0 μg/cm2.

圖1 6 份月季種質(zhì)資源葉片的蠟質(zhì)含量Fig.1 Wax content in leaves of six rose germplasm resources

2.2 葉片正面的超微結(jié)構(gòu)特征6 份月季種質(zhì)資源正面肉眼觀察沒有明顯區(qū)別，葉片正表面平滑，干凈、整潔，葉脈紋絡(luò)清晰，縱橫交織.掃描電鏡結(jié)果如圖2，從圖中可看出葉片正面均無表皮附屬物及氣孔分布，4 份高抗月季種質(zhì)資源密披蠟質(zhì)（圖2A～D），較其它易感月季種質(zhì)資源的蠟質(zhì)更厚（圖2E，F(xiàn)）.高抗材料葉脈排列非常緊密，角質(zhì)層明顯且細(xì)胞間的間隙被填滿；易感材料葉脈排列稀疏，角質(zhì)層排列無規(guī)則且細(xì)胞間的間隙較大.結(jié)果表明高抗材料葉片正面角質(zhì)層及葉脈排列較易感材料緊密.

圖2 6 份月季種質(zhì)資源葉正面掃描電鏡圖Fig.2 Scanning electron microscopy of leaves of six rose germplasm resources

2.3 葉片背面的超微結(jié)構(gòu)特征6 份月季種質(zhì)資源葉背面肉眼觀察沒有明顯區(qū)別，葉背面較葉正面粗糙，葉脈清晰可見，無刺野薔薇可見明顯表皮毛.掃描電鏡結(jié)果如圖3、4 所示，高抗月季種質(zhì)資源木香花、無刺野薔薇均具有明顯表皮毛，無刺野薔薇較木香花表皮毛更密集（圖3A～D）.選取典型的4 份實驗材料，掃描發(fā)現(xiàn)高抗材料氣孔密度小且開度稍開或直接關(guān)閉，氣孔周圍沒有絲狀物，氣孔保衛(wèi)細(xì)胞厚度較厚，蠟質(zhì)連續(xù)覆蓋角質(zhì)層（圖4A，B）；易感材料氣孔密度大且開度幅度大，氣孔周圍有明顯絲狀物，氣孔保衛(wèi)細(xì)胞厚度較薄，蠟質(zhì)破裂嚴(yán)重（圖3E，F(xiàn)；圖4C，D）.結(jié)果表明：高抗材料葉片背面角質(zhì)層及氣孔開合度較易感材料緊密，且表皮毛密.

圖3 6 份月季種質(zhì)資源葉背面掃描電鏡圖Fig.3 Leaf abaxial scanning electron microscopy of six rose germplasm resources

圖4 4 份月季種質(zhì)資源葉背面氣孔掃描電鏡圖Fig.4 Scanning electron microscopy of leave stomatas on the back of four rose germplasm resources

2.4 花瓣正面的超微結(jié)構(gòu)特征肉眼觀察發(fā)現(xiàn)高抗月季種質(zhì)資源的花瓣較易感月季種質(zhì)資源厚實，花瓣聚合成型生長，花瓣與花瓣之間的間隙較小.掃描電鏡結(jié)果如圖5 所示，高抗材料花瓣表皮細(xì)胞排列密集均勻，花瓣上表皮細(xì)胞呈凸?fàn)睿?xì)胞間隙?。▓D5A～D）；易感材料花瓣表皮細(xì)胞排列稀疏，花瓣上表皮細(xì)胞平滑，細(xì)胞間隙大（圖5E，F(xiàn)）.結(jié)果表明高抗材料花瓣表皮細(xì)胞較易感材料排列緊密.

圖5 6 份月季種質(zhì)資源花瓣正面超微結(jié)構(gòu)掃描圖Fig.5 Scanning images of petal frontal ultrastructure of six rose germplasm resources

3 討論

植物與病原菌相互作用會導(dǎo)致病害的產(chǎn)生，當(dāng)植物受到病原菌侵染時，葉片組織結(jié)構(gòu)變化是最常見的發(fā)病現(xiàn)象之一，也是復(fù)雜病理學(xué)過程的結(jié)果和體現(xiàn)[12-13].實驗結(jié)果表明月季抗病性與葉片超微結(jié)構(gòu)具有一定的關(guān)系.植物葉表皮覆蓋的蠟質(zhì)層是植物抵御病原物與外界刺激的第1 道屏障，發(fā)揮著組成型抗性的物理屏障和化學(xué)抑菌效用的同時，還起到了誘導(dǎo)型抗性的作用[14].李海英等[15]發(fā)現(xiàn)不同抗性的灰斑病大豆中，抗病品種的葉片蠟質(zhì)含量顯著高于感病品種的，抗病品種葉片菌絲萌發(fā)的數(shù)量和分支都較感病品種少.本實驗中，高抗材料蠟質(zhì)含量均高于易感材料蠟質(zhì)含量，抗性品種葉片蠟質(zhì)具一定厚度可構(gòu)成抵抗和延遲病菌的一道結(jié)構(gòu)屏障，葉片角質(zhì)層厚，蠟質(zhì)含量高的植物，能使表皮細(xì)胞的結(jié)合變得更緊密，一定程度上防治病蟲害的侵害[16-19].今后研究蠟質(zhì)的含量、質(zhì)量或許能為植物抗病獲得新的突破點.

植物抗病性與氣孔存在一定的關(guān)系，前人研究表明，氣孔是植物預(yù)先形成的抗病性防御體系[20-22].本實驗發(fā)現(xiàn)易感月季種質(zhì)資源氣孔密度大且開度大，高抗月季種質(zhì)資源氣孔密度小且開度小.趙軍等[23]研究表明梨高抗黑星病品種葉表皮氣孔密度明顯小于感病品種，鄭偉等[24]研究發(fā)現(xiàn)白粉病的抗性與蘋果品種葉片氣孔開度大小呈明顯負(fù)相關(guān)關(guān)系，與本研究結(jié)果一致.因此品種抗性強弱的鑒定可以以葉片氣孔密度及開度為初步鑒定指標(biāo)，氣孔密度與抗性呈負(fù)相關(guān)的關(guān)系.葉片表皮毛是植物天然的保護(hù)屏障，柳麗娜等[25]研究發(fā)現(xiàn)茶用菊的抗病品種表皮毛密度普遍大于感病品種.但也有研究表明，表皮毛更有益于菌絲的密集，增加植株感病的風(fēng)險[26].本實驗中高抗月季種質(zhì)資源的表皮毛密度大，猜測對菌絲的侵染起到了物理阻隔的作用，表皮毛與月季抗病性之間的關(guān)系還有待進(jìn)一步驗證.

花瓣是一種變態(tài)葉，目前對于植物抗病性和花瓣結(jié)構(gòu)關(guān)系的研究較少，研究者主要集中于花瓣芳香組分分析等研究[27-28].本研究發(fā)現(xiàn)易感月季種質(zhì)材料與高抗月季種質(zhì)材料相比，易感材料的花瓣表皮細(xì)胞排列稀疏，病菌更易侵染.感染真菌的衰老花瓣會迅速脫落，以降低灰霉病感染果實的概率[29].張純胄等[30]研究發(fā)現(xiàn)及時摘除茄子的花瓣和柱頭，防治灰霉病效果可達(dá)85%以上.陳大倫等[31]發(fā)現(xiàn)在田圃自然鑒定下，無花瓣油菜菌核病染病率明顯低于有花瓣油菜，與之結(jié)果相悖的室內(nèi)鑒定卻發(fā)現(xiàn)，有無花瓣并未導(dǎo)致染病率有明顯區(qū)別.因此，花瓣超微結(jié)構(gòu)與月季抗病性之間的關(guān)系還有待進(jìn)一步的驗證.

植物的抗病性是多種因素綜合作用的結(jié)果[32-33]，本研究在一定程度上闡明了部分高抗與易感月季材料的葉片組織結(jié)構(gòu)特征，結(jié)果表明葉片蠟質(zhì)含量、氣孔密度及開度大小可作為月季病害抗性的參考指標(biāo).今后仍有必要從葉片的切面結(jié)構(gòu)、感染病原菌前后氨基酸及各種酶系轉(zhuǎn)化等方面繼續(xù)探究，進(jìn)一步完善月季種質(zhì)資源結(jié)構(gòu)特征和生理指標(biāo)與抗病性的關(guān)系，為月季抗病性利用提供技術(shù)支撐.